Nota dell'editore: Questo post è di @ronkenett E @david_s del Gruppo KPA . Fa parte di una serie di post chiamati La colonna QbD .
Nel nostro post precedente del blog , abbiamo scritto sull'utilizzo esperimenti progettati sviluppare metodi analitici. Questo post continua la discussione sui metodi analitici e mostra come un nuovo tipo di disegno sperimentale, il Progetto di screening definitivo [1] (DSD), può essere utilizzato per valutare e migliorare i metodi analitici.
Iniziamo con una rapida rassegna dei metodi analitici e un breve riassunto dell'esperimento in esso descritto post precedente del blog , quindi mostrare ciò che si apprende utilizzando un DSD.
Cosa sono i metodi analitici?
I metodi analitici vengono utilizzati per effettuare misurazioni essenziali di prodotti e processi. Tali sistemi di misurazione sono fondamentali nell'industria farmaceutica, dove la comprensione dei requisiti di monitoraggio e controllo del processo è importante per lo sviluppo di metodi analitici validi. I requisiti tipici per la valutazione dei metodi analitici includono:
- Precisione: Questo requisito garantisce che la variabilità del metodo sia solo una piccola percentuale dell'intervallo delle specifiche (limite superiore delle specifiche – limite inferiore delle specifiche).
- Selettività: Ciò determina quali impurità monitorare in ciascuna fase di produzione e specifica metodi di progettazione che discriminano adeguatamente le proporzioni relative di ciascuna impurità.
- Sensibilità: Ciò si riferisce alla necessità di metodi che riflettano accuratamente i cambiamenti importanti nei CQA rispetto ai limiti delle specifiche, il che è essenziale per un controllo efficace del processo.
L'implementazione del QbD nello sviluppo di metodi analitici è tipicamente un processo in quattro fasi che affronta sia la progettazione che il controllo dei metodi [2] . Le fasi sono:
- Intento di progettazione del metodo : Identificare e specificare le prestazioni del metodo analitico.
- Selezione del progetto del metodo : selezionare le condizioni di lavoro del metodo per raggiungere l'intento progettuale.
- Definizione del controllo del metodo : Stabilire e definire controlli appropriati per i componenti che contribuiscono maggiormente alla variabilità delle prestazioni.
- Convalida del controllo del metodo : Dimostrare prestazioni accettabili del metodo con controlli robusti ed efficaci.
Continuiamo qui la discussione su come utilizzare esperimenti progettati statisticamente per ottenere robustezza, iniziata nel nostro precedente post sul blog.
Un caso di studio nello sviluppo di HPLC
Il caso di studio che abbiamo presentato nel nostro post precedente riguarda lo sviluppo di un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). [3] . Il sistema specifico è costituito da un Agilent 1050, con un rilevatore UV a lunghezza d'onda variabile e un integratore modello 3396-A. La tabella 1 elenca i fattori e i relativi livelli utilizzati negli esperimenti progettati per questo caso di studio. L'array sperimentale originale era 2 7-4 Esperimento fattoriale frazionario con tre punti centrali (vedi Tabella 2). I livelli "-1" e "1" corrispondono ai livelli inferiore e superiore elencati nella Tabella 1 e "0" corrisponde al livello nominale. I livelli inferiore e superiore vengono scelti per riflettere la variazione che potrebbe naturalmente verificarsi sull'impostazione nominale durante il normale funzionamento.
Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Table 1. Factors and levels in HPLC experiments.Tabella 1. Fattori e livelli negli esperimenti HPLC. 
Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Table 2. Original Fractional Factorial experimental array for HPLC experiment.Tavolo 2. Array sperimentale fattoriale frazionario originale per l'esperimento HPLC.
L'esperimento fattoriale frazionario (Tabella 2) consiste di 11 esecuzioni che combinano i livelli dei fattori di progettazione in un insieme bilanciato di combinazioni, inclusi tre punti centrali.
Cosa impariamo dall’esperimento fattoriale frazionario?
Nel nostro messaggio precedente , abbiamo analizzato i dati dell'esperimento fattoriale e abbiamo scoperto che l'esperimento ha fornito risposte a diverse domande importanti:
- Quanto è sensibile il metodo alla variazione naturale delle impostazioni di input?
- Quali input hanno l’effetto maggiore sugli output del metodo?
- Ci sono input diversi che dominano la sensibilità delle diverse risposte?
- La variazione trasmessa dalla variazione dei fattori è ampia rispetto alla variazione naturale da un ciclo all'altro?
Tutte le risposte di cui sopra si riferiscono alla nostra capacità di valutare gli effetti della variazione dei fattori quando i fattori si trovano al loro livello nominale. Tuttavia, non affrontano la possibilità di migliorare la robustezza eventualmente spostando l’impostazione nominale verso una meno sensibile alla variazione dei fattori.
Robustezza e nonlinearità
La robustezza ha uno stretto legame con la non linearità. Abbiamo visto questa funzionalità nel post precedente del blog.Lì l'analisi iniziale dell'esperimento fattoriale ha mostrato una chiara mancanza di adattamento, che il team ha attribuito al fattore "gradiente".Abbiamo utilizzato un modello con un termine quadratico per il gradiente e abbiamo scoperto che posizionare il valore nominale vicino alla "valle" della curva risultante potrebbe effettivamente ridurre la quantità di variazione trasmessa. Pertanto, il termine quadratico aggiunto ha fornito informazioni preziose su dove impostare il gradiente per ottenere un metodo robusto.
La presenza di interazioni è un'altra forma di non linearità che ha conseguenze sulla robustezza del metodo. Due fattori hanno un effetto di interazione su una risposta quando la pendenza dell'effetto di uno dei due fattori dipende dall'impostazione dell'altro fattore. In un esperimento di robustezza, la pendenza è un riflesso diretto della sensibilità del metodo. Pertanto, quando c’è un’interazione, in genere possiamo impostare il livello nominale di uno dei fattori a un livello che modera la pendenza del secondo fattore, riducendo così il suo contributo alla variazione trasmessa. Sfruttare le interazioni in questo modo è uno strumento fondamentale negli esperimenti di ingegneria della qualità di Genichi Taguchi [4] .
Come possiamo pianificare l'esperimento per migliorare la robustezza?
L’esperimento fattoriale frazionario che abbiamo analizzato nel post precedente è stato efficace per stimare gli effetti lineari dei fattori – e questo è stato sufficiente per valutare la robustezza.Tuttavia, per migliorare la robustezza, abbiamo bisogno di un progetto sufficientemente ampio da consentirci di stimare sia gli effetti lineari che quelli non lineari.Il primo passo naturale è considerare la stima degli "effetti del secondo ordine", che includono effetti quadratici puri come quello per il gradiente nel nostro post precedente e le interazioni a due fattori.
Esistono tre modi in cui possiamo pensare di ampliare l'esperimento per stimare termini aggiuntivi in un modello delle prestazioni del metodo analitico. Nello specifico, possiamo utilizzare un disegno appropriato per stimare:
- Tutte le interazioni a due fattori e gli effetti quadratici puri.
- Tutte le interazioni a due fattori ma nessuna quadratica pura.
- Tutta quadratica pura ma nessuna interazione.
Esistono progetti efficaci per l'opzione 1, come il composito centrale e i progetti Box-Behnken.Allo stesso modo, le interazioni a due fattori possono essere stimate da disegni fattoriali frazionari a due livelli (opzione 2). Lo svantaggio principale di entrambe queste scelte è che richiedono troppe esecuzioni sperimentali. Con i fattori K nell'esperimento, ci sono K effetti principali, K quadratica pura e K(K-1)/2 interazioni a due fattori. Dobbiamo anche stimare la media complessiva, quindi abbiamo bisogno di almeno 1+K(K+1)/2 esecuzioni per stimare tutti gli effetti principali e le interazioni a due fattori. Se K è piccolo, ciò può essere perfettamente fattibile. Tuttavia, con K=7, come nell'esperimento HPLC, il totale ammonta ad almeno 29 esecuzioni (e almeno 36 per stimare anche la quadratica pura). Questi esperimenti sono circa tre volte più grandi del disegno fattoriale frazionario analizzato nel post precedente e sarebbero troppo costosi da implementare.
Qui consideriamo l'opzione 3, progetti per stimare tutte le quadratiche pure, ma nessuna interazione. Una classe di disegni sperimentali molto utile a questo scopo è quella dei Disegni di Screening Definitivi (DSD). Mostriamo nella sezione successiva come utilizzare un DSD per studiare e migliorare la robustezza di un metodo analitico.
Applicazione di un progetto di screening definitivo
Un progetto di screening definitivo (DSD) per i fattori K richiede 2K+1 analisi se K è pari e 2K+3 se K è dispari (per garantire l'ortogonalità dell'effetto principale). Il progetto deve stimare i termini di regressione 2K+1, quindi questo è pari o vicino al numero minimo di esecuzioni necessarie. In un tale disegno, tutti i fattori vengono gestiti a tre livelli in una disposizione fattoriale, gli effetti principali sono ortogonali e privi di aliasing (parziale o totale) con effetti quadratici ed effetti di interazione a due fattori e nessun effetto di interazione quadratico o bidirezionale è completamente alias con un altro effetto quadratico o di interazione bidirezionale. Con un DSD possiamo stimare tutti gli effetti principali lineari e quadratici.Inoltre, se alcuni fattori dimostrano di avere effetti trascurabili, potremmo essere in grado di stimare alcune interazioni a due fattori. Lo studio HPLC prevedeva sette fattori, quindi un DSD richiede 17 esecuzioni sperimentali (vedere Tabella 3). Per gli studi di robustezza, è importante stimare l’entità della variazione da un’analisi all’altra. Il DSD in questa applicazione ha due gradi di libertà per l'errore, quindi non sono necessarie ulteriori esecuzioni. Se K fosse pari, sarebbe consigliabile aggiungere almeno due esecuzioni per consentire la stima dell'errore. Un modo semplice per farlo è aggiungere più punti centrali al disegno.
Table 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTable 3: Definitive Screening Design with seven factorsTabella 3: Disegno di screening definitivo con sette fattori
Cosa impariamo dall’analisi dei dati sperimentali del DSD?
Come nel post precedente, illustreremo l'analisi esaminando i risultati per la risposta peakHeight nell'applicazione HPLC. In tutto, dividiamo le altezze di picco effettive per 1000 per facilitare la presentazione. Abbiamo proceduto ad adattare un modello ai dati sperimentali del DSD che includa tutti gli effetti principali e gli effetti quadratici puri. L'analisi mostra che l'unico effetto quadratico significativo è quello del Gradiente.Oltre all'effetto quadratico del gradiente abbiamo deciso di mantenere nel modello, come effetti principali lineari: gradiente, temperatura della colonna, lunghezza d'onda di rilevamento e percentuale di trietilammina. Nella Figura 1 mostriamo le stime dei parametri derivanti dall'adattamento di questo modello ridotto alle risposte peakHeight. Tutti i termini sono statisticamente significativi, il R 2 è pari all'87% e la variazione da un'esecuzione all'altra ha una deviazione standard stimata di 2,585.
Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model.Figure 1. Parameter estimates of peakHeight with quadratic model. Figura 1. Stime dei parametri di peakHeight con modello quadratico. Mostriamo un Profiler per il modello quadratico ridotto nella Figura 2, di seguito.
Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments.Figure 2. Profiler of HPLC experiments with reduced quadratic model derived from DSD experiments. Figura 2. Profiler di esperimenti HPLC con modello quadratico ridotto derivato da esperimenti DSD.
Trovare una soluzione solida
Per migliorare la robustezza, dobbiamo identificare gli effetti non lineari. Qui l'unico effetto non lineare è per il gradiente. La Figura 2 ci mostra che la curva di risposta quadratica per il gradiente raggiunge un minimo abbastanza vicino al valore nominale (0 nelle unità codificate della Figura 2). Di conseguenza, impostare il livello nominale del gradiente su quel livello è una buona scelta per la robustezza. Anche gli altri fattori possono essere mantenuti ai valori nominali. Hanno solo effetti quadratici minori, quindi spostarli in altre impostazioni non avrà alcun effetto sulla robustezza del metodo.
Possiamo valutare il livello di variazione, come nel post precedente, assegnando distribuzioni normali ai fattori di input.Come in quel post, utilizziamo l'opzione predefinita in JMP, che assegna a ciascun input una distribuzione normale con deviazione standard di 0,4 (in unità codificate). La Figura 3 mostra i risultati di questa simulazione. La deviazione standard di peakHeight associata alla variazione dei livelli dei fattori è 2,697, molto simile in grandezza alla SD per la variazione da un'analisi all'altra dei dati sperimentali. La stima complessiva del metodo SD è quindi 3.736 (la radice quadrata di 2.697 2 +2.585 2 ).
Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figure 3. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise.Figura 3. Profiler di peakHeight a livelli nominali con rumore aggiunto.
It is instructive to compare the results from analyzing the DSD to those from analyzing the fractional factorial in the previous blog post. Both experiments ended with the conclusion that gradient has a nonlinear effect on peakHeight, and that setting gradient close to its planned nominal level is a good choice for robustness of the analytic method. The fractional factorial was not able to identify gradient as the interesting factor; this happened only after substantial discussion by the experimental team. And even then, there was concern that the decision to attribute all the nonlinearity to the gradient might be completely off the mark. The DSD, on the other hand, with just a few more runs, was able to support a firm conclusion that gradient is the only factor that has a nonlinear effect. There was no need for debate and assumptions; the issue could be determined from the experimental data.
The DSD and the fractional factorial are both able to assess variance from factor uncertainty and both agree that the three factors with the most important contributions are gradient, column temperature and detection wavelength. The DSD identified a fourth factor, the percent of Triethylamine, as playing a significant role.
The DSD, by estimating all the pure quadratic effects, was also able to fully confirm that there would be no direct gain in method robustness by shifting any of the factors to different nominal values. Improvement might still be possible due to two-factor interactions; but as we pointed out, only a much larger experiment could detect those interactions.
Can we still improve method robustness?
The DSD has shown us that changing nominal levels is not a solution. An alternative is to institute tighter control on the process parameters, thereby limiting their natural variation. Moreover, the DSD helps us prioritize the choice of which factors to control. Figures 1 and 3 show us that the strongest linear effect is due to the column temperature. They also show that the strong and nonlinear effect of gradient may be contributing some of the most extreme high values of peakHeight. Thus these two variables appear to be the primary candidates for enhanced control. Figures 4 and 5 use the simulator option with the profiler to see the effect of reducing the natural spread of each of these factors, in turn, by a factor of 2. With enhanced control of the column temperature, the SD related to factor uncertainty drops from 2.697 to 2.550. Reducing the variation of the gradient leads to a much more substantial improvement. The SD drops by about 40%, to 1.667.
Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.Figure 4. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the column temperature.
Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.Figure 5. Profiler of peakHeight at nominal levels with added noise and enhanced control of the gradient.
Summary
Experiments on robustness are an important stage in the development of an analytic method. These experiments intentionally vary process factors that cannot be perfectly controlled about their nominal value. Experiments that are geared to fitting a linear regression model are useful for assessing robustness, but have limited value for improving robustness.
We have shown here how to exploit nonlinear effects to achieve more robust analytic methods. The Definitive Screening Design can be especially useful for such experiments. For a minimal experimental cost, it provides enough data to estimate curvature with respect to each input factor. When curvature is present, we have seen how to exploit it to improve robustness. When curvature has been exploited, we have seen how to use the experimental results to achieve further improvements via tighter control of one or more input factors.
Notes
[1] Jones, B. and Nachtsheim, C. J. (2011) “A Class of Three-Level Designs for Definitive Screening in the Presence of Second-Order Effects” Journal of Quality Technology, 43. 1-15.
[2] Borman, P., Nethercote, P., Chatfield, M., Thompson, D., Truman, K. (2007), Pharmaceutical Technology. http://pharmtech.findpharma.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/The-Application-of-Quality-by-Design-to-Analytical/ArticleStandard/Article/detail/463580
[3] Romero R., Gasquez, D., Sanshez, M., Rodriguez, L. and Bagur, M. (2002), A geometric approach to robustness testing in analytical HPLC, LCGC North America, 20, pp. 72-80, www.chromatographyonline.com.
[4] Steinberg, D.M., Bursztyn, D. (1994). Dispersion effects in robust-design experiments with noise factors, Journal of Quality Technology, 26, 12-20.
