La colonna QbD: metodi della superficie di risposta ed esplorazione sequenzialeNota dell'editore: Questo post è di @ronkenett , @david_s e Benny Yoskovich del Gruppo KPA . Fa parte di una serie di post sul blog chiamati La colonna QbD . Per ulteriori informazioni sugli autori, fare clic sui nomi delle comunità degli autori sopra.
Ron KenettRon KenettRon KenettRon KenettRon Kenett
David SteinbergDavid SteinbergDavid SteinbergDavid Steinberg David Steinberg
Benny YoskovichBenny YoskovichBenny YoskovichBenny Yoskovich Benny Yoskovich
George Box e KB Wilson ha introdotto l’idea della metodologia della superficie di risposta in un famoso articolo [1] nel 1951. Nell’articolo c’erano diverse idee nuove ed estremamente utili:
- Gli esperimenti progettati possono essere un ottimo strumento per ottimizzare sperimentalmente le condizioni.
- Quando il feedback è rapido, ci sono grandi vantaggi nel suddividere lo sforzo sperimentale in una sequenza di esperimenti, piuttosto che cercare di “imparare tutto in una volta”.
- I risultati di un esperimento spesso stimoleranno cambiamenti nella strategia: nuovi fattori potrebbero essere aggiunti, quelli vecchi potrebbero essere eliminati, gli intervalli dei fattori potrebbero spostarsi.
- I risultati potrebbero indicare che è necessario un modello di regressione più complesso per riflettere adeguatamente la relazione tra i fattori e i risultati.
Un tipico studio della superficie di risposta inizia con un esperimento di screening per identificare i fattori più importanti. Per lo screening vengono solitamente utilizzati piccoli piani sperimentali ortogonali e semplici modelli di regressione (vedi ns secondo E terzo post del blog in questa serie). Gli esperimenti successivi dipenderanno dai risultati dell'esperimento di screening. Ad esempio, i fattori che hanno avuto effetti limitati potrebbero essere esclusi da un’ulteriore considerazione. Si potrebbero aggiungere altri fattori. Il team potrebbe decidere di spostare i livelli di alcuni fattori per ottenere risultati migliori per gli attributi critici di qualità (CQA). Se i risultati suggeriscono che un modello di primo ordine non è più adatto ai dati, il team espande il progetto per consentire l’adattamento di un modello di regressione di secondo grado. Box e Wilson hanno proposto il design composito centrale per questo scopo e, fino ad oggi, rimane una scelta popolare.
Come viene utilizzata la metodologia della superficie di risposta in QbD?
Molti studi QbD mirano a determinare condizioni di produzione migliorate e sono in grado di sfruttare i vantaggi della sperimentazione sequenziale. Questi studi possono trarre vantaggio dalla metodologia della superficie di risposta.
Illustriamo l'approccio e alcuni metodi attraverso uno studio riportato da Xu, Khan e Burgess [2] . Il loro obiettivo era utilizzare esperimenti progettati per migliorare il sistema di somministrazione dei farmaci per una classe di molecole utilizzando formulazioni di liposomi. Si prevedeva che tali formulazioni apportassero benefici migliorando la capacità di indirizzare l'attività della molecola nel corpo. Tuttavia, gli sforzi precedenti avevano prodotto metodi che non erano commercialmente validi, principalmente perché un importante attributo critico di qualità (CQA), l’efficienza di incapsulamento, era troppo basso.
Il team sperimentale si è concentrato su tre CQA in questa sequenza di esperimenti: efficienza di incapsulamento (con un obiettivo di almeno il 20%); dimensione delle particelle (con un intervallo target di 100-200 nm); e stabilità allo stoccaggio a 4⁰ C. Hanno inoltre effettuato un'analisi dei rischi per decidere quali fattori di processo studiare, convergendo su un elenco di otto: concentrazione lipidica; concentrazione del farmaco; pressione di estrusione; concentrazione di colesterolo; concentrazione del tampone; tempo di idratazione; tempo di sonicazione; e numero di cicli di congelamento-scongelamento.
Quale disegno è stato utilizzato per lo screening fattoriale?
Il primo esperimento mirava a trovare i fattori più importanti dall'elenco degli otto. Il team voleva un esperimento piccolo ed economico, quindi ha scelto di utilizzare un esperimento di Plackett e Burman (PB) a 12 esecuzioni. Questo è un esperimento ortogonale che può selezionare fino a 11 fattori, ciascuno a due livelli. Come la maggior parte dei progetti PB, il progetto a 12 esecuzioni non alias completamente le interazioni a due fattori con gli effetti principali. A volte questo ha effetti benefici per lo screening, consentendo il rilevamento di un'interazione particolarmente ampia quando ci sono solo due o tre fattori attivi. Il team ha anche aggiunto tre punti centrali, che consentono una stima della variabilità basata sull’errore puro e un controllo sulla necessità di termini quadratici puri.
È facile generare il progetto PB JMP utilizzando la piattaforma Screening Design all'interno DOE . Dopo aver inserito i fattori, selezionare la casella per scegliere da un elenco di disegni ortogonali e il disegno PB a 12 tirature sarà in cima all'elenco, grazie alle sue dimensioni di tiratura economiche.Dopo aver selezionato questo disegno, c'è un'opzione per aggiungere punti centrali.
Il team ha esaminato tre risultati immediati dell'esperimento: efficienza di incapsulamento (EE); dimensione delle particelle; e potenziale zeta. Inoltre, ciascuna formulazione è stata diluita e divisa in campioni per la conservazione, metà a 4⁰C e metà a 37⁰C. Questi campioni sono stati testati a tempi predeterminati (fino a 24 mesi) per verificare la perdita di farmaco attivo durante la conservazione.
Quali sono stati i risultati dell’analisi dei dati?
Le 15 esecuzioni sperimentali avevano EE che variavano dall'8,2% al 36,5%. La Figura 1 mostra un riepilogo dell'analisi dei dati per EE. La concentrazione dei lipidi era chiaramente il fattore più importante: l’aumento della concentrazione dei lipidi portava a un EE più elevato. Anche la concentrazione del farmaco era altamente significativa, con un effetto negativo sull’EE. Nessuno degli altri fattori ha raggiunto la significatività statistica e tutti hanno avuto effetti piuttosto piccoli rispetto a quelli dei due fattori forti. L'adattamento ai dati è stato molto buono. La deviazione standard residua era dello 0,87% (piuttosto piccola rispetto all'intervallo dei risultati EE) e non c'erano prove di mancanza di adattamento.
Figura 1: Effetti dei fattori sull'EE nell'esperimento PB iniziale
L'analisi della dimensione delle particelle si è concentrata sulla dimensione media delle particelle per ciascuna esecuzione sperimentale. Queste medie erano tutte comprese tra 160 e 176 nm, ben all'interno dell'intervallo accettabile. Nessuno dei fattori ha avuto effetti forti sulla dimensione media delle particelle, suggerendo che questo risultato è altamente robusto rispetto alle impostazioni dei fattori nell'esperimento. Anche la dimensione delle particelle varia all'interno delle esecuzioni sperimentali e il team ha misurato la deviazione standard. Le SD erano tutte di 3,1 nm o meno, quindi la dimensione delle particelle era in realtà abbastanza uniforme all'interno delle analisi.
Il potenziale zeta è una misura dell'entità della repulsione/attrazione elettrostatica o di carica tra le particelle ed è noto per influenzare la stabilità. Tutti i processi eseguiti nel progetto PB avevano un potenziale zeta compreso tra 61 e 76. Nessuno dei fattori ha avuto un effetto statisticamente significativo sul risultato.
La Figura 2 mostra il Profiler JMP per le tre risposte immediate. I forti effetti della concentrazione dei lipidi e della concentrazione del farmaco sull'EE sono evidenti nella Figura 2, così come gli effetti deboli di tutti i fattori sia sulla dimensione media delle particelle che sul potenziale zeta.
Il gruppo di studio era preoccupato anche per la stabilità dello stoccaggio. Hanno valutato la stabilità misurando la perdita di farmaco durante un periodo di conservazione di due anni. Per i campioni conservati a 4⁰C non si sono verificate quasi perdite. Pertanto la conservazione a freddo ha portato a un'eccellente stabilità indipendentemente dalle impostazioni del fattore di processo. I campioni conservati a 37⁰C hanno subito perdite di farmaco, con una perdita media del 6,6% dopo sole due settimane di conservazione. Xu et al. non ha presentato i dati sulle perdite. L'analisi riassuntiva contenuta nel loro articolo mostra che il fattore con il maggiore effetto sulla perdita era la concentrazione dei lipidi; l'impostazione elevata di 120 per questo fattore ha portato ad una diminuzione dal 6,6% al 3,4%. L’uso di concentrazioni lipidiche più elevate è stato quindi utile sia per aumentare l’EE che per migliorare la stabilità alla conservazione. Le conclusioni principali dell'analisi di conservazione sono state che è importante conservare a temperature fredde e, una volta fatto ciò, il farmaco rimane stabile fino a due anni, indipendentemente dalle impostazioni dei fattori.
Figura 2: Profiler che mostra gli effetti dei fattori su EE, dimensione delle particelle e potenziale zeta, dal modello degli effetti principali
Possiamo identificare eventuali interazioni?
Abbiamo sottolineato in precedenza che uno dei vantaggi del disegno PB è che, quando ci sono pochi fattori attivi, può essere possibile identificare un’importante interazione a due fattori. Una strategia utile è quella di esaminare tutte le interazioni tra due fattori con effetti principali attivi, utilizzando la regressione graduale per decidere quali interazioni hanno il maggior potere predittivo. L’esperimento sulla somministrazione di farmaci ha trovato solo due fattori attivi, quindi l’interazione tra loro è l’unico candidato. La Figura 3 mostra i risultati dell'adattamento del modello corrispondente. L'interazione è fortemente significativa, molto più di qualsiasi altro degli altri sei effetti principali. Questa è una solida indicazione che ci sono effetti di secondo ordine associati ai due fattori dominanti.
Si noti che le stime dell’effetto principale non cambiano rispetto a quelle della Figura 1 – ciò è dovuto all’ortogonalità del disegno Plackett-Burman. Quando il progetto è proiettato su due fattori, come in questa analisi, ha tre repliche di ciascuna delle quattro combinazioni di tali fattori, quindi l'aggiunta della loro interazione non influisce sull'ortogonalità. Tuttavia, quando vengono inclusi più fattori e/o interazioni, il modello non è più ortogonale e le stime degli effetti cambieranno.
Figura 3: Modello per EE con i principali effetti della concentrazione lipidica, della concentrazione del farmaco e della loro interazione
Come è andato avanti lo studio?
L’esperimento iniziale indicava chiaramente la concentrazione dei lipidi e la concentrazione del farmaco come i due fattori di processo che influenzano l’EE. Il team ha deciso di concentrarsi su questi due parametri nella seconda fase dello studio, mantenendo tutti gli altri fattori a livelli predefiniti. Volevano esplorare la possibilità di curvatura nella relazione, e quindi hanno scelto di utilizzare un disegno composito centrale (CCD), che consente di adattare un modello completo del secondo ordine. Il CCD ha tre tipi di corse sperimentali. Un insieme è un fattoriale a due livelli. Un altro set è costituito da punti centrali. Il terzo set ha “punti assiali”, in cui un fattore è impostato su due livelli estremi e tutti gli altri sono al centro. I livelli estremi possono essere gli stessi utilizzati per i punti fattoriali (nel qual caso il CCD ha fattori a tre livelli) oppure possono essere diversi (nel qual caso i fattori hanno cinque livelli).
Nello studio sulla somministrazione dei farmaci, il team ha utilizzato cinque livelli per ciascun fattore. Quando vengono utilizzati cinque livelli, i punti assiali vengono generalmente impostati su livelli esterni a quelli dei punti fattoriali. Quindi è anche comune estendere la gamma dei fattori. L'intervallo sperimentale per la concentrazione dei lipidi è stato ampliato rispetto a quello utilizzato nell'esperimento PB (30-160 invece di 30-120) e l'intervallo per la concentrazione del farmaco è stato esteso in entrambe le direzioni (0,5-8 invece di 1-5). L'esperimento comprendeva 12 esecuzioni: quattro punti fattoriali, quattro punti assiali (due per ciascun fattore) e quattro punti centrali.
È possibile utilizzare anche altre strategie per potenziare un progetto di screening e adattarlo a un modello di ordine superiore. Quando ci sono più di due o tre fattori attivi, spesso è possibile trovare progetti espansi più piccoli, e quindi più economici, del CCD. Un'opzione utile consiste nell'applicare la piattaforma di progettazione personalizzata in JMP per un modello quadratico completo. Il progetto I-ottimale è una buona scelta in questo caso, con dimensioni ridotte e buona capacità di stimare la funzione di risposta in tutto lo spazio dei fattori.
Quali sono stati i risultati del CCD?
I risultati per l'EE nella seconda fase dello studio erano compresi tra il 9% e il 41%. L'EE basso si è verificato quando la concentrazione dei lipidi aveva il valore basso di 30, corrispondente ai risultati dell'esperimento iniziale. Il CCD è specificamente progettato per consentirci di adattare un modello completo del secondo ordine utilizzando un numero relativamente piccolo di esecuzioni sperimentali. Tale modello include effetti principali lineari e quadratici per ciascuno dei fattori e tutte le interazioni a due fattori. Abbiamo utilizzato JMP per adattare il modello del secondo ordine ai dati dell'esperimento sul sistema di somministrazione dei farmaci tramite il menu Adatta modello. Per costruire gli effetti del modello, scegli i due fattori sperimentali e poi clicca su Macro opzione e scegli Superficie di risposta . La Figura 4 mostra i risultati.
Figura 4: modello del secondo ordine adattato ai dati CCD
I due fattori hanno forti effetti lineari, proprio come nell’esperimento di screening originale. Le figure mostrano stime in scala e, poiché gli intervalli dei fattori erano più ampi nel CCD, i coefficienti si riferiscono alla scala più ampia. La variazione degli intervalli si traduce in coefficienti più grandi nel CCD. Entrambi i fattori hanno anche effetti quadratici puri significativi. L'effetto dell'interazione è simile in grandezza a quello dell'esperimento originale, ma di segno opposto. Ancora una volta, è del tutto possibile che ciò sia correlato al fatto che il modello viene adattato a un intervallo più ampio nello spazio dei fattori. L'effetto di interazione non raggiunge qui la significatività statistica, e ciò è probabilmente dovuto alla piccola dimensione della porzione fattoriale del CCD. In questo esperimento, solo quattro osservazioni contribuiscono a stimare l'interazione; nell'esperimento PB originale, tutte e 12 le osservazioni erano rilevanti.
Il Profiler (nella Figura 5) è molto utile per “combinare” gli effetti lineari e quadratici dei due fattori. Possiamo vedere che per entrambi i fattori, l'effetto dominante è l'effetto lineare. Gli effetti stimati sono monotoni in tutta la regione della sperimentazione. Il Profiler ha entrambi i fattori impostati sui valori ottimali, all'interno dell'intervallo dell'esperimento, con un livello stimato di EE pari a 46,9. Gli effetti quadratici suggeriscono che gli effetti sono più forti a livelli bassi di ciascun fattore che a livelli alti. Pertanto, livelli più elevati di concentrazione lipidica potrebbero produrre un EE ancora più elevato, ma il beneficio marginale sta diminuendo. Concentrazioni di farmaco più basse hanno anche generato un EE più elevato, e in questo caso il guadagno derivante da un’ulteriore riduzione potrebbe essere sostanziale. Naturalmente, dobbiamo sempre stare attenti a estrapolare al di fuori dell’intervallo sperimentale, e qualsiasi proposta di utilizzare impostazioni più estreme dovrebbe essere testata in ulteriori sperimentazioni.
La Figura 6 mostra un diagramma di contorno dei livelli di EE previsti in base al CCD. I valori previsti più alti si ottengono con elevate concentrazioni di lipidi e basse concentrazioni di farmaci. L'utilizzo di elevate concentrazioni di lipidi fornisce buoni valori previsti per l'intera gamma di concentrazioni di farmaci inclusi negli esperimenti.
Figura 5: grafico del profiler per il CCD
Figura 6: diagramma di contorno per l'EE prevista utilizzando il modello del CCD
In che modo il team ha verificato i modelli?
Per testare ulteriormente la validità del modello per prevedere l’EE, il team ha eseguito una serie di ulteriori esperimenti, variando le impostazioni della concentrazione dei lipidi e della concentrazione del farmaco. Ad esempio, concentrazioni di farmaci dell'1% e del 5% sono state abbinate a diverse concentrazioni di lipidi comprese tra il 30% e il 150%. Alcune di queste combinazioni si trovano al confine della regione testata nel CCD. Sono state testate anche numerose altre combinazioni all'interno del dominio del CCD. I risultati hanno mostrato un eccellente accordo tra i nuovi dati e le previsioni basate sul CCD.
Cosa ha concluso la squadra?
Il team di studio ha utilizzato gli esperimenti per ricavare uno spazio di progettazione per lo specifico ingrediente attivo utilizzato in questo progetto. Erano convinti che le conclusioni sarebbero state abbastanza generali e si sarebbero rivelate rilevanti per molti altri agenti idrofili. Pertanto, hanno visto questi esperimenti come il trampolino di lancio per lo sviluppo di procedure efficaci per molti altri contesti. Molto incoraggianti anche i buoni risultati riguardanti la conservazione a bassa temperatura. Hanno dimostrato che il prodotto potrebbe rimanere stabile a basse temperature fino a due anni, senza la necessità di apportare modifiche che complicherebbero e aggiungerebbero costi al processo di produzione.
Il prossimo in questa serie
I prossimi post del blog di questa serie riguarderanno i progetti non lineari, il design a trama divisa e i progetti robusti, nel contesto di QbD.
Riferimenti
[1] Box, G. e Wilson, K. (1951), Sul raggiungimento sperimentale delle condizioni ottimali, Giornale della Royal Statistical Society . Serie B (metodologica), vol. 13, n. 1, pp. 1-45.
[2] Xu, X., Khan, M. e Burgess, D. (2012), Un caso di studio sulla qualità in base alla progettazione (QbD) sui liposomi contenenti API idrofili: II. Screening delle variabili critiche e definizione dello spazio di progettazione su scala di laboratorio, Giornale internazionale di farmaceutica , 423, pp. 543–553.
Un tipico studio della superficie di risposta inizia con un esperimento di screening per identificare i fattori più importanti.
