QbD 專欄：響應曲面方法與順序探索編按：這篇文章是由@龍克內特, @大衛_s和本尼·約斯科維奇的凱帕集團。 它是一系列部落格文章的一部分，稱為QbD 專欄。 有關作者的更多信息，請單擊上面作者的社區名稱。
Ron KenettRon KenettRon KenettRon Kenett羅恩·肯尼特
David SteinbergDavid SteinbergDavid SteinbergDavid Steinberg大衛‧斯坦伯格
Benny YoskovichBenny YoskovichBenny YoskovichBenny Yoskovich本尼·約斯科維奇
喬治·博克斯和 KB 威爾遜在一篇著名文章中介紹了響應曲面法的思想[1] 1951年。 文章中有幾個新穎且非常有用的想法：
- 設計的實驗可以成為實驗最佳化條件的一個很好的工具。
- 當回饋很快時，將實驗工作分解為一系列實驗比試圖「立即學習所有內容」有很大的好處。
- 一項實驗的結果通常會刺激策略的變化：可能會增加新的因素，可能會刪除舊的因素，可能會移動因素範圍。
- 結果可能表明需要更複雜的迴歸模型來充分反映因素與結果之間的關係。
典型的響應曲面研究從篩選實驗開始，以確定最重要的因素。 小型正交實驗計劃和簡單回歸模型通常用於篩選（請參閱我們的第二和第三本系列部落格文章）。 後續實驗將取決於篩選實驗的結果。 例如，影響較小的因素可能會被排除在進一步考慮之外。 可能會添加其他因素。 團隊可能決定改變某些因素的水平，以獲得關鍵品質屬性 (CQA) 的更好結果。 如果結果顯示一階模型不再適合數據，團隊就會擴展設計以允許擬合二階迴歸模型。 為此目的，博克斯和威爾遜提出了中央複合設計，直到今天，它仍然是一個流行的選擇。
QbD 中如何使用響應曲面法？
許多 QbD 研究旨在確定改進的生產條件，並能夠利用順序實驗的優勢。 這些研究可以受益於響應曲面方法。
我們透過 Xu、Khan 和 Burgess 報告的一項研究來說明該方法和一些方法[2] 。 他們的目標是利用設計好的實驗，透過脂質體配方來改良一類分子的藥物傳遞系統。 預計此類製劑將透過提高體內分子活性的靶向能力來帶來益處。 然而，先前的努力所產生的方法在商業上不可行，主要是因為一個重要的關鍵品質屬性（CQA），即封裝效率太低。
實驗團隊在這一系列實驗中重點關注了三個 CQA：封裝效率（目標至少為 20%）；粒徑（目標範圍為100-200 nm）；和 4⁰ C 下的儲存穩定性。 他們還進行了風險分析，以確定要研究哪些過程因素，最終總結出八個因素：脂質濃度；藥物濃度；擠壓壓力；膽固醇濃度；緩衝液濃度；水合時間；超音波處理時間；和凍融循環次數。
使用什麼設計進行因子篩選？
第一個實驗的目的是從八個因素中找出最重要的因素。 團隊想要進行小型、經濟的實驗，因此選擇使用 12 次運行的 Plackett 和 Burman (PB) 實驗。 這是一個正交實驗，最多可以篩選 11 個因素，每個因素有兩個等級。 與大多數 PB 設計一樣，12 次試驗的設計並未完全將兩因子交互作用與主效應混疊。 有時，這對篩選有有益的影響，當只有兩個或三個活性因子時，能夠檢測到特別大的相互作用。 團隊還添加了三個中心點，從而可以對變異性進行純誤差估計，並檢查是否需要純二次項。
很容易產生 PB 設計聯合管理計劃使用篩選設計平台美國能源部。 輸入因子後，選取用於從正交設計清單中進行選擇的框，12 次試驗的 PB 設計由於其經濟的試驗規模而位於清單頂部。選擇此設計後，可以選擇新增中心點。
團隊研究了實驗的三個直接結果：封裝效率（EE）；顆粒大小；和 zeta 電位。 此外，每種配方均經過稀釋並分成樣本儲存，一半在 4⁰ C 下，一半在 37⁰ C 下儲存。 在預定時間（最多 24 個月）測試這些樣本在儲存期間活性藥物的損失。
數據分析的結果是什麼？
15 次實驗的 EE 範圍為 8.2% 至 36.5%。 圖 1 顯示了 EE 資料分析的摘要。 脂質濃度顯然是最重要的因素——增加脂質濃度會導致更高的 EE。 藥物濃度也非常顯著，對 EE 有負面影響。 其他因素均未達到統計顯著性，且與兩個強因素相比，所有因素的影響都非常小。 數據的擬合度非常好。 殘餘標準差為0.87%（與EE結果的範圍相比相當小），且沒有證據顯示不適合。
圖 1：初始 PB 實驗中因素對 EE 的影響
粒徑分析集中於每次實驗的平均粒徑。 這些平均值均在 160 至 176 nm 之間，完全在可接受的範圍內。 這些因素都沒有對平均粒徑產生強烈影響，這表明該結果對於實驗中因素的設定具有高度穩健性。 實驗過程中顆粒大小也有所不同，研究小組測量了標準差。 SD 均為 3.1 nm 或更小，因此運行中的粒徑實際上相當均勻。
Zeta 電位是顆粒間靜電或電荷排斥/吸引力大小的量度，已知會影響穩定性。 PB 設計中運作的所有流程的 zeta 電位都在 61 到 76 之間。 這些因素均對結果沒有統計上的顯著影響。
圖 2 顯示了三個即時回應的 JMP Profiler。 脂質濃度和藥物濃度對 EE 的強烈影響如圖 2 所示，所有因子對平均粒徑和 zeta 電位的影響都很弱。
研究小組也擔心儲存穩定性。 他們透過測量兩年儲存期內的藥物洩漏來評估穩定性。 對於4°C保存的樣品，幾乎沒有洩漏。 因此，無論製程因素設定如何，冷藏都能帶來出色的穩定性。 37°C保存的樣本確實出現了藥物洩漏，僅保存兩週後平均損失了6.6%。 徐等人。沒有提供有關洩漏的數據。 他們文章中的總結分析表明，對滲漏影響最強的因素是脂質濃度；該因子的高設定為 120 導致從 6.6% 下降到 3.4%。 因此，使用較高的脂質濃度有助於增加 EE 和改善儲存穩定性。 儲存分析的主要結論是，在低溫下儲存很重要，完成後，無論因素設定如何，藥物在長達兩年的時間內都可以保持穩定。
圖 2：Profiler 顯示主效果模型對 EE、粒徑和 zeta 電位的影響因素
我們能辨識出任何相互作用嗎？
我們先前指出，PB 設計的優點之一是，當活躍因素很少時，有可能識別出重要的二因素交互作用。 一個有用的策略是查看具有主動主效應的兩個因素之間的所有交互作用，使用逐步迴歸來確定哪些交互作用最具預測能力。 藥物輸送實驗只發現了兩個活性因子，因此它們之間的相互作用是唯一的候選者。 圖 3 顯示了對應模型的擬合結果。 這種交互作用非常顯著，比其他六種主要效應中的任何一種都顯著得多。 這有力地表明存在與兩個主導因素相關的二階效應。
請注意，主效應估計值與圖 1 中的值相比沒有變化 - 這是因為 Plackett-Burman 設計的正交性。 當設計投影到兩個因素時，如本分析所示，它對這些因素的四種組合中的每一種都有三個重複，因此添加它們的相互作用不會影響正交性。 然而，當包含更多因素和/或交互作用時，模型不再是正交的，效果估計將會改變。
圖 3：主要影響脂質濃度、藥物濃度及其交互作用的 EE 模型
研究進度如何？
最初的實驗明確指出脂質濃度和藥物濃度是影響 EE 的兩個過程因素。 團隊決定在研究的第二階段重點關注這兩個參數，將所有其他因素保持在預設水準。 他們想要探索這種關係中曲率的可能性，因此選擇使用中心複合設計（CCD），它可以擬合完整的二階模型。 CCD 有三種類型的實驗運行。 一組是兩階乘。 另一組由中心點組成。 第三組有“軸點”，其中一個因素設置在兩個極端水平，所有其他因素都設置在其中心設置。 極端水平可以與用於階乘點的水平相同（在這種情況下，CCD 具有三個水平的因子），也可以不同（在這種情況下，因子具有五個水平）。
在藥物傳遞研究中，研究小組對每個因素使用了五個水平。 當使用五個水平時，軸點通常設定為階乘點之外的水平。 因此擴大因子的範圍也很常見。 脂質濃度的實驗範圍從PB實驗中使用的範圍向上延伸（30-160而不是30-120），藥物濃度的範圍在兩個方向上延伸（0.5-8而不是1-5）。 實驗包括 12 次運行：四個因子點、四個軸點（每個因子兩個）和四個中心點。
其他策略也可用於增強篩選設計並擬合高階模型。 當有兩個或三個以上的活性因子時，通常可以找到比 CCD 更小的擴展設計，因此更經濟。 一個有用的選擇是應用 JMP 中的自訂設計平台來建立完整的二次模型。 I 最優設計在這裡是一個不錯的選擇，它具有較小的運行規模和良好的能力來估計整個因子空間的響應函數。
CCD的結果是什麼？
研究第二階段的 EE 結果為 9% 至 41%。 當脂質濃度低至 30 時，EE 值較低，這與初始實驗的結果相符。 CCD 專門設計用於讓我們使用相對少量的實驗運行來擬合完整的二階模型。 該模型包括每個因素和所有雙因素交互作用的線性和二次主效應。 我們使用 JMP 透過「擬合模型」選單將二階模型與藥物傳遞系統實驗的數據進行擬合。 若要建立模型效果，請選擇兩個實驗因素，然後按一下宏選項並選擇回應面。 圖 4 顯示了結果。
圖 4：二階模型擬合 CCD 數據
這兩個因素具有很強的線性效應，就像最初的篩選實驗一樣。 這些數字顯示了按比例估計的值，並且由於 CCD 中的因子範圍更寬，因此係數與更寬的比例相關。 範圍的變化導致 CCD 中的係數更大。 這兩個因素也具有顯著的純二次效應。 交互作用的大小與原始實驗相似，但符號相反。 同樣，這很可能與模型被擬合到因子空間中更廣泛的範圍有關。 此處交互效應未達到統計顯著性，這可能是由於 CCD 階乘部分尺寸較小。 在這個實驗中，只有四個觀察值有助於估計交互作用；在最初的 PB 實驗中，所有 12 個觀察值都是相關的。
Profiler（圖 5）對於「組合」兩個因子的線性和二次效應非常有幫助。 我們可以看到，對於這兩個因素，主導效應就是線性效應。 整個實驗區域的估計效果是單調的。 Profiler 將這兩個因素設定為最佳設置，在實驗範圍內，EE 的估計水平等於 46.9。 二次效應表明，每個因素在低水平時的影響比高水準時的影響更強。 因此，較高水平的脂質濃度可能會產生更高的 EE，但邊際效益正在下降。 較低的藥物濃度也會產生較高的 EE，進一步降低的益處可能是巨大的。 當然，我們總是需要小心在實驗範圍之外進行推斷，任何使用更極端設定的建議都應該在進一步的實驗中進行測試。
圖 6 顯示了基於 CCD 的預測 EE 水平的等值線圖。 在高脂質濃度和低藥物濃度下獲得最高預測值。 使用高脂質濃度可以為實驗中包含的整個藥物濃度範圍提供良好的預測值。
圖 5：CCD 的輪廓圖
圖 6：使用 CCD 模型預測 EE 的等值線圖
團隊如何驗證模型？
為了進一步測試預測 EE 模型的有效性，研究小組進行了許多額外的實驗，以改變脂質濃度和藥物濃度的設定。 例如，1% 和 5% 的藥物濃度與 30% 至 150% 範圍內的幾種脂質濃度相符。 其中一些組合位於 CCD 測試區域的邊界。 也測試了 CCD 領域內的許多其他組合。 結果顯示新數據與基於 CCD 的預測非常吻合。
團隊得出了什麼結論？
研究團隊利用實驗得出了該專案中使用的特定活性成分的設計空間。 他們確信這些結論是相當普遍的，並且將證明與許多其他親水劑相關。 因此，他們將這些實驗視為為許多其他設置開發有效程序的跳板。 低溫儲存的良好結果也非常令人鼓舞。 他們表明，該產品可以在低溫下保持穩定長達兩年，而無需進行會使生產過程複雜化並增加成本的調整。
本系列的下一篇
本系列的下一篇部落格文章將涵蓋 QbD 背景下的非線性設計、裂區設計和穩健設計。
參考
[1] Box, G. 與 Wilson, K. (1951)，關於最佳條件的實驗實現，英國皇家統計學會雜誌。 B 系列（方法論），卷。 13，第 1 期，第 1-45 頁。
[2]徐X., Khan, M. 和 Burgess, D. (2012)，關於含有親水 API 的脂質體的品質設計 (QbD) 案例研究：II。 篩選關鍵變數並建立實驗室規模的設計空間，國際藥劑學雜誌，423，第 543–553 頁。
典型的響應曲面研究從篩選實驗開始，以確定最重要的因素。
