La columna QbD: experimentos de trama divididaNota del editor: Esta publicación es de @ronkenett , @david_s y Benny Yoskovich del Grupo KPA . Es parte de una serie de publicaciones de blog llamadas La columna QbD . Para obtener más información sobre los autores, haga clic en los nombres de las comunidades de los autores arriba.
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Los experimentos de parcela dividida son experimentos con factores difíciles de cambiar que son difíciles de aleatorizar y solo se pueden aplicar a nivel de bloque. Una vez que se establece el nivel de un factor difícil de cambiar, podemos realizar experimentos con varios otros factores manteniendo ese nivel fijo.
Para ilustrar la idea, en esta publicación de blog nos referimos a un ejemplo de un experimento de investigación preclínica QbD (Calidad por diseño). Como se menciona en el Primer comentario En esta serie, QbD trata sobre productos, procesos y comprensión clínica. Aquí, nos centramos en obtener comprensión clínica mediante la aplicación de métodos de diseño experimental.
El experimento comparó, en modelos animales, varios métodos para el tratamiento de irritaciones cutáneas crónicas graves. [1] . Cada tratamiento implicó un antibiótico administrado por vía oral junto con una crema que se aplica tópicamente en el sitio afectado. Había dos tipos de antibióticos y la crema se probó en cuatro concentraciones diferentes del ingrediente activo y tres estrategias de sincronización.
El experimento se realizó con cuatro animales de experimentación, cada uno de los cuales tenía ocho sitios ubicados en la espalda desde el cuello hacia abajo. Así, los sitios quedan “bloqueados” por animales. Para cada animal, podemos decidir aleatoriamente qué sitios deben tratarse con qué concentración según la opción de tiempo. Los antibióticos son diferentes. Se toman por vía oral, por lo que cada animal podría recibir solo un antibiótico y luego se aplicaría en todos los sitios de ese animal.
El análisis incluyó una serie de resultados, y los más importantes fueron aquellos que rastrearon el tamaño del área irritada a lo largo del tiempo, como una fracción del tamaño inicial en ese sitio. El CQA (atributo crítico de calidad) principal que resume la mejora a lo largo del tiempo es el área bajo la curva. [2] (AUC), y esa es la respuesta que analizaremos en esta entrada de blog. El AUC es una medida general de la tasa de curación, con valores bajos (altos) cuando la curación es rápida (lenta).
Para obtener más detalles sobre los experimentos de trama dividida, una excelente fuente es el artículo introductorio de Jones y Nachtsheim .
¿Por qué es importante la estructura de trama dividida?
En el estudio de tratamiento con crema tópica, los animales forman bloques experimentales. La razón básica para considerar bloques en el análisis de datos es que esperamos que los resultados de diferentes sitios en el mismo animal sean similares entre sí, pero diferentes de los de sitios en otros animales. Aprovechamos esta propiedad cuando comparamos el tiempo y la concentración. Esas comparaciones se realizan a nivel "dentro de los animales", lo que neutraliza la variación entre animales y, por lo tanto, mejora la precisión. Para los antibióticos, las diferencias entre animales afectarán nuestra comparación. El hecho de que pensemos en cada animal como un bloque significa que esperamos ver tales diferencias. Necesitamos tener esto en cuenta tanto al diseñar el experimento como al analizar los resultados.
¿Qué son tramas completas y subtramas?
Usamos el término “parcelas completas” para referirnos a las unidades a nivel de bloque y “subparcelas” para referirnos a las unidades que están anidadas dentro de cada parcela completa. En el ejemplo anterior, los animales sirven como parcelas completas y los sitios como subparcelas. La terminología se remonta a Sir RA. Fisher, el pionero del diseño estadístico de experimentos.Fisher trabajó en una estación de investigación agrícola en Rothamsted, Reino Unido, a principios del siglo XX. Los experimentos típicos en esta estación implicaron comparar tipos de cultivos, épocas de siembra y programas de riego y fertilización.
Fisher observó que algunos de estos factores podrían aplicarse sólo a grandes parcelas de tierra, mientras que otros podrían aplicarse con una resolución espacial mucho más fina. Entonces, para Fisher, las “parcelas completas” eran las grandes extensiones de tierra, y las “subparcelas” eran las partes pequeñas que componían una parcela completa. Algunos experimentos tienen más de dos de esos niveles. Hoy en día, seguimos usando estos términos, a pesar de que la parcelación dividida afecta a muchos tipos de experimentos, no sólo a las pruebas de campo en agricultura, y las “unidades enteras” y las “subunidades” generalmente no son parcelas de tierra. En el contexto de QbD, consisten en modelos animales, como en el ejemplo aquí utilizado, lotes de material o configuración de procesos de producción.
¿Cuándo ocurre la trama dividida?
Hay muchas fuentes posibles de estructura de trama dividida en un experimento. A veces, como antes, tenemos “mediciones repetidas”, pero en diferentes condiciones, del mismo sujeto experimental. A veces, el experimento involucra varios factores que son difíciles de establecer en diferentes niveles experimentales, como la temperatura de una columna o del biorreactor. En ese caso, es común fijar los factores difíciles de cambiar en un nivel y dejarlos en ese nivel durante varias observaciones consecutivas, en las que los demás factores varían. Esto conduce a un experimento de trama dividida, con una trama completa nueva cada vez que los factores difíciles de cambiar se establecen en nuevos niveles. A veces, un proceso de producción conduce naturalmente a este tipo de anidamiento. Por ejemplo, considere un experimento para mejorar la producción de proteínas para un fármaco biológico. El proceso comienza haciendo crecer células en un medio; luego las células se transfieren a pocillos en una placa donde producen proteínas. Un experimento podría incluir algunos factores que afectan la fase de crecimiento y otros que afectan únicamente la producción de proteínas. Dividir las células en un matraz entre varios pocillos diferentes permite probar los factores de producción a nivel de parcela dividida.
¿Cómo diseño un experimento de parcela dividida?
La herramienta de diseño personalizado en JMP facilita la creación de un diseño de trama dividida. Primero, ingresa los factores en tu experimento. La estructura de parcela dividida se especifica utilizando la columna denominada "Cambios" en la tabla de factores. Las posibles entradas son “fácil”, “difícil” y “muy difícil”, correspondientes a tres niveles de anidamiento entre los factores. Los factores que se pueden asignar en el nivel de observación individual se declaran como “fáciles” (la configuración predeterminada). Los factores que sólo pueden aplicarse a bloques de observaciones se declaran “duros”. Puede haber un tercer nivel que consta de factores que se pueden aplicar sólo a “bloques de bloques”, y estos factores se denominan “muy difíciles”. La Figura 1 muestra la tabla de factores de nuestro experimento. El antibiótico es el factor difícil de cambiar porque se aplica al animal, no a sitios individuales. El tiempo y la concentración son factores numéricos, ya que la empresa deseaba obtener información para comparar todos los niveles considerados, sin necesidad de extrapolar mediante un modelo de regresión. Entonces decidimos declarar todos los factores como categóricos. Tenga en cuenta que una concentración de 0 significa aplicar una crema base sin agregar el compuesto que se está probando. 
Figura 1: Definición de factor para el experimento
El siguiente paso es especificar cualquier restricción especial. Por ejemplo, algunas combinaciones de factores pueden ser imposibles de probar, o puede haber algunas restricciones de desigualdad que limiten el espacio de los factores. Luego debe declarar qué términos del modelo desea estimar, incluidos los efectos e interacciones principales. En nuestro experimento, la empresa quería estimar los principales efectos de los tres factores. Querían información sobre las interacciones de dos factores pero no la consideraban esencial; sin embargo, el experimento es lo suficientemente grande como para permitirnos estimar todos estos términos. Si hubiera menos ejecuciones, podríamos indicar el estado "deseado pero no crucial" haciendo clic en la entrada de estimabilidad para estos términos y eligiendo la opción "si es posible". Ver Figura 2. 
Figura 2: Definición del modelo para el experimento.
Luego se nos pide que especifiquemos el número de parcelas completas, es decir, el número de animales disponibles.Para nuestro estudio, hubo cuatro animales. Finalmente, necesitamos especificar el número de ejecuciones. La herramienta Diseño personalizado recomienda un tamaño de muestra predeterminado, nos indica el tamaño mínimo posible y nos permite especificar un tamaño. En nuestro experimento, fue posible organizar ocho sitios en cada animal, para un total de 32 ejecuciones. Al hacer clic en el botón "Hacer diseño" se genera el diseño que se muestra en la Tabla 1. Hay cuatro parcelas completas y cada antibiótico está asignado a dos de ellas. Hay 12 combinaciones de sincronización y concentración, pero sólo ocho sitios en cada animal. Por lo tanto, es importante elegir de manera eficiente cuál de estas combinaciones de tratamientos se asignará a cada sitio. Además, no existe una solución clásica para este problema de asignación. Este es un entorno en el que el enfoque algorítmico de JMP resulta extremadamente útil. 
Tabla 1: El diseño de 32 corridas para tres factores en cuatro parcelas completas de ocho corridas cada una. El factor “antibiótico” sólo puede aplicarse a nivel de “trama completa”.
El diseño encontrado por JMP utiliza el esquema de tiempo de dos horas para 12 sitios y cada uno de los otros esquemas para 10 sitios. Cada concentración se utiliza ocho veces. Cada opción de sincronización por concentración se utiliza dos o tres veces. (Tenga en cuenta que necesitaríamos 36 ejecuciones para tener la misma repetición de las combinaciones, pero el experimento tiene solo 32 sitios). El diseño incluye automáticamente una columna de Gráficos completos; en nuestro experimento, esto nos dice qué animal se estudia, por lo que cambiamos la nombre de la columna a "Animal".
¿Cómo afecta el poder un experimento de trama dividida?
El análisis de poder en la Tabla 2 es instructivo. Vemos que el poder de los factores de tiempo y concentración es mucho mayor que el del antibiótico. El poder más alto se debe a que podemos comparar niveles de estos factores "dentro de los animales", eliminando así cualquier variabilidad entre animales. En el caso de los antibióticos, por otra parte, la comparación se ve afectada por la variación entre animales, de modo que el tamaño de muestra relevante es en realidad cuatro (el número de animales) y no 32 (el número de sitios). 
Tabla 2: Análisis de potencia para el diseño de 32 corridas
Es importante darse cuenta de que el análisis de poder debe hacer algunas suposiciones. Estos incluyen el tamaño de los efectos de los factores (los coeficientes anticipados) y la magnitud de las varianzas.La entrada de RMSE en la tabla es para la variación de sitio a sitio. También existe una suposición sobre el tamaño de la variación “entre animales” y la variación “dentro de los animales”. La suposición predeterminada es que son aproximadamente del mismo tamaño. Si pensaba que la mayor parte de la variación se daba entre animales, el valor predeterminado debería cambiarse a un número mayor que 1. Para hacerlo, haga clic en el triángulo rojo al lado de Diseño personalizado, seleccione el enlace Opciones avanzadas y luego el enlace Relación de variación de trazado dividido.
¿Cómo analizo un experimento de parcela dividida?
El análisis sigue la misma estructura general que para otros experimentos diseñados; consulte las publicaciones de blog anteriores de esta serie. La principal diferencia es que necesitamos agregar el factor Animal al diseño como un "efecto aleatorio". Es este término de efecto aleatorio el que le dice a JMP que el experimento es de trama dividida. Utilice el enlace Ajustar modelo en Analizar. Si hace esto desde la tabla de diseño, la lista de términos del modelo incluirá automáticamente el efecto aleatorio. Si accede a los datos de manera diferente, deberá agregar Animal a la lista de efectos del modelo y declararlo como un efecto aleatorio resaltando el término y haciendo clic en el triángulo "Atributos" al lado de la lista de términos del modelo. La primera opción es "Efectos aleatorios".
¿Qué pasó en el experimento de irritación de la piel?
Analizamos los resultados en AUC.Las combinaciones de tratamientos eficaces tendrán valores bajos de AUC. La Tabla 3 muestra pruebas que evalúan si los factores tienen efectos significativos. Hay un efecto claro asociado con la concentración (valor p=0,002). El efecto del tiempo tiene un valor p de 0,076, por lo que hay una indicación de un efecto, pero mucho más débil que el de la concentración. La estadística F para comparar los dos antibióticos es mayor que la del momento oportuno. Sin embargo, tiene un valor p de 0,078, cercano al de la sincronización. La razón es que la comparación de antibióticos se realiza a nivel de “trama completa” y, por lo tanto, tiene más incertidumbre y mucho menor poder que las comparaciones de estrategias de tiempo y concentraciones. 
Tabla 3: Pruebas de efectos
Ninguna de las interacciones es fuerte. De modo que la concentración es claramente el factor dominante. La Tabla 4 y la Figura 3 resumen el efecto estimado de la concentración sobre el AUC. Existe una relación clara: una mayor concentración conduce a un AUC más bajo y, por lo tanto, a una curación más rápida. 
Tabla 4: AUC media estimada para las cuatro concentraciones
Figura 3: Gráfico del AUC medio estimado por concentración
El análisis incluye un efecto aleatorio para "Animal", lo que refleja la creencia del equipo de que parte de la variación se encuentra en el nivel "entre animales". La Tabla 5 muestra estimaciones de las variaciones “dentro de los animales” (residuales) y “entre animales”.La columna Componente Var enumera los componentes de varianza estimados: 0,0029 en el nivel "dentro de los animales" y 0,0010 en el nivel "entre animales". La primera columna proporciona la varianza entre animales como una fracción de la varianza "dentro de los animales", estimada en aproximadamente 0,34 para nuestro experimento. 
Tabla 5: Los componentes de la varianza estimada
¿Cuáles son los mensajes finales?
El estudio de la crema tópica proporcionó información valiosa de que la crema es más eficaz en concentraciones más altas. El uso de múltiples sitios por animal permitió comparaciones "dentro de los animales" de las concentraciones y el momento, de modo que el efecto positivo del aumento de la concentración podría descubrirse con un pequeño número de animales. La variación "entre animales" fue sólo aproximadamente 1/3 tan grande como la "variación dentro de los animales". Esto fue una sorpresa, ya que esperábamos que hubiera una variación sustancial entre animales. Por supuesto, la estimación de la variación entre animales se basa en una muestra muy pequeña y, por lo tanto, bastante variable, por lo que seguiremos teniendo cuidado de tener en cuenta la estructura de parcelas divididas en experimentos futuros como este. En consecuencia, los factores que deben administrarse por animal, y no por lugar, sólo serán detectables si tienen efectos muy fuertes o si se aumenta el número de animales.
Próximas atracciones
La próxima publicación de esta serie analizará la aplicación de QbD para diseñar métodos analíticos utilizando diseños factoriales fraccionarios y de cribado definitivo.
Referencias
[1] Para obtener más información sobre las pruebas de agentes dermatológicos tópicos, consulte el documento "Guía para la industria" de la FDA en http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/00/backgrd/3661b1c.pdf [2] En el ejemplo, utilizamos datos normalizados a [0,1] después de dividirlos todos por el AUC más grande. [3] Jones, B. y Nachtsheim, C. (2009). Diseños de trama dividida: qué, por qué y cómo, Journal of Quality Technology, 41(4), págs. 340-361.
Los experimentos de parcela dividida son experimentos con factores difíciles de cambiar que son difíciles de aleatorizar y solo se pueden aplicar a nivel de bloque.
