La colonna QbD: esperimenti con diagramma divisoNota dell'editore: Questo post è di @ronkenett , @david_s e Benny Yoskovich del Gruppo KPA . Fa parte di una serie di post sul blog chiamati La colonna QbD . Per ulteriori informazioni sugli autori, fare clic sui nomi delle comunità degli autori sopra.
Ron KenettRon KenettRon KenettRon KenettRon Kenett
David SteinbergDavid SteinbergDavid SteinbergDavid Steinberg David Steinberg
Benny YoskovichBenny YoskovichBenny YoskovichBenny Yoskovich Benny Yoskovich
Gli esperimenti a trama divisa lo sono esperimenti con fattori difficili da modificare, difficili da randomizzare e che possono essere applicati solo a livello di blocco. Una volta impostato il livello di un fattore difficile da modificare, possiamo eseguire esperimenti con diversi altri fattori mantenendo fisso quel livello.
Per illustrare l'idea, in questo post del blog facciamo riferimento a un esempio tratto da un esperimento di ricerca preclinica QbD (Quality by Design). Come accennato nel primo post in questa serie, QbD riguarda il prodotto, il processo e la comprensione clinica. Qui, ci concentriamo sulla comprensione clinica applicando metodi di progettazione sperimentale.
L'esperimento ha confrontato, su modelli animali, diversi metodi per il trattamento di gravi irritazioni cutanee croniche [1] . Ogni trattamento prevedeva un antibiotico somministrato per via orale insieme a una crema applicata localmente sul sito interessato. C'erano due tipi di antibiotici e la crema è stata testata con quattro diverse concentrazioni del principio attivo e tre strategie temporali.
L'esperimento è stato condotto utilizzando quattro animali da esperimento, ciascuno dei quali aveva otto siti situati sulla schiena dal collo in giù. Pertanto, i siti vengono “bloccati” dagli animali. Per ciascun animale, possiamo decidere in modo casuale quali siti dovrebbero essere trattati con quale concentrazione in base all'opzione temporale. Gli antibiotici sono diversi. Vengono assunti per via orale, quindi ogni animale potrebbe ricevere un solo antibiotico e poi applicarlo a tutti i siti di quell'animale.
L’analisi ha incluso una serie di risultati e i più importanti sono stati quelli che hanno monitorato la dimensione dell’area irritata nel tempo, come una frazione della dimensione iniziale in quel sito. Il CQA (Critical Quality Attribute) primario che riassume il miglioramento nel tempo è l’area sotto la curva [2] (AUC), e questa è la risposta che analizzeremo in questo post del blog. L'AUC è una misura complessiva della velocità di guarigione, con valori bassi (alti) quando la guarigione è rapida (lenta).
Per maggiori dettagli sugli esperimenti a trama divisa, un'ottima fonte è il documento introduttivo di Jones e Nachtsheim .
Perché la struttura a trama divisa è importante?
Nello studio sul trattamento topico con crema, gli animali formano blocchi sperimentali. La ragione fondamentale per considerare i blocchi nell'analisi dei dati è che ci aspettiamo che i risultati provenienti da siti diversi sullo stesso animale siano simili tra loro, ma diversi da quelli per siti su altri animali. Approfittiamo di questa proprietà quando confrontiamo tempismo e concentrazione. Questi confronti sono a livello “all’interno dell’animale”, il che neutralizza la variazione interanimale e quindi migliora la precisione. Per gli antibiotici, le differenze tra gli animali influenzeranno il nostro confronto. Il fatto che pensiamo a ciascun animale come a un blocco significa che ci aspettiamo di vedere tali differenze. Dobbiamo tenerne conto sia nella progettazione dell’esperimento che nell’analisi dei risultati.
Cosa sono le intere trame e le sottotrame?
Usiamo il termine “interi appezzamenti” per riferirci alle unità a livello di blocco e “sottoappezzamenti” per riferirci alle unità annidate all’interno di ogni intero appezzamento. Nell'esempio sopra, gli animali fungono da interi appezzamenti e i siti come sottoappezzamenti. La terminologia risale a Sir RA Fisher, il pioniere della progettazione statistica degli esperimenti.Fisher ha lavorato in una stazione di ricerca agricola a Rothamsted, nel Regno Unito, all'inizio del XX secolo. Esperimenti tipici in questa stazione prevedevano il confronto di tipi di colture, tempi di semina e programmi di irrigazione e fertilizzazione.
Fisher osservò che alcuni di questi fattori potevano essere applicati solo a grandi appezzamenti di terreno, mentre altri potevano essere applicati con una risoluzione spaziale molto più fine. Quindi “interi appezzamenti” per Fisher erano i grandi appezzamenti di terreno, e “sottoappezzamenti” erano i piccoli pezzi che costituivano un intero appezzamento. Alcuni esperimenti hanno più di due di questi livelli. Al giorno d’oggi continuiamo a usare questi termini, anche se lo split-plotting riguarda molti tipi di esperimenti, non solo le prove sul campo in agricoltura, e le “unità intere” e le “sottounità” di solito non sono appezzamenti di terreno. Nel contesto QbD, sono costituiti da modelli animali, come nell'esempio qui utilizzato, lotti di materiale o impostazione di processi di produzione.
Quando si verifica lo split-plotting?
Esistono molte possibili fonti di struttura a trama divisa in un esperimento. A volte, come sopra, abbiamo “misure ripetute”, ma in condizioni diverse, dello stesso soggetto sperimentale. A volte l'esperimento coinvolge diversi fattori difficili da impostare a diversi livelli sperimentali, come la temperatura della colonna o del bioreattore. In tal caso, è normale impostare i fattori difficili da modificare a un livello e lasciarli a quel livello per diverse osservazioni consecutive, in cui gli altri fattori vengono variati. Ciò porta a un esperimento a trama divisa, con un nuovo intero grafico ogni volta che i fattori difficili da modificare vengono impostati su nuovi livelli. A volte un processo di produzione porta naturalmente a questo tipo di nidificazione. Consideriamo ad esempio un esperimento per migliorare la produzione di proteine per un farmaco biologico. Il processo inizia facendo crescere le cellule in un mezzo; quindi le cellule vengono trasferite nei pozzetti di una piastra dove producono proteine. Un esperimento potrebbe includere alcuni fattori che influenzano la fase di crescita e altri che influenzano solo la produzione di proteine. La divisione delle cellule in un pallone tra diversi pozzetti rende possibile testare i fattori di produzione a livello di diagramma diviso.
Come si progetta un esperimento a trama divisa?
Lo strumento di progettazione personalizzata in JMP semplifica la creazione di un disegno a trama divisa. Innanzitutto, inserisci i fattori nel tuo esperimento. La struttura del grafico suddiviso viene specificata utilizzando la colonna denominata "Modifiche" nella tabella dei fattori. Le voci possibili sono “facile”, “difficile” e “molto difficile”, corrispondenti a tre livelli di annidamento tra i fattori. I fattori che possono essere assegnati a livello di osservazione individuale sono dichiarati “facili” (l'impostazione predefinita). I fattori che possono essere applicati solo a blocchi di osservazioni sono dichiarati “difficili”. Potrebbe esserci un terzo livello costituito da fattori che possono essere applicati solo a “blocchi di blocchi” e questi fattori sono etichettati come “molto difficili”. La Figura 1 mostra la tabella dei fattori per il nostro esperimento. L'antibiotico è il fattore difficile da modificare perché viene applicato all'animale, non ai singoli siti. Tempistica e concentrazione sono fattori numerici, poiché l'azienda desiderava ottenere informazioni per confrontare tutti i livelli considerati, senza la necessità di estrapolare mediante un modello di regressione. Quindi abbiamo deciso di dichiarare tutti i fattori come categorici. Si noti che una concentrazione pari a 0 significa applicare una crema base senza aggiunta del composto in esame. 
Figura 1: definizione del fattore per l'esperimento
Il passaggio successivo consiste nel specificare eventuali vincoli speciali. Ad esempio, alcune combinazioni di fattori potrebbero essere impossibili da testare oppure potrebbero esserci alcuni vincoli di disuguaglianza che limitano lo spazio dei fattori. Successivamente è necessario dichiarare quali termini del modello si desidera stimare, inclusi gli effetti principali e le interazioni. Nel nostro esperimento, l’azienda ha voluto stimare gli effetti principali dei tre fattori. Volevano informazioni sulle interazioni tra due fattori ma non le consideravano essenziali; tuttavia, l'esperimento è abbastanza ampio da permetterci di stimare tutti questi termini. Se ci fossero meno esecuzioni, potremmo indicare lo stato “desiderato ma non cruciale” cliccando sulla voce di stimabilità per questi termini e scegliendo l’opzione “se possibile”. Vedere la Figura 2. 
Figura 2: definizione del modello per l'esperimento
Successivamente ci viene chiesto di specificare il numero di interi appezzamenti, cioè il numero di animali disponibili.Per il nostro studio c'erano quattro animali. Infine, dobbiamo specificare il numero di esecuzioni. Lo strumento di progettazione personalizzata consiglia una dimensione del campione predefinita, ci indica la dimensione minima possibile e ci consente di specificare una dimensione. Nel nostro esperimento è stato possibile allestire otto siti su ciascun animale, per un totale di 32 esecuzioni. Facendo clic sul pulsante "Crea disegno" si genera il disegno mostrato nella Tabella 1. Ci sono quattro interi appezzamenti con ciascun antibiotico assegnato a due di essi. Esistono 12 combinazioni di tempi e concentrazione, ma solo otto siti su ciascun animale. Pertanto è importante fare una scelta efficace su quale di queste combinazioni di trattamento verrà assegnata a ciascun sito. Inoltre, non esiste una soluzione da manuale per questo problema di allocazione. Si tratta di un'impostazione in cui l'approccio algoritmico di JMP è estremamente utile. 
Tabella 1: Il disegno a 32 analisi per tre fattori in quattro interi grafici di otto analisi ciascuno. Il fattore “antibiotico” può essere applicato solo a livello di “intero appezzamento”.
Il progetto trovato da JMP utilizza lo schema temporale di due ore per 12 siti e ciascuno degli altri schemi per 10 siti. Ciascuna concentrazione viene utilizzata otto volte. Ciascuna opzione di temporizzazione per concentrazione viene utilizzata due o tre volte. (Nota che avremmo bisogno di 36 esecuzioni per avere la stessa ripetizione delle combinazioni, ma l'esperimento ha solo 32 siti.) Il progetto include automaticamente una colonna Whole Plots: nel nostro esperimento, questo ci dice quale animale è studiato, quindi abbiamo cambiato la colonna nome della colonna in "Animale".
In che modo un esperimento a trama divisa influisce sulla potenza?
L'analisi della potenza nella Tabella 2 è istruttiva. Vediamo che la potenza dei fattori temporali e di concentrazione è molto più elevata rispetto a quella dell'antibiotico. La potenza più elevata è dovuta al fatto che siamo in grado di confrontare i livelli di questi fattori “all’interno dell’animale”, eliminando così qualsiasi variabilità tra gli animali. Per gli antibiotici, invece, il confronto è influenzato dalla variazione tra animali, per cui la dimensione del campione rilevante è in realtà quattro (il numero di animali) e non 32 (il numero di siti). 
Tabella 2: Analisi della potenza per il progetto a 32 esecuzioni
È importante rendersi conto che l’analisi del potere deve fare alcune ipotesi. Questi includono la dimensione degli effetti dei fattori (i coefficienti previsti) e l’entità delle varianze.La voce RMSE nella tabella riguarda la variazione da sito a sito. Esiste anche un'ipotesi sulla dimensione della variazione “tra animali” rispetto alla variazione “all'interno degli animali”. Il presupposto predefinito è che abbiano più o meno la stessa dimensione. Se pensavi che la maggior parte della variazione fosse tra animali, il valore predefinito dovrebbe essere modificato in un numero maggiore di 1. Per fare ciò, fai clic sul triangolo rosso accanto a Design personalizzato, seleziona il collegamento Opzioni avanzate, quindi il collegamento Rapporto varianza grafico diviso.
Come si analizza un esperimento a trama divisa?
L'analisi segue la stessa struttura generale degli altri esperimenti progettati; vedere i post precedenti del blog in questa serie. La differenza principale è che dobbiamo aggiungere il fattore Animale al disegno come “effetto casuale”. È questo termine di effetto casuale che indica a JMP che l'esperimento è a trama divisa. Utilizzare il collegamento Adatta modello in Analizza. Se si esegue questa operazione dalla tabella dati, l'elenco dei termini del modello includerà automaticamente l'effetto casuale. Se accedi ai dati in modo diverso, dovrai aggiungere Animale all'elenco degli effetti del modello e dichiararlo come effetto casuale evidenziando il termine e facendo clic sul triangolo "Attributi" accanto all'elenco dei termini del modello. La prima opzione è "Effetti casuali".
Cosa è successo nell'esperimento sull'irritazione della pelle?
Analizziamo i risultati sull'AUC.Combinazioni terapeutiche efficaci avranno valori bassi di AUC. La tabella 3 mostra i test che valutano se i fattori hanno effetti significativi. C'è un chiaro effetto associato alla concentrazione (valore p = 0,002). L'effetto per la tempistica ha un valore p di 0,076, quindi c'è un'indicazione di un effetto, ma molto più debole che per la concentrazione. La statistica F per il confronto dei due antibiotici è maggiore di quella per i tempi. Tuttavia, ha un valore p di 0,078, vicino a quello relativo al timing. Il motivo è che il confronto degli antibiotici è a livello dell’“intero grafico” e quindi presenta maggiore incertezza e potenza molto inferiore rispetto ai confronti di strategie temporali e concentrazioni. 
Tabella 3: test sugli effetti
Nessuna delle interazioni è forte. Quindi la concentrazione è chiaramente il fattore dominante. La Tabella 4 e la Figura 3 riassumono l'effetto stimato della concentrazione sull'AUC. Esiste una relazione chiara, con una concentrazione più elevata che porta a una AUC inferiore e quindi a una guarigione più rapida. 
Tabella 4: AUC media stimata per le quattro concentrazioni
Figura 3: grafico dell'AUC media stimata per concentrazione
L'analisi include un effetto casuale per “Animale”, riflettendo la convinzione del team che parte della variazione sia a livello “inter-animale”. La tabella 5 mostra le stime delle varianze “all’interno dell’animale” (residuo) e “tra animali”.La colonna Componente Var elenca le componenti della varianza stimate: 0,0029 a livello “entro animali” e 0,0010 a livello “tra animali”. La prima colonna fornisce la varianza tra animali come frazione della varianza “all’interno degli animali”, stimata pari a circa 0,34 per il nostro esperimento. 
Tabella 5: I componenti della varianza stimati
Quali sono i messaggi da portare a casa?
Lo studio sulla crema topica ha fornito preziose informazioni sul fatto che la crema è più efficace a concentrazioni più elevate. L'uso di più siti per animale ha consentito confronti "all'interno dell'animale" delle concentrazioni e dei tempi, in modo che l'effetto positivo dell'aumento della concentrazione potesse essere scoperto con un piccolo numero di animali. La variazione “tra animali” era solo circa 1/3 della variazione “all’interno degli animali”. Questa è stata una sorpresa, poiché ci aspettavamo che ci sarebbero state sostanziali variazioni tra gli animali. Naturalmente, la stima della variazione interanimale si basa su un campione molto piccolo, e quindi piuttosto variabile, quindi staremo comunque attenti a tenere conto della struttura a trama divisa in esperimenti futuri come questo. Di conseguenza, i fattori che devono essere somministrati per animale, piuttosto che per sito, saranno rilevabili solo se hanno effetti molto forti o se il numero di animali aumenta.
Prossime attrazioni
Il prossimo post di questa serie esaminerà l'applicazione di QbD per progettare metodi analitici utilizzando disegni fattoriali frazionari e screening definitivi.
Riferimenti
[1] Per ulteriori informazioni sui test sugli agenti dermatologici topici, consultare il documento "Guidance for Industry" della FDA all'indirizzo http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/00/backgrd/3661b1c.pdf [2] Nell'esempio, utilizziamo i dati normalizzati su [0,1] dopo aver diviso tutto per l'AUC più grande. [3] Jones, B. e Nachtsheim, C. (2009). Disegni a trama divisa: cosa, perché e come, Journal of Quality Technology, 41(4), pp. 340-361.
Gli esperimenti a trama divisa lo sono esperimenti con fattori difficili da modificare, difficili da randomizzare e che possono essere applicati solo a livello di blocco.
