QbD 專欄：裂區實驗編按：這篇文章是由@龍克內特, @大衛_s和本尼·約斯科維奇的凱帕集團。 它是一系列部落格文章的一部分，稱為QbD 專欄。 有關作者的更多信息，請單擊上面作者的社區名稱。
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裂區實驗是實驗具有難以改變的因素，難以隨機化並且只能在區塊層級應用。 一旦設定了難以改變的因素的水平，我們就可以用其他幾個因素進行實驗，以保持該水平固定。
為了說明這個想法，我們在這篇文章中引用了臨床前研究 QbD（品質源自設計）實驗的範例。 正如在第一篇文章在本系列中，QbD 涉及產品、流程和臨床理解。 在這裡，我們專注於透過應用實驗設計方法來獲得臨床理解。
實驗在動物模型上比較了幾種治療嚴重慢性皮膚刺激的方法[1] 。 每次治療都需要口服抗生素以及局部塗抹在受影響部位的乳膏。 有兩種類型的抗生素，並在四種不同濃度的活性成分和三種計時策略下對乳膏進行了測試。
實驗使用四隻實驗動物進行，每隻動物的背部從頸部以下有八個部位。 因此，這些地點被動物「封鎖」。 對於每隻動物，我們可以透過時間選項隨機決定哪些部位應該用哪種濃度來處理。 抗生素不同。 它們是口服的，因此每隻動物只能獲得一種抗生素，然後它將適用於該動物的所有部位。
該分析包括許多結果，最重要的是那些隨著時間的推移追蹤受刺激區域的大小的結果，作為該部位初始大小的一部分。 總結隨時間推移的改進的主要 CQA（關鍵品質屬性）是曲線下面積[2] （AUC），這就是我們將在本部落格文章中分析的回應。 AUC 是癒合率的整體衡量標準，當癒合快（慢）時，其值低（高）。
有關裂區實驗的更多詳細信息，一個很好的來源是Jones 和 Nachtsheim 的介紹論文。
為什麼裂區結構很重要？
在局部乳膏治療研究中，動物組成實驗組。 在數據分析中考慮區塊的基本原因是，我們期望同一動物不同部位的結果彼此相似，但與其他動物部位的結果不同。 當我們比較時間和濃度時，我們利用了這個特性。 這些比較是在「動物內部」層級進行的，這抵消了動物間的差異，從而提高了精確度。 對於抗生素來說，動物之間的差異會影響我們的比較。 事實上，我們將每隻動物視為一個整體，這意味著我們確實希望看到這種差異。 我們在設計實驗和分析結果時都需要考慮到這一點。
什麼是整體情節和次要情節？
我們使用術語「整體圖」來指稱區塊級單元，使用「子圖」來指稱嵌套在每個整體圖內的單元。 在上面的例子中，動物作為整個地塊，地點作為子地塊。 這個術語可以追溯到 RA 爵士 費雪，實驗統計設計的先驅。20 世紀初，費雪在英國洛桑的農業研究站工作。 該站的典型實驗包括比較農作物類型、種植時間以及灌溉和施肥時間表。
費雪觀察到，其中一些因素只能應用於大片土地，而其他因素則可以在更精細的空間解析度下應用。 因此，對費雪來說，「整塊地」是指大塊土地，「子地塊」是指構成整塊土地的小塊土地。 有些實驗有兩個以上的這樣的水平。 如今，我們繼續使用這些術語，儘管裂區影響了多種實驗，而不僅僅是農業田間試驗，而且「整體單元」和「子單元」通常不是土地。 在 QbD 背景下，它們由動物模型（如此處使用的範例）、材料批次或生產流程設定組成。
分裂圖何時發生？
實驗中裂區結構的可能來源有很多。 有時，如上所述，我們會對同一實驗對象進行“重複測量”，但在不同的條件下。 有時，實驗涉及多個難以設定為不同實驗水平的因素，例如色譜柱或生物反應器溫度。 在這種情況下，通常將難以改變的因素設定為一個水平，並在多次連續觀察中將其保留在該水平，其中其他因素發生變化。 這導致了裂區實驗，每次將難以改變的因子設定為新水平時都會有一個新的整體圖。 有時，生產過程自然會導致這種嵌套。 例如，考慮一項提高生物藥物蛋白質產量的實驗。 該過程首先是在培養基中培養細胞；然後將細胞轉移到培養板的孔中，在那裡它們產生蛋白質。 實驗可能包括一些影響生長期的因素和其他僅影響蛋白質生產的因素。 將燒瓶中的細胞分到幾個不同的孔中可以在裂區層級上測試生產因子。
如何設計裂區實驗？
客製化設計工具聯合管理計劃可以輕鬆創建裂區設計。 首先，輸入實驗中的因素。 裂區結構是使用因子表中標記為「Changes」的欄位指定的。 可能的條目有“容易”、“困難”和“非常困難”，對應於因素之間的三個嵌套層級。 可以在單一觀察層級分配的因素被聲明為「簡單」（預設）。 只能應用於觀察塊的因素被聲明為“困難”。可能存在第三個級別，由只能應用於“塊的塊”的因素組成，並且這些因素被標記為“非常難”。圖 1 顯示了我們實驗的因子表。 抗生素是難以改變的因素，因為它適用於動物，而不是個別部位。 時間和濃度是數值因素，因為該公司希望獲得用於比較所考慮的所有水平的信息，而不需要通過回歸模型進行推斷。 因此，我們決定將所有因素都宣告為絕對因素。 請注意，濃度 0 表示使用基礎霜時不添加所測試的化合物。 
圖 1：實驗的因子定義
下一步是指定任何特殊約束。 例如，某些因子組合可能無法測試，或者可能存在一些限制因子空間的不等式限制。 然後，您需要聲明要估計哪些模型項，包括主效果和交互作用。 在我們的實驗中，該公司想要估計這三個因素的主要影響。 他們想要有關兩因素相互作用的信息，但認為這並不重要；然而，這個實驗足夠大，足以讓我們估計所有這些項目。 如果運行次數較少，我們可以透過點擊這些術語的可估計性條目並選擇「如果可能」選項來指示「所需但不重要」狀態。 參見圖 2。 
圖 2：實驗的模型定義
然後要我們指定整塊地塊的數量，即可使用動物的數量。在我們的研究中，有四種動物。 最後，我們需要指定運行次數。 客製化設計工具建議預設樣本大小，告訴我們可能的最小大小並允許我們指定大小。 在我們的實驗中，可以在每隻動物身上設定 8 個位點，總共 32 次運行。 按一下「Make Design」按鈕產生表 1 所示的設計。 有四個完整的地塊，每種抗生素分配給其中的兩個。 有 12 種時間和濃度的組合，但每隻動物只有 8 個部位。 因此，有效選擇將哪些治療組合分配給每個地點非常重要。 而且，這個分配問題沒有教科書上的解決方案。 在這種情況下，JMP 中的演算法方法非常有用。 
表 1：四個完整地塊中三個因素的 32 個試驗設計，每個試驗區有 8 個試驗。 「抗生素」這個因素只能在「整個地塊」層面上應用。
JMP 發現的設計對 12 個站點使用兩小時時間方案，對 10 個站點使用其他方案。 每個濃度使用八次。 每個濃度計時選項可使用兩次或三次。 （請注意，我們需要36 次運行才能獲得相同的組合重複，但實驗只有32 個位點。）設計自動包含「整體圖」列- 在我們的實驗中，這告訴我們研究的是哪種動物，因此我們更改了該列的名稱為“動物”。
裂區實驗如何影響效能？
表 2 中的功耗分析具有指導意義。 我們發現時間和濃度因素的功效遠高於抗生素。 功效較高是因為我們能夠比較「動物體內」這些因素的水平，從而消除動物之間的任何差異。 另一方面，對於抗生素，比較受到動物之間差異的影響，因此相關樣本量實際上是 4（動物數量）而不是 32（站點數量）。 
表 2：32 次運行設計的功耗分析
重要的是要認識到功耗分析必須做出一些假設。 其中包括因素影響的大小（預期係數）和變異數的大小。表中的 RMSE 條目是針對站點到站點的變更。 還有一個關於「動物間」變異與「動物內」變異大小的假設。 預設假設是它們的大小大致相同。 如果您認為大部分變異存在於動物之間，則應將預設值變更為大於 1 的數字。 為此，請單擊“自訂設計”旁邊的紅色小三角，選擇“高級選項”鏈接，然後選擇“裂區方差比”鏈接。
如何分析裂區實驗？
此分析遵循與其他設計實驗相同的一般結構；請參閱本系列之前的部落格文章。 主要區別在於，我們需要將動物因素作為「隨機效應」添加到設計中。正是這個隨機效應項告訴 JMP 實驗是裂區實驗。 使用“分析”下的“擬合模型”連結。 如果您從設計表中執行此操作，模型項目清單將自動包含隨機效應。 如果您以不同方式存取數據，則需要將 Animal 新增至模型效果清單中，並透過反白該術語並按一下模型術語清單旁的「屬性」三角形將其宣告為隨機效果。 第一個選項是「隨機效應」。
皮膚刺激實驗發生了什麼事？
我們分析 AUC 的結果。有效的治療組合的 AUC 值較低。 表 3 顯示了評估這些因素是否具有顯著影響的測試。 濃度有明顯的影響（p 值=0.002）。 時間效應的 p 值為 0.076，因此表示存在效應，但比濃度效應弱得多。 用於比較兩種抗生素的 F 統計量大於用於計時的 F 統計量。 然而，它的 p 值為 0.078，接近計時值。 原因是抗生素比較是在「整個圖」層面上進行的，因此比時間策略和濃度的比較具有更多的不確定性和更低的功效。 
表3：效果測試
沒有一個相互作用是強的。 因此，濃度顯然是主導因子。 表 4 和圖 3 總結了濃度對 AUC 的估計影響。 有明顯的關係，濃度越高，AUC 越低，因此癒合速度越快。 
表 4：四種濃度的估計平均 AUC
圖 3：以濃度估計的平均 AUC 繪圖
分析包括「動物」的隨機效應，反映了團隊的信念，即部分變異存在於「動物間」層面。 表 5 顯示了「動物內」（殘差）和「動物間」變異數的估計值。Var Component 欄位列出了估計變異數分量：「動物內」水準為 0.0029，「動物間」水準為 0.0010。 第一列給出了動物間變異數佔「動物內」變異數的比例，我們的實驗估計約為 0.34。 
表 5：估計變異數分量
有哪些值得帶回家的資訊？
外用乳膏研究提供了寶貴的信息，表明該乳膏在較高濃度下更有效。 每隻動物使用多個部位可以對濃度和時間進行「動物內部」比較，因此可以在少量動物中發現增加濃度的正面效果。 「動物間」變異僅約為「動物內變異」的 1/3。這是一個驚喜，因為我們預期動物間會存在很大的差異。 當然，動物間變異的估計是基於非常小的樣本，因此變化很大，因此在未來像這樣的實驗中，我們仍然會小心考慮裂區結構。 因此，必須透過動物而不是按部位施用的因子只有在具有非常強的效果或增加動物數量時才能被檢測到。
即將到來的景點
本系列的下一篇文章將探討 QbD 的應用，以使用部分因子和確定性篩選設計來設計分析方法。
參考
[1]有關測試局部皮膚病藥物的更多信息，請參閱 FDA“行業指南”文件： http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/00/backgrd/3661b1c.pdf [2]在範例中，我們使用所有除以最大 AUC 後歸一化為 [0,1] 的資料。 [3]瓊斯，B. 和納茨海姆，C. (2009)。 裂區設計：什麼、為什麼和如何，《品質技術期刊》，41(4)，第 340-361 頁。
裂區實驗是實驗具有難以改變的因素，難以隨機化並且只能在區塊層級應用。
