歡迎各位JMP社群成員，感謝你們參加本次講座。我是Emmett George，今天跟我一起的還有Martin Demel。我是Miltenyi Biotec公司的高級生物製程工程師，公司位於馬裡蘭州蓋瑟斯堡。 Martin是JMP Statistical Discovery公司的首席JMP系統工程師，公司位於德國慕尼黑。
今天，我們將介紹我們運用實驗設計加速慢病毒載體生產流程開發的方法。該方法目前已成功應用於我們位於蓋瑟斯堡的製程開發部門的多個客戶專案和內部專案中，並由我們與托馬斯·利特爾諮詢公司合作開發。
除了介紹我們成熟的數據分析策略外，我們還將提出一些我們認為特別有幫助的補充見解。本次演講將分為兩部分。首先，對主題進行整體介紹；其次，示範我們如何使用 JMP 軟體評估實驗設計。
在深入探討之前，我想先簡單介紹一下我們作為一家生技公司的核心競爭力。 Miltenyi Bioindustry 是一家專注於細胞和基因治療的合約研發生產機構 (CDMO)，隸屬於 Miltenyi Biotec 公司。除了支持客戶專案外，我們還運用自身專業知識開發 CAR-T 細胞和 T 細胞受體療法。
這使我們在符合JMP規範的慢病毒載體和細胞產品生產方面擁有豐富的實務經驗。我們的慢病毒載體生產平台功能齊全。除了標準生產之外，我們的製程開發（PD）團隊還提供針對性的最佳化和專門的表徵研究，以支援商業化進程。
我們還提供標準化的分析平台，可擴展其他檢測項目，並支援檢測和技術轉移至客戶的內部細胞生產設施。我們的法規專家將在整個過程中提供指導。我們的總部位於德國貝爾吉施格拉德巴赫，擁有慢病毒載體開發和細胞處理設施。此外，我們在蓋瑟斯堡、聖荷西和上海也設有生產基地。
我們在德國泰特羅的主要符合JMP標準的載體生產基地也位於此。此外，我們在美國馬裡蘭州蓋瑟斯堡也支持大規模JMP載體生產，該地同時也是我們美國製程研發中心所在地。我們採用第三代慢病毒載體包裝系統，以最高安全標準為基礎建構。
我們的製程採用無血清、懸浮液法，且具有完全可擴展性，可在美國或德國生產。作為一家全球性製造商，我們擁有豐富的經驗，並已利用我們的平台製程生產了數百批JMP產品。
本幻燈片概述了細胞或基因治療產品從研發到商業化的整個生命週期。產品生命週期的第一階段是了解產品。首先，您需要收集有關產品及其開發流程的知識。此階段的目標是定義一套能準確反映產品關鍵品質特性的品質屬性。同時，您還需要考慮整個流程中的製程參數。
產品開發生命週期的第二部分是製程開發和製程表徵。在此過程中，將經歷製程開發和製程表徵的各個階段，並進行多項風險評估。
接下來，我們將進入產品生命週期的第三部分——設計空間建立，最終建立控制策略和設計空間，確保產品的安全性和有效性。
產品生命週期的最後一個階段，即第四階段，是製程效能確認（PPQ），也稱為整體製程驗證階段。然而，這不應被視為一次性的最終確認步驟。相反，它標誌著我們所說的持續製程驗證（CPV）的開始，這是一項持續進行的工作，旨在確保製程在一段時間內保持受控狀態。
今天，我和馬丁將重點討論設計空間的建造、我們定義設計空間的方法，以及如何識別關鍵工藝參數並建立經驗證的可接受範圍。關鍵製程參數是指其變異性會對關鍵品質屬性產生影響的製程參數，因此需要對其進行控製或監控，以確保製程能夠生產出所需的品質。
已驗證的可接受範圍是指製程參數的一個特徵範圍，在該範圍內操作，同時保持其他參數不變，將能夠生產出符合相關品質標準的材料。我們先來定義設計空間。如左側示意圖所示，白色區域代表合格區域，而陰影區域代表不合格區域。
雖然定義設計空間並非製程驗證的強制性要求，但監管機構強烈建議這樣做。美國食品藥物管理局（FDA）以及人用藥品註冊技術要求國際協調理事會（ICH）等監管機構都大力鼓勵並支持此做法。 ICH 指南（例如 Q8(R2)、Q9 和 Q10）概述了設計空間的概念，這些指南分別針對藥物開發、品質風險管理和藥品品質系統提供了指導。
此外，FDA的製程驗證指南文件強調了理解和定義設計空間在製程驗證生命週期中的重要性。 ICH Q8（修訂版2）中也概述了設計空間，它是確保產品品質的輸入變數的多維組合。設計空間的建構採用系統化的方法，利用實驗設計和JMP軟體等工具優化關鍵物料屬性和製程參數。
設計空間透過識別操作限制和潛在故障模式，提供靈活性和控制力，最終支援持續的高品質生產，以持續滿足既定的品質標準和產品規格。
我們如何生成設計空間？首先進行低層次的風險評估，評估可能產生影響的製程參數。我們將列出所有這些製程參數，並將它們與特定的響應或品質屬性關聯起來。然後，我們評估參數變異性可能對這些反應產生的影響程度。如果某個參數被認為影響較大，或沒有先驗知識表明其影響較小，則該參數的風險評分較高，例如本例中的 6 分或 9 分。
相反，那些易於理解且預期影響極小的參數會獲得較低的風險評分，例如零分或三分。這有助於將無影響的參數從實驗設計（DoE）研究中排除。我們將同樣的原理應用於高階項，也就是我們所說的二次方程式中的交互項。科學認知和先前數據是決定哪些參數需要納入研究的關鍵。
最終，這使我們能夠制定量身定制的實驗設計（DoE）。由於每個研究的模型項都需要額外的實驗，因此，基於風險的知情設計有助於平衡研究範圍和可行性。我們使用客製化的DoE平台和JMP軟體來建立DoE研究。設計完成後，濕實驗室進行實驗並收集數據，而乾實驗室則建立統計模型，描述輸入變數或因子與輸出變數或反應之間的關係。
此模型是識別關鍵製程參數的基礎。關鍵製程參數是指那些變化會對關鍵品質屬性產生顯著影響的參數。我們強調，僅靠風險評估不足以辨識關鍵製程參數，還需要透過實驗設計獲得可測量的數據。實驗設計（DoE）顯然是首選方法，因為它有助於分析和隔離每個因素及其交互作用對關鍵反應的影響。
為了確定關鍵製程參數 (CPP)，我們需要檢查您的縮放估計值（也稱為研究中每個因素的效應量）以及上下規格限之間的容差範圍。如果某個因素導致反應平均值偏移超過實驗設計容差範圍的 20%，則該因素被視為關鍵因素。我再重複一次：如果平均值偏移超過容差範圍的 20%（如圖左下角所示），則該因素被歸類為關鍵製程參數。
一旦確定了關鍵製程參數（CPP），就可以利用設計空間來定義製程參數範圍。由於設計空間是動態的，並且對參數設定非常敏感，我們使用蒙特卡羅模擬來模擬批次間的差異，並綜合所有模型的反應結果來評估其穩健性。
這些模擬考慮了三個關鍵的變異來源：模型不確定性、因子變異性以及殘差變異（也稱為均方根誤差或 RMSE），後者來自您用於測試動態實驗研究反應的分析方法等因素。利用這些信息，JMP 會模擬數千次虛擬實驗來評估您的工藝能力。例如，如果我們觀察到缺陷率高於 33%，則明確表明需要收緊參數限制，如螢幕上的示意圖所示。
在本例中，對於因子 D，我們觀察到其與反應 A 存在相關性，尤其是在因子範圍的高端。此時，符合規格的運作比例較高。我們使用類似 JMP 設計空間分析器（源自 JMP 17）的腳本來視覺化模擬資料和故障率。如圖所示，散佈圖矩陣中的綠點代表符合規格的運行，而紅點代表不符合規格的運行。
此視覺化工具清楚地展示了每個因素如何影響您的流程效能，尤其是在範圍極端值處。正如您在左側看到的，透過手動調整工廠限值，我們調整了六個工廠限值，從而優化了我們稱之為「已驗證可接受範圍」（PAR）的指標。在某個案例中，此調整將不合格結果從先前的 33% 降低到 0.1% 以下（約 0.05%），這是一個顯著的改進。
這些經過驗證的可接受範圍構成了穩健、可重複製造的基礎。我們還定義了正常工作範圍（NOR），這是基於歷史性能、設備能力和操作人員差異而設定的更嚴格的限制，但始終在零件的公差範圍內。我再次強調，NOR 幾乎總是在零件的公差範圍內。
接下來，我們將使用JMP軟體，並示範實驗設計及其評估方法。今天我們將演示的範例已在幻燈片中展示。此範例包含五個反應變數和六個因子。透過我們先前進行的低階風險評估，我們確定了這六個因子，也就是主效應。此外，本研究也包含了大量的交互作用和二次項。
透過低階風險評估，我們發現有些別名或交互項會因為影響較小或風險較低而被刻意排除在外。最終，我們確定了一個包含約 16 次運行的實驗設計方案 (DoE)。這就是我們使用自訂設計的方式。它使用的是 JMP 中的 D-optimal 設計平台。在濕實驗室完成這些操作後，我們回到 DoE 評估階段。在這個階段，我們在建立擬合模型之前，首先進行所謂的「資料品質檢查」。我們會查看殘差圖、殘差與預測值的關係圖以及學生化殘差。
這裡我們要觀察殘差是否隨機分佈在零點附近，這表示殘差服從常態分佈，而本例正是如此。否則，殘差中出現的特定模式則可能表示存在未知的主動效應。我們使用學生化殘差和 Bonferroni 校正來檢查異常值。因為這些校正方法更為保守，可以降低錯誤地偵測到偏離趨勢點（即異常值）的風險。
接下來是異常值處理。在分析階段，我們如何檢測異常值？即使偵測到的異常值超出了 Bonferroni 校正閾值（即圖中所示的紅色閾值），也不一定意味著我們會自動將該資料點從資料集中排除。建議不要在沒有科學依據的情況下移除異常值，例如操作誤差、方法偏差等。如果不確定，可以分別對包含和不包含疑似異常值的模型進行比較，並解釋為什麼不包含異常值的模型更具代表性。
現在我們已經完成了資料品質檢查，接下來要建立擬合模型，這需要用到模型迴歸。我們使用所謂的向後剔除法，也就是逐步迴歸，遵循效應層級原則，從模型中移除不顯著的項。我們只移除未包含在更高階項中的主效應。再次強調，交互作用項是二次項。
我們如何判斷它們是否包含在高階項中呢？您需要查看 P 值列右側的插入符號（∧）。任何帶有插入符號的項或主效應都表示其上方存在交互作用或二次項，這意味著它們更為顯著，並包含在高階項中。我們從擬合模型中移除不顯著或不相關的主效應、交互作用和二次項的閾值是 P 值大於 0.1，同時保持整個模型的 P 值具有統計意義，即小於或等於 0.05。
這裡可以看到因子 C 與因子 F 的交互作用。它可以從模型中移除。可以看到因子 C 作為主效果也不顯著，沒有插入符號，因此它沒有包含在更顯著的項（高階項）中。接下來，我再次提到，在移除二次項中的主效應交互作用時，我們的閾值是 p 值 0.1。這裡還有一個邊界條件，就是因子 D 與因子 F 的交互作用。
這裡，同樣地，0.1 的值閾值也存在問題。我們會直接移除這個變數。如果移除該交互項後均方根誤差 (RMSE) 增大，則表示移除該變數是不合理的，因為模型中仍存在一些未知的變異。
但是，如果從模型中移除該交互項後均方根誤差 (RMSE) 確實降低，那麼移除該項就是合理的。我們將移除它。然而，RMSE 卻增加了約 5 個單位。我們將保留該項在模型中。這就是我們的最終擬合模型。
簡而言之，RMSE 用於評估模型項移除過程中模型的穩健性。模型擬合完成後，我們將前往反應變數的紅色熱點區域。點選“儲存欄位”，儲存反應變數的預測公式和標準誤差預測公式。稍後我們將使用這些數據來定義我們的「已驗證可接受範圍」（POR）。但首先，我們將確定響應變數的關鍵過程參數。
接下來，我們有一個腳本，是我們和統計顧問一起開發的，正如我之前提到的，稱為「關鍵流程參數」。您需要點擊這個腳本。它會打開一個視窗。您需要點擊目前開啟的擬合模型，也就是我們一起建立的那個重要的擬合模型，然後點擊「打開表格或運行」。抱歉，我們需要先開啟縮放估計值。我剛才忘了這一點。縮放估計值必須開啟。
正如我之前提到的，這些都是半效應。半效應用於計算我們的關鍵過程參數。我們將傳回關鍵過程參數腳本。現在我們點擊「開啟表格」。在這裡，您可以看到計算的初始部分，其中會顯示下限規格和上限規格，如果您已經預先定義了回應的規格限，則可以在此處輸入這些值。
規格限值通常是預先設定的。但是，例如，如果我們評估的是流程中的某個單元操作，也就是某個中間步驟，那麼該中間步驟的限值可能並不存在。在這種情況下，我們會參考規模化生產數據，並使用符合最終產品規格的批次的最小值和最大值。
在這種情況下，如果上述方法也不可用，我們還有一種預設方法來定義回應的規格限值，即使用 DoE 過程平均值的 80% 作為下限，150% 作為上限。在本例中，我們已經設定了規格限值，上限為 350。我們將在此輸入該值。這是因為響應 E 的目標是最小化。
然後我們返回腳本介面。正如我之前提到的，我們使用 20% 的平均值偏移來定義 CPP 驗收標準。我們已經在第 3 行輸入了預設設定。現在我們點擊「運行」。此時系統會計算 CPP。那麼，我們要如何定義 CPP 的閾值呢？同樣，閾值大於容差範圍的 20% 或平均值的 20%。我們將在這裡查看均值偏移大於 20% 的模型項。這個百分比可以根據需要進行調整。例如，可以使用 10% 或 30%，但我們使用標準的預設設定 20%。
此腳本使用特定乘數執行 CPP 計算，以確定完整效應。您的縮放估計值（也稱為半效應）乘以一個乘數，該乘數為 1 或 2。連續主效果和交互作用使用乘數 2，二次項和分類因子使用乘數 1。然後，縮放估計值乘以該乘數即可計算完整效應。接下來，將完整效應除以您的容差或容差。然後，將該結果的絕對值轉換為百分比，這就是此處輸出的內容。
再者，如果平均值偏移量大於容差範圍的 20%，則表示這是關鍵製程參數 (CPP)。如果小於 20%，則表示這是一個非關鍵製程參數。這就是我們區分 CPP 與非關鍵製程參數的方法。對於實驗設計中的所有反應，都需要執行此擬合模型預測公式及其標準誤差的 CPP 計算。然後，我們會進入「圖表」下的「分析器」工具。這裡我們使用「分析器」工具。我已經預先填寫了相關資料。完成上述計算後，我們就可以進入「分析器」工具，定義製程參數的已驗證可接受範圍 (PAR)。
如您所見，此分析器中已進行了一些預填。模擬器工具已在預測分析器熱點下開啟。要顯示缺陷率，如您所見，您需要右鍵單擊模擬器工具的「列」。請新增 PPM 值，因為我們在模擬中使用了 PPM。然後，我們還添加了相應的 RMSE 值，它代表了響應的隨機噪聲，正如我們之前所看到的。
接下來，我們定義因子分佈。您可以使用三角分佈、常態分佈、截斷分佈等來模擬您的流程。這裡我們選擇三角分佈，並將規模化生產過程中對應的因子設定點置於分佈的峰值處，其上下兩端（或稱極值）代表我們研究設計的極端情況。如果缺陷率過高（在本例中，正如我們之前在範例中看到的，不合格率約為 33%），我們將再次使用設計空間分析器來優化範圍，該功能已在 JMP 17 和現在的 JMP 18 中推出。
在之前的 JMP 15 和 16 版本中，我們有一個內建腳本，利用散點圖矩陣，稱為「失效邊緣」（Edge of Failure）。它本質上是一個即時顯示整體設計空間和特定回應缺陷率的工具，有助於做出明智的決策。我們將在這裡最終確定「已驗證可接受範圍」（Proven Acceptable Ranges），然後所有這些「已驗證可接受範圍」將與製造團隊一起審查其操作可行性。現在，我將把演示交給 Martin，讓他來演示 JMP 18 中的「設計空間分析器」（Design Space Profiler）。
謝謝，埃米特。我來分享一下我的螢幕。我現在從投影片的第9頁和第10頁開始，就是我們剛剛展示的那個分析器。我再次打開分析器，就是艾米特剛才給你示範的那個。
如果您想了解分析器中的工作原理，您可能已經知道了，左側是響應值，右側底部是影響因素，這裡還有模擬結果。當然，如果您為不同的回應值設定了規格限制，您也可以看到缺陷率。
你可以透過最佳化和期望值，並最大化期望值來最佳化整個過程。我已經在這裡做過了。這樣你或許能得到一個最優響應或最優工藝設定。然而，為了驗證可接受的範圍，這可能並非最佳做法，因為優化在許多情況下往往會走向極端。如果我們得到一個位於設計空間邊緣的設置，這通常不是你驗證可接受範圍所需要的，因為我們對設計空間邊緣的情況一無所知。
這對我們目前的情況沒什麼幫助。我們該如何解決這個問題呢？其實，設計空間分析器可以幫助你。設計空間分析器可以讓你輕鬆地透過點擊「向內移動」按鈕來提高符合規格部分的比例。左側顯示的是符合規格部分，底部顯示的是因子設定。我們可以看到限制條件，包括當前因子設定的限制條件，以及響應的符合規格部分和整體符合規格部分。
現在，我們往裡面看，看看發生了什麼事。我們看到這條線上發生了一些變化。這條線代表因子 D 的下限。這是因子 D 的上限。我們可以從曲線圖中看到，當我們把下限值調高時，合格率也會跟著提高。這就是它的解讀方式。
JMP 會試著找出哪個限值變化對符合規格部分的影響最大，並且不斷優化，我們可以繼續下去。只要達到期望的符合規格部分，我們就可以這樣做。比如說，99% 左右。這樣我們就最終達到了您的限值。
現在我們看到所有回應的合格率都相當高。我們可以將中點值傳送到效能分析器。我們也可以將限值傳送到效能分析器。在這裡，您可以選擇要設定的限值。在我看來，通常會使用 3σ 的限值。但為了更好地可視化，並且由於我希望我的響應非常保守，我選擇均勻分佈，因為我也希望在路徑邊緣保持相同的數值。或者說，我希望模擬結果在已驗證可接受範圍的邊緣和內部保持相同的數值。
現在，我們已經看到了它的效果。結果很棒，但我們發現這種自動化方法對因子 D 的可接受範圍的設定或驗證非常有限。這或許是個問題，也或許不是。有時你可以控制這類因子，但通常並非如此。我們該如何繼續推進呢？
我們也發現，有些項目我們可以隨意調整。這時，您的專業知識就派上用場了，您可以說：「我們可能想降低某些項目的成本，因為材料價格、能源成本或其他因素的影響更大，所以我們想降低它。」 如果這並非至關重要，那麼我們可以將其設定在這個範圍內。
現在，為了示範如何處理這個問題並獲得更廣泛的範圍，我先新建一份報告。當然，您不必這樣做，但就本次演示而言，我發現這樣做更實用。這裡我們再次從設定開始，在設計空間分析器中使用所有新設定或常規設定。您可以透過一些方法來查看此規範和設計範圍內的具體情況。您可以使用「建立並連接隨機資料表」來實現這一點。打開該表後，您還可以嵌入因子空間散點圖和響應散點圖。這將建立一個隨機模擬資料表。
您可以根據模型考慮其他經驗。他們會告訴您因子空間的情況。您始終可以看到因子。這裡我們看到的是因子 D。您可以看到，綠色和紅色分別代表符合規範和不符合規範的內容，這與 Emmett 先前向您展示的類似。對於響應變量，我們在這裡看到相同的散佈圖。我們可以想像，D 值越高，綠色就越多；D 值越低，紅色就越多。
這就是為什麼演算法會嘗試朝這個方向移動，因為在這個範圍內移動非常明顯。然而，你需要理解，而不僅僅是找到最佳的合格部分，因為那樣可能會導致極限值太小。你需要理解背後的原理。如果我們這樣做並進行調整，你就能看到它對特定因子組合的合格部分的影響。我們看到有很多紅色部分超出了合格範圍，所以我們忽略了這些部分，這至少可以提高綠色部分的比例。
我們可以看到，使用因子設定 D 時，它傾向於向內移動。然而，我們想看看如何消除這種現象，並真正了解它的影響。如果我們把因子 E 的設定調低會發生什麼事？我們發現，基本上沒有什麼影響。底部會略微偏紅，但同時也會減少這個範圍內的大部分綠色。
它其實並沒有太大幫助，至少不是對所有情況都有效。同樣，如果我調整這裡的上限，我們會發現它會減少更多的綠色部分，所以我們不想為此調整它。你可以追蹤這些變化。例如，如果我們調整因子 F，比如說“我們想把它設為 28，這樣我們就能得到更好的設定”，你會看到這會對這裡的紅色部分產生影響，也會對其他響應以及響應 D 和 B 範圍的下半部分產生很大影響。
這已經相當不錯了。我們可以對其他一些因素做同樣的操作，例如，我們可以根據需要調整因子 C，看看它對效果的影響。這是為了加深理解，而不僅僅是找到最佳的規格範圍。我們可以在這裡調整設定。例如，我們可以不斷嘗試，看看它如何影響你的範圍，以及如何調整才能在不改變因子 D 設定的情況下，使顏色處於理想的綠色區域。之後，我們可以調整因子 D 的設置，最終獲得一個更寬的範圍。
我打開這項研究的最終結果，以便您再次查看。這裡綠色區域代表因子設置，同時也可以看到響應設置，這裡大部分也是綠色。我們可以將這些資料導入分析器，可以看到缺陷率非常低，但透過縮小其他因子的範圍，因子 D 的範圍卻大大擴大了。
最後，我們可以再次以散佈圖矩陣的形式查看失效邊緣圖。我稍微調整了一下顯示的散點圖矩陣圖像，因為我喜歡在散點圖之外使用非參數密度，這樣能讓我更清楚地了解數據最密集的區域在哪裡，尤其是在考慮非常接近規格極限的數據點時，我想看看這裡是否存在輻射熱點，或者僅僅是一個單獨的數據點。這基本上就是使用 JMP 中的設計空間分析器和散點圖矩陣來實現這一點的方法。至此，我把發言權交還給 Emmett，讓他結束本次課程。
謝謝馬丁。我和馬丁希望本次示範能夠展示我們如何建立一套穩健的數據驅動方法來識別關鍵製程參數 (CPP)，並利用實驗設計 (DoE) 和設計空間分析器定義可接受範圍 (PAR)。我們首先根據特定製程需求，採用基於風險的設計方法。我們根據關鍵製程參數對關鍵品質屬性 (CQA) 的實際影響來定義關鍵製程參數，並利用 JMP 18 中的製程模擬和設計空間分析器來建立可接受範圍。
這種方法已成功應用於我們的內部產品，Miltenyi Biotec去年也協助一位客戶成功提交了生物製品許可申請（BLA）。這是FDA首次批准T細胞受體（TCR）療法用於治療實體腫瘤。非常感謝大家的關注。接下來，我和Martin將回答問題。
