越來越多的證據表明，微生物群落影響著宿主生理的各個層面。因此，從全生物體的角度研究動物模型，有望成為一種強大的手段，幫助我們更好地理解環境、微生物群落和宿主遺傳因素如何共同作用，影響疾病的發生和發展。
然而，動物模型面臨的一大挑戰是，除了排除特定病原體外，大多數動物模型的微生物組缺乏控制，在不同動物設施中也鮮有監測。因此，迫切需要了解：1）動物模型中微生物組變異的來源；2）這種變異對宿主表型的影響。
為此，我們應用均勻流形逼近和投影（UMAP）進行降維，然後對所得的排序軸進行變異數分量分析（UMAP-VC）。所有分析和視覺化均使用JMP完成，這使得我們可以互動式地探索聚類模式，並有效地估計諸如飼養設施、品系、性別和飲食等因素的變異數貢獻。
感謝各位今天參與。我和我的同事 Farzaneh Rastegari 非常興奮地向大家介紹這個專案。眾所周知，腸道微生物群是目前人類健康領域一個非常熱門的話題，在各種不同的研究場景下，都湧現了許多非常有趣的研究。今天，我們想和大家分享一些 Farzaneh 在攻讀博士學位期間，以及現在作為 JMP 團隊的正式開發人員，在小鼠研究方面取得的令人振奮的成果。她也正在開發一些軟體，以幫助 JMP 本身實現新的功能，包括新的歸一化和距離矩陣平台。但今天，我們將重點介紹 Farzaneh 從一開始就深入研究的一些真實數據。這是一個非常有趣的設計和設置。 Farzaneh，請為我們詳細介紹。
大家好，我叫法爾扎內（Farzaneh），這是我在攻讀博士學位期間進行的一項實驗，我將在這張海報中展示其中的一部分內容。微生物組與宿主之間存在著非常活躍的相互作用，尤其是在腸道微生物組方面。事實上，我們知道，例如，成年人的腸道內大約有5磅重的微生物，數量非常龐大。為了研究這些交互作用，我們主要採用動物實驗。使用動物進行實驗的一個優點是提高了實驗結果的可重複性。此外，我們也介紹了我們目前使用的一種新穎方法，即UMAP-VC，它是「均勻修正近似投影變異數分量」（Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components）的縮寫，用於量化環境或遺傳變異對小鼠腸道微生物組組成的影響。
在實驗設計中，我們使用了一些小鼠。這些小鼠來自不同的品系、不同的飼養地點，飲食也不同，我們使用了兩種不同的DNA萃取方法。但主要來說，我們進行了三個不同的實驗，每個實驗中我們都對這些因素做了不同的調整。例如，在實驗一中，我們收集了兩個不同品系小鼠的220份糞便樣本…每個品系各有10個重複，所有小鼠均為雄性，飼養地點相同，飲食也相同，但我們同樣使用了兩種不同的DNA製備方法。這裡的每個數字代表了該實驗中每個因素的類別數量。
工作流程概述如下：首先，從不同小鼠中取得樣本，並對16S rRNA基因的V1-V2區進行PCR擴增，這是微生物組研究中常用的方法。然後，萃取16S rRNA基因。在獲得所有萃取的DNA後，我們使用高通量定序方法進行定序。本實驗採用Illumina公司的MiSeq定序儀。定序結果出來後，我們將所有序列聚類成操作分類單元（OTU），即序列相似度至少為97%的OTU。之後，我們收集了所有OTU，並根據每個樣本進行條碼標記。基於這些信息，我們製作了表格，例如，表格的行代表OTU，顏色代表樣本。
每個單元格代表該樣本中該OTU的數量。然後，在得到所有這些表格後，我們可以使用JMP進行UMAP排序和各種成分分析，以查看結果。這裡我展示了每個實驗的部分結果，也就是我一開始介紹的三個實驗。也許用幻燈片展示效果更好。
如您所見，在第一個實驗中，我們使用了22個不同的品系，另一個變化因素是DNA製備方法。在進一步了解這些品系後，我們發現其實有兩個不同的純合近交品系。它們的遺傳背景分別是Black 6和AJ小鼠。我們將AJ小鼠的一條染色體替換到Black 6的遺傳背景中，建構了其他品系。例如，CSS-01品係就是將AJ小鼠的第一條染色體替換到Black 6的遺傳背景中，其餘染色體則來自Black 6。
這裡展示的是這些樣本的層次聚類結果，代表了每個菌株的微生物組組成。此層次聚類是透過CLR變換OTU表，然後利用分離相似性距離產生層次交叉環圖而實現的。我可以稍微放大一下。可以看到，有些菌株之間可能會有一些交叉。但大多數情況下，每個菌株在層次聚類圖中都有一個子樹。這顯示來自同一品系的小鼠的微生物組組成非常接近。
在 UMAP 表格結果中，可以看到 UMAP1 和 UMAP2 的兩個組成部分，總數分別為 99% 和 98%…這種差異是由菌株造成的。這是一個很大的數字。 DNA 製備方面，我們受到的影響很小，幾乎是零。但是，從菌株的交叉 DNA 製備來看，我們觀察到了一些差異。我們對其他組別也進行了同樣的分析。
這裡是另外兩個實驗。在這個實驗中，我們改變了地點、品系、性別和DNA製備等因素。我們為它們設定了不同的類別。在這個實驗中，所有動物都處於同一地點，但我們使用了不同的品系、不同的飲食，以及與地點相似但又非常接近的籠子。我這就去看一下結果。
第二個實驗包含了地點、菌株、性別和DNA製備等資訊。圖A和圖B分別對應UMAP1和UMAP2，但著色方式不同。如圖所示，我們分別以菌株和性別對圖A和圖B進行著色。圖中的形狀代表了不同的地點。為了區分不同地點的樣本，我加入了虛線。可以看到，來自同一地點的樣本聚集在一起。在每個地點聚集之間，不同菌株之間也存在聚集。
此外，這裡不同區域按性別著色，您可以再次看到，對於每種菌株，不同性別的菌株會聚集在一起。但總的來說，您可以看到位置效應…從視覺上看，位置對微生物組組成的影響最大。然後在每個位置內部，菌株的影響最為顯著。對於每種菌株，您可以看到不同區域的性別差異。這是我們從視覺上看到的，在實際的變異數分量分析中，您可以看到，對於位置而言，UMAP1 的變異性有 85% 來自位置，UMAP2 的變異性有 83% 來自位置，這非常顯著，我們之前也看到過這一點。
你可以看到，UMAP1 的變異中，近 12% 是由菌株造成的。菌株和地點交叉組合也帶來了一些變異，這就是這裡比較著名的基因型與環境型交叉組合。此外，菌株還與性別、地點和其他因素相互作用。你可以看到，這些數據顯示了每個因素如何影響樣本間的變異。
我們有第三個實驗，所有實驗都在同一個地點進行，但受試者的體能和飲食都不同。在這個實驗中，我們檢測了一些代謝物指標，例如三酸甘油酯水平。這是另一個實驗層面上新增的代謝物指標。
在這個實驗中，我們可以再次從 UMAP1 和 UMAP2 的圖中看到，菌株對樣本之間的區分度非常高。圖中不同菌株的顏色代表不同的樣本類型。這些形狀大致反映了樣本的飲食和年齡組成。我們可以看到，在每個菌株聚類內部，所有聚類形狀又聚集在一起。看來，年齡和飲食的影響遠小於菌株的影響。
這是同一張圖，但我們根據不同的甘油三酯水平對樣本進行了著色。我們可以直觀地看到，在某些菌株或飲食條件下，三酸甘油酯水平可能會更高或更低。例如，對於這個樣本，我們可以看到它們都偏藍色，這意味著它們的三酸甘油酯水平較低。而對於這個樣本，或是這個樣本，它們的三酸甘油酯含量較高。由此可見，菌株或飲食等實際因素會影響不同樣本的三酸甘油酯水平。
同樣，在UMAP1和UMAP2的變異數分量分析中，你可以看到所有這些數字都顯示了這種效應。這裡，品系的影響最大。這和我們第一個實驗的情況類似，當時所有的小鼠都放在同一個位置。然後是籠號。我沒有在圖表中添加籠號顏色或其他標記，因為那會顯得有點混亂。我們使用了太多籠子，但我們可以看到它們確實會產生影響。品系和飲食也有影響，你可以從圖中的圓圈看出這一點，例如，同一品系但飲食不同的小鼠，其甘油三酯水平會更高。
基於上述結果，我們可以說 UMAP-VC 是一種新穎的方法，它以可視化和數據相結合的方式，展示了不同因素的變化及其間的變異性，並透過降維方法實現了這一點。從科學角度來看，我們可以得出結論：地理位置對腸道菌叢的影響最大。其次是遺傳背景，年齡也是影響腸道菌叢的因素之一。所有這些因素都會影響代謝指標，例如三酸甘油酯水平。這很有意思。這是我們的合作者，牛津大學的 Jethro Johnson 在英國正在進行的一個計畫。他主要致力於研究不同地理位置的變異性。以上就是我們的參考文獻。
Farzaneh，太棒了！這項研究對我來說簡直太吸引人了。我們終於開始逐步揭開微生物組對健康的這些有趣影響，並找到與我們想要關聯的因素（遺傳和環境）之間的關聯。我認為這些技術確實是一個很好的前進方向。我想從技術角度提一下，Farzaneh 的新工作使得這項分析的設定、運行和跳轉都變得相當容易。 UMAP 投影我們已經可以使用多元嵌入平台來實現，順便一提，這個平台是我們團隊的 Meichen Dong 幾年前開發的。你也可以選擇主成分分析，但我們更喜歡 UMAP。它似乎更適合這裡的數據。然後，我們使用混合模型來分析變異。這很好地結合了 JMP 中的兩個強大平台。但由於數據是成分型的，所以需要進行一些歸一化處理。而不用像以前那樣費力地在進化平台上進行這項工作。雖然在 JMP 中確實需要一些步驟，但現在已經很容易完成了。它們個頭並不大。
我覺得直接在 JMP 分析這些數據真的很好，我們可以從中挖掘出許多有價值的見解。另外，我想特別提一下，我們想把這項研究獻給喬治·溫斯托克（George Weinstock），他是一位才華橫溢的研究員，幾年前不幸去世，當時法爾扎內（Farzaneh）的研究正在進行中。法爾扎內，你真棒，在那段艱難的時期堅持了下來。我知道你在整理這些研究資料的過程中還遇到了其他一些困難。但是，我覺得最終的成果非常出色。我們計劃就這些不同的實驗發表幾篇論文，同時也會與許多擁有這些數據的客戶合作。這真是令人振奮，也很有趣。幹得好，法爾扎內！
謝謝。
