Cada vez hay más evidencia que demuestra que los microbiomas influyen en diversos aspectos de la fisiología del huésped. En consecuencia, adoptar una perspectiva holobionte en los modelos animales representa un enfoque potencialmente poderoso para comprender mejor cómo el ambiente, el microbioma y la genética del huésped se combinan para influir en el inicio y el desarrollo de las enfermedades.
Sin embargo, uno de los principales desafíos de los modelos animales es que, más allá de la exclusión de patógenos específicos, la mayoría de los microbiomas no están controlados ni monitorizados en las distintas instalaciones. Por lo tanto, urge comprender 1) las fuentes de variación del microbioma en los modelos animales y 2) el impacto de dicha variación en el fenotipo del huésped.
Aquí buscamos abordar el primero de estos dos desafíos. Utilizando cepas de sustitución cromosómica de ratón (CSS) combinadas con diferentes enfoques de partición de varianza multivariante, cuantificamos el impacto relativo de las fuentes ambientales y genéticas de variación en la composición taxonómica del microbioma fecal.
Para ello, aplicamos la aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) para la reducción de dimensionalidad, seguida de un análisis de componentes de varianza en los ejes de ordenación resultantes (UMAP-VC). Todos los análisis y visualizaciones se realizaron con JMP, lo que permitió la exploración interactiva de patrones de agrupamiento y la estimación eficiente de las contribuciones de varianza de factores como la instalación, la cepa, el sexo y la dieta.
Nuestra conclusión es que las instalaciones para animales ejercen un efecto sobre la composición del microbioma que eclipsa la influencia de la genética del huésped, así como la de otros factores ambientales como la dieta.
Gracias por acompañarnos hoy. Estoy muy entusiasmado con este proyecto junto a mi colega, Farzaneh Rastegari. Como saben, el microbioma intestinal es un tema de gran interés y actualidad en lo que respecta a la salud humana, y se están llevando a cabo numerosas investigaciones muy interesantes en diferentes contextos. Hoy queremos compartir algunos resultados realmente prometedores del estudio que Farzaneh realizó con ratones como parte de su investigación doctoral y que ahora continúa desarrollando como desarrolladora en el grupo JMP. También está desarrollando software que facilita nuevas rutinas en el propio JMP, incluyendo las nuevas plataformas de normalización y matriz de distancias. Pero en este proyecto, nos centraremos en datos reales con los que Farzaneh trabajó en profundidad desde el principio hasta el final. Se trata de un diseño y una configuración muy interesantes. Farzaneh, por favor, cuéntanos más al respecto.
Hola a todos. Me llamo Farzaneh y este es un experimento en el que trabajé durante mi doctorado, y en este póster presento parte de él. Existe una relación e interacciones muy activas entre el microbioma y el huésped, especialmente en el microbioma intestinal, ya que, por ejemplo, un adulto humano tiene alrededor de 2,3 kg de microbios en el intestino. Es una cantidad enorme. Para estudiar estas interacciones, utilizamos principalmente experimentos con animales. Una ventaja de usar animales en los experimentos es que mejora la reproducibilidad. Además, presentamos un método novedoso con el que hemos estado trabajando: UMAP-VC, siglas de Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components (Aproximación y Proyección Uniforme Modificada, Componentes de Varianza), que utilizamos para cuantificar el impacto de la variación ambiental o genética en la composición del microbioma intestinal de ratones.
Para el diseño experimental, utilizamos ratones de diferentes cepas, procedentes de distintas ubicaciones y con diferentes dietas. Además, empleamos dos métodos distintos de extracción de ADN. En total, realizamos tres experimentos diferentes, en los que variamos estos factores de manera distinta. Por ejemplo, en el primer experimento, contamos con 220 muestras fecales de ratones de dos cepas diferentes. Tenemos 10 réplicas por cepa; todos los ratones son machos, provienen de la misma ubicación y siguen la misma dieta. Nuevamente, utilizamos dos métodos distintos de preparación de ADN. Cada número indica la cantidad de categorías para cada factor en dicho experimento.
El flujo de trabajo consiste en obtener muestras de diferentes ratones y realizar la amplificación por PCR de la región V1-V2 del gen del ADN 16S, un método común en estudios de microbioma. Utilizando este gen del ADN ribosomal 16S, tras extraer el ADN de dichas regiones, se secuencia mediante secuenciación de alto rendimiento. En este experimento, se utilizó la plataforma MiSeq de Illumina. Una vez obtenidos los resultados de la secuenciación, se agruparon las secuencias en OTUs (Unidades Organizativas de Tipo) que corresponden a secuencias con una similitud de al menos el 97%. Posteriormente, se asignó un código de barras a cada OTU asociada a cada muestra. Con esta información, se crearon tablas donde las filas representan las OTUs y los colores las muestras.
Cada celda representa el número de OTU en esa muestra. Una vez que tengamos todas esas tablas, podemos usar JMP para realizar la ordenación UMAP y varios análisis de componentes para visualizar los resultados. Aquí muestro algunos de los resultados de cada experimento, los tres que presenté al principio. Quizás se vea mejor en la diapositiva.
En el primer experimento, como vieron, teníamos 22 cepas diferentes, y otro factor que variaba era la preparación del ADN. Conociendo mejor esas cepas, tenemos dos cepas endogámicas homocigotas. Se trata de ratones Black 6 y AJ, cuyos fondos genéticos son cepas endogámicas. Creamos otras cepas a partir de estas, reemplazando un cromosoma de AJ con el fondo genético de Black 6. Por ejemplo, la cepa CSS-01 tiene el primer cromosoma de AJ en el fondo genético de Black 6. El resto de los cromosomas son de Black 6.
Aquí se muestra el resultado de un análisis de conglomerados jerárquico para estas muestras, que representan la composición del microbioma de cada cepa. Este análisis se realiza mediante la transformación CLR de las tablas de OTU y, posteriormente, utilizando la distancia de similitud para generar este gráfico jerárquico de anillos cruzados. Puedo ampliar un poco la imagen. Como se observa, algunas cepas se superponen ligeramente. Sin embargo, en la mayoría de los casos, cada cepa tiene su propio subárbol en el análisis de conglomerados jerárquico. Esto demuestra que la composición del microbioma de los ratones de la misma cepa es muy similar.
En la tabla de resultados UMAP, se observa que para los componentes UMAP1 y UMAP2, el total es del 99 % y el 98 %, respectivamente. Esta variación se debe a las cepas. Es un valor muy alto. En cuanto a la preparación del ADN, el impacto fue mínimo; de hecho, fue nulo. Sin embargo, debido a la cepa y a la preparación cruzada del ADN, se observa una ligera variación. Se realizó el mismo análisis para los demás grupos.
Aquí tenemos los otros dos experimentos. En este experimento, tenemos factores variables como la ubicación, la cepa, el sexo y la preparación del ADN. Los hemos clasificado de diferentes maneras. En este experimento, todos los animales se encuentran en la misma ubicación, pero con diferentes cepas, dietas y jaulas que, de alguna manera, simulan la ubicación, aunque en realidad están más cerca. Veamos el resultado.
Para el segundo experimento, que incluye la ubicación, la cepa, el sexo y la preparación del ADN, estos dos gráficos, A y B, son idénticos para UMAP1 y UMAP2, pero con diferentes colores. Como se puede observar, este gráfico se coloreó según la cepa y el otro según el sexo. Las figuras representan las ubicaciones. Aquí, simplemente añadí estas líneas discontinuas para mostrar los grupos dentro de las ubicaciones. Se puede apreciar que las muestras de la misma ubicación se agrupan claramente. Entre cada grupo de ubicación, se observan grupos entre las cepas en este gráfico.
Además, aquí, en las diferentes secciones, coloreadas según el sexo, se observa que, para cada cepa, los sexos se agrupan. En general, se aprecia que el efecto de la ubicación es… Visualmente, se observa que tiene el mayor impacto en la composición del microbioma. Dentro de cada ubicación, la cepa es el factor determinante. Para cada cepa, se observa que el sexo es visible en diferentes sectores. Esto es lo que se aprecia visualmente, y también en el análisis de componentes de varianza, donde se observa que, para la ubicación, el 85 % de la variabilidad corresponde a la ubicación para UMAP1 y el 83 % para UMAP2, lo cual es significativo, como ya se mencionó.
Como se puede observar en el caso de UMAP1, casi el 12 % de la variación se debe a la cepa. Existe cierta variabilidad al combinar la cepa con la ubicación, un fenómeno conocido como interacción genotipo-ambiente (G x E). También se observa variabilidad entre la cepa, el sexo, la ubicación y otros factores. Estas cifras muestran cómo cada factor contribuye a la variabilidad entre las muestras.
Tenemos un tercer experimento que se realiza en un mismo lugar, pero con diferentes concentraciones y dietas. En este experimento, incluimos algunos factores metabólicos, como el nivel de triglicéridos, que se añadieron en otro nivel de experimentación.
En este experimento, como se observa en la gráfica de UMAP1 y UMAP2, la cepa tiene un efecto significativo en la diferenciación de las muestras. En esta gráfica, las muestras están coloreadas según su cepa. Las formas representan la composición de la dieta y la edad. Dentro de cada grupo de cepas, se aprecia que todas las formas se agrupan nuevamente. El efecto de la dieta y la edad parece ser menor que el de la cepa.
Este es el mismo gráfico, pero aquí hemos coloreado las muestras según sus diferentes niveles de triglicéridos. Como podemos observar visualmente, en algunas cepas o con ciertas dietas, los niveles de triglicéridos pueden ser más altos o más bajos. Por ejemplo, en este caso, vemos que todas las muestras tienden al azul, lo que significa que tienen niveles bajos. Aquí, aquí y aquí, los niveles son más altos. Visualmente, podemos ver que factores como la cepa o la dieta pueden modificar los niveles de triglicéridos en las diferentes muestras.
Nuevamente, en los análisis de componentes de varianza UMAP1 y UMAP2, se pueden observar todos estos números que muestran dicho efecto. Aquí, la cepa tiene el mayor efecto. Es similar al primer experimento, donde también teníamos todos los ratones en la misma ubicación. Luego tenemos la identificación de la jaula. No incluí ningún color para la identificación de la jaula en la gráfica porque resultaba un poco confusa. Teníamos demasiadas jaulas, pero podemos ver que influye en ella. Observamos un efecto de la cepa por dieta, que se aprecia aquí en los círculos: se observa un nivel de triglicéridos más alto en la misma cepa con una dieta diferente que, por ejemplo, en esta otra cepa con una dieta distinta.
Basándonos en estos resultados, podemos afirmar que UMAP-VC es un enfoque novedoso que, tanto visual como numéricamente, muestra la variación de diferentes factores y la variabilidad entre ellos, mediante la reducción de dimensiones. Como conclusión científica, se observa que la ubicación tiene el mayor efecto sobre la microbiota intestinal. En segundo lugar, la predisposición genética constituye el factor que más influye en la microbiota intestinal. Por último, la edad también tiene un impacto significativo. Todos estos factores pueden afectar a los metabolitos, como el nivel de triglicéridos. Este es un proyecto interesante que se está llevando a cabo en el Reino Unido por nuestro colaborador, Jethro Johnson, en la Universidad de Oxford. Su trabajo se centra principalmente en la variabilidad en diferentes ubicaciones. Estas son nuestras referencias.
Muy bien, Farzaneh. Esta investigación me parece fascinante. Estamos empezando a desentrañar los interesantes efectos del microbioma en la salud y a establecer una conexión con aspectos que nos interesan, como la genética y el ambiente. Creo que estas técnicas representan un gran avance. Quería mencionar, a modo de aclaración técnica, que este análisis ahora es bastante fácil de configurar, ejecutar y aplicar gracias al nuevo trabajo de Farzaneh. Las proyecciones UMAP ya las podíamos realizar con la plataforma de incrustación multivariante, que, por cierto, Meichen Dong, de nuestro grupo, desarrolló hace un par de años. También se podrían usar componentes principales, pero preferimos UMAP. Parece ajustarse mejor a los datos. Luego, las variantes se obtienen mediante modelos mixtos. Es una excelente combinación de dos potentes plataformas en JMP. Sin embargo, dado que los datos son composicionales, es necesario normalizarlos. En lugar de invertir tiempo en habilitar esta función con la plataforma de evolución... Sin duda, hay que seguir algunos pasos en JMP, pero ahora es bastante factible. No son complicados.
Creo que es muy útil analizarlos directamente en JMP, y podemos empezar a extraer información valiosa como esta. También quería mencionar, a modo de reconocimiento, que dedicamos toda esta investigación a la memoria de George Weinstock, un investigador brillante que falleció hace unos años, justo cuando Farzaneh estaba llevando a cabo su investigación. Mis felicitaciones, Farzaneh, por superar ese momento tan difícil. Sé que tuviste que superar otras dificultades mientras desarrollabas toda esta investigación. Pero, la verdad, creo que el resultado es magnífico. Tenemos previsto publicar varios artículos sobre estos experimentos que ven aquí, además de colaborar con muchos de nuestros clientes que ahora tienen estos datos. Es muy prometedor e interesante. ¡Buen trabajo, Farzaneh!
Gracias.
