越来越多的证据表明，微生物群落影响着宿主生理的方方面面。因此，从全生物体的角度研究动物模型，有望成为一种强有力的手段，帮助我们更好地理解环境、微生物群落和宿主遗传因素如何共同作用，影响疾病的发生和发展。
然而，动物模型面临的一大挑战是，除了排除特定病原体外，大多数动物模型的微生物组缺乏控制，且在不同动物设施中也鲜有监测。因此，迫切需要了解：1）动物模型中微生物组变异的来源；2）这种变异对宿主表型的影响。
为此，我们应用均匀流形逼近和投影（UMAP）进行降维，然后对得到的排序轴进行方差分量分析（UMAP-VC）。所有分析和可视化均使用JMP完成，这使得我们可以交互式地探索聚类模式，并高效地估计诸如饲养设施、品系、性别和饮食等因素的方差贡献。
感谢各位今天参与。我和我的同事 Farzaneh Rastegari 非常兴奋地向大家介绍这个项目。众所周知，肠道微生物群是目前人类健康领域一个非常热门的话题，在各种不同的研究场景下，都涌现出了许多非常有趣的研究。今天，我们想和大家分享一些 Farzaneh 在攻读博士学位期间，以及现在作为 JMP 团队的正式开发人员，在小鼠研究方面取得的令人振奋的成果。她还在开发一些软件，以帮助 JMP 本身实现新的功能，包括新的归一化和距离矩阵平台。但今天，我们将重点介绍 Farzaneh 从一开始就深入研究的一些真实数据。这是一个非常有趣的设计和设置。Farzaneh，请你为我们详细介绍一下。
大家好，我叫法尔扎内（Farzaneh），这是我在攻读博士学位期间进行的一项实验，我将在这张海报中展示其中的一部分内容。微生物组与宿主之间存在着非常活跃的相互作用，尤其是在肠道微生物组方面。事实上，我们知道，例如，成年人的肠道内大约有5磅重的微生物，数量非常庞大。为了研究这些相互作用，我们主要采用动物实验。使用动物进行实验的一个优势是提高了实验结果的可重复性。此外，我们还介绍了一种我们目前使用的一种新颖方法，即UMAP-VC，它是“均匀修正近似投影方差分量”（Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components）的缩写，用于量化环境或遗传变异对小鼠肠道微生物组组成的影响。
在实验设计中，我们使用了一些小鼠。这些小鼠来自不同的品系、不同的饲养地点，饮食也不同，并且我们使用了两种不同的DNA提取方法。但主要来说，我们进行了三个不同的实验，每个实验中我们都对这些因素进行了不同的调整。例如，在实验一中，我们收集了来自两个不同品系小鼠的220份粪便样本……每个品系各有10个重复，所有小鼠均为雄性，饲养地点相同，饮食也相同，但我们同样使用了两种不同的DNA制备方法。这里的每个数字代表了该实验中每个因素的类别数量。
工作流程概述如下：首先，从不同小鼠中获取样本，并对16S rRNA基因的V1-V2区进行PCR扩增，这是微生物组研究中常用的方法。然后，提取16S rRNA基因。获得所有提取的DNA后，我们使用高通量测序方法进行测序。本实验采用Illumina公司的MiSeq测序仪。测序结果出来后，我们将所有序列聚类成操作分类单元（OTU），即序列相似度至少为97%的OTU。之后，我们收集了所有OTU，并根据每个样本进行条形码标记。基于这些信息，我们制作了表格，例如，表格的行代表OTU，颜色代表样本。
每个单元格代表该样本中该OTU的数量。然后，在得到所有这些表格后，我们可以使用JMP进行UMAP排序和各种成分分析，以查看结果。这里我展示了每个实验的部分结果，也就是我一开始介绍的三个实验。也许用幻灯片展示效果更好。
如您所见，在第一个实验中，我们使用了22个不同的品系，另一个变化因素是DNA制备方法。进一步了解这些品系后，我们发现实际上有两个不同的纯合近交品系。它们的遗传背景分别是Black 6和AJ小鼠。我们通过将AJ小鼠的一条染色体替换到Black 6的遗传背景中，构建了其他品系。例如，CSS-01品系就是将AJ小鼠的第一条染色体替换到Black 6的遗传背景中，其余染色体则来自Black 6。
这里展示的是这些样本的层次聚类结果，代表了每个菌株的微生物组组成。该层次聚类是通过CLR变换OTU表，然后利用分离出的相似性距离构建的层次交叉环图。我可以稍微放大一下。可以看到，有些菌株之间可能存在一些交叉。但大多数情况下，每个菌株在层次聚类图中都有一个子树。这表明来自同一品系的小鼠的微生物组组成非常接近。
在 UMAP 表格结果中，可以看到 UMAP1 和 UMAP2 的两个组成部分，总数分别为 99% 和 98%……这种差异是由菌株造成的。这是一个很大的数字。DNA 制备方面，我们受到的影响很小，几乎为零。但是，从菌株的交叉 DNA 制备来看，我们观察到了一些差异。我们对其他组也进行了同样的分析。
这里是另外两个实验。在这个实验中，我们改变了地点、品系、性别和DNA制备等因素。我们为它们设置了不同的类别。在这个实验中，所有动物都处于同一地点，但我们使用了不同的品系、不同的饮食，以及与地点相似但又非常接近的笼子。我这就去看一下结果。
第二个实验包含了地点、菌株、性别和DNA制备等信息。图A和图B分别对应UMAP1和UMAP2，但着色方式不同。如图所示，我们分别用菌株和性别对图A和图B进行着色。图中的形状代表了不同的地点。为了区分不同地点的样本，我添加了虚线。可以看到，来自同一地点的样本聚集在一起。在每个地点聚集之间，不同菌株之间也存在聚集。
此外，这里不同区域按性别着色，您可以再次看到，对于每种菌株，不同性别的菌株会聚集在一起。但总的来说，您可以看到位置效应……从视觉上看，位置对微生物组组成的影响最大。然后在每个位置内部，菌株的影响最为显著。对于每种菌株，您可以看到不同区域的性别差异。这是我们从视觉上看到的，在实际的方差分量分析中，您可以看到，对于位置而言，UMAP1 的变异性有 85% 来自位置，UMAP2 的变异性有 83% 来自位置，这非常显著，我们之前也看到过这一点。
你可以看到，UMAP1 的变异中，近 12% 是由菌株造成的。菌株和地点交叉组合也带来了一些变异，这就是这里比较著名的基因型与环境型交叉组合。此外，菌株还与性别、地点和其他因素相互作用。你可以看到，这些数据表明了每个因素如何影响样本间的变异。
我们有第三个实验，所有实验都在同一个地点进行，但受试者的体能和饮食都不同。在这个实验中，我们检测了一些代谢物指标，例如甘油三酯水平。这是另一个实验层面上添加的代谢物指标。
在这个实验中，我们可以再次从 UMAP1 和 UMAP2 的图中看到，菌株对样本之间的区分度非常高。图中不同菌株的颜色代表不同的样本类型。这些形状大致反映了样本的饮食和年龄构成。我们可以看到，在每个菌株聚类内部，所有聚类形状又聚集在一起。看来，年龄和饮食的影响远小于菌株的影响。
这是同一张图，但我们根据不同的甘油三酯水平对样本进行了着色。我们可以直观地看到，在某些菌株或饮食条件下，甘油三酯水平可能会更高或更低。例如，对于这个样本，我们可以看到它们都偏蓝色，这意味着它们的甘油三酯水平较低。而对于这个样本，或者这个样本，它们的甘油三酯水平则较高。由此可见，菌株或饮食等实际因素会影响不同样本的甘油三酯水平。
同样，在UMAP1和UMAP2的方差分量分析中，你可以看到所有这些数字都显示了这种效应。这里，品系的影响最大。这和我们第一个实验的情况类似，当时所有的小鼠都放在同一个位置。然后是笼号。我没有在图表中添加笼号颜色或其他标记，因为那样会显得有点混乱。我们用了太多笼子，但我们可以看到它们确实会产生影响。品系和饮食也有影响，你可以从图中的圆圈看出这一点，例如，同一品系但饮食不同的小鼠，其甘油三酯水平会更高。
基于以上结果，我们可以说 UMAP-VC 是一种新颖的方法，它以可视化和数据相结合的方式，展示了不同因素的变化及其间的变异性，并通过降维方法实现了这一点。从科学角度来看，我们可以得出结论：地理位置对肠道菌群的影响最大。其次是遗传背景，年龄也是影响肠道菌群的因素之一。所有这些因素都会影响代谢指标，例如甘油三酯水平。这很有意思。这是我们的合作者，牛津大学的 Jethro Johnson 在英国正在进行的一个项目。他主要致力于研究不同地理位置的变异性。以上就是我们的参考文献。
Farzaneh，太棒了！这项研究对我来说简直太吸引人了。我们终于开始逐步揭开微生物组对健康的这些有趣影响，并找到与我们想要关联的因素（遗传和环境）之间的联系。我认为这些技术确实是一个很好的前进方向。我想从技术角度提一下，Farzaneh 的新工作使得这项分析的设置、运行和跳转都变得相当容易。UMAP 投影我们已经可以使用多元嵌入平台来实现，顺便一提，这个平台是我们团队的 Meichen Dong 几年前开发的。你也可以选择主成分分析，但我们更喜欢 UMAP。它似乎更适合这里的数据。然后，我们使用混合模型来分析变异。这很好地结合了 JMP 中的两个强大平台。但由于数据是成分型的，所以需要进行一些归一化处理。而不用像以前那样费力地在进化平台上进行这项工作。虽然在 JMP 中确实需要一些步骤，但现在已经很容易完成了。它们个头并不大。
我觉得直接在 JMP 里分析这些数据真的很好，我们可以从中挖掘出很多有价值的见解。另外，我想特别提一下，我们想把这项研究献给乔治·温斯托克（George Weinstock），他是一位才华横溢的研究员，几年前不幸去世，当时法尔扎内（Farzaneh）的研究正在进行中。法尔扎内，你真棒，在那段艰难的时期坚持了下来。我知道你在整理这些研究资料的过程中还遇到了其他一些困难。但是，我觉得最终的成果非常出色。我们计划就这些不同的实验发表几篇论文，同时也会与很多拥有这些数据的客户合作。这真是令人振奋，也很有意思。干得好，法尔扎内！
谢谢。
