미생물군집이 숙주 생리의 다양한 측면에 영향을 미친다는 증거가 점차 늘어나고 있습니다. 따라서 동물 모델에 대한 홀로비온트 관점을 취하는 것은 환경, 미생물군집, 그리고 숙주 유전학이 어떻게 결합하여 질병의 발병과 발달에 영향을 미치는지에 대한 이해를 높이는 데 잠재적으로 강력한 접근법이 될 수 있습니다.
그러나 동물 모델이 직면한 주요 과제는 특정 병원균을 배제하는 것 외에도, 대부분의 미생물군집이 여러 동물 시설에서 통제되지 않고 모니터링되지 않는다는 것입니다. 따라서 1) 동물 모델에서 미생물군집 변이의 원인과 2) 이러한 변이가 숙주의 표현형에 미치는 영향을 이해하는 것이 시급합니다.
본 연구에서는 두 가지 과제 중 첫 번째 과제를 해결하고자 했습니다. 마우스 염색체 치환 균주(CSS)와 다양한 다변량 분산 분할 접근법을 결합하여, 환경적 및 유전적 변이원이 분변 미생물군집의 분류학적 구성에 미치는 상대적 영향을 정량화했습니다.
이를 위해, 차원 축소를 위해 균등 다양체 근사 및 투영(UMAP)을 적용한 후, 결과적인 서열 축에 대한 분산 성분 분석(UMAP-VC)을 수행했습니다. 모든 분석 및 시각화는 JMP를 사용하여 수행되었으며, 이를 통해 군집 패턴을 상호 작용적으로 탐색하고 시설, 계통, 성별, 식이와 같은 요인의 분산 기여도를 효율적으로 추정할 수 있었습니다.
우리의 결론은 동물의 생활 환경이 숙주의 유전적 요인이나 식단과 같은 다른 환경적 요인의 영향을 능가하는 수준으로 미생물 군집 구성에 영향을 미친다는 것입니다.
오늘 참여해 주셔서 감사합니다. 동료인 파르자네 라스테가리와 함께하는 이 프로젝트에 정말 기대가 큽니다. 아시다시피, 장내 미생물총은 요즘 인간 건강 측면에서 매우 흥미롭고 뜨거운 주제이며, 다양한 시나리오에서 매우 흥미로운 연구가 많이 진행되고 있습니다. 오늘은 파르자네가 박사 과정 연구의 일환으로 수행했고 현재 JMP 그룹의 정식 개발자로서 계속 진행하고 있는 생쥐 연구의 매우 흥미로운 결과를 공유하고자 합니다. 그녀는 또한 새로운 정규화 및 거리 행렬 플랫폼을 포함하여 JMP 자체의 새로운 루틴을 용이하게 하는 소프트웨어도 개발하고 있습니다. 하지만 오늘 이 프로젝트에서는 파르자네가 처음부터 끝까지 매우 심도 있게 연구한 실제 데이터에 초점을 맞출 것입니다. 매우 흥미로운 설계와 설정입니다. 파르자네, 이 데이터를 가져가서 자세히 설명해 주시면 좋겠습니다.
안녕하세요 여러분. 저는 파르자네입니다. 이 실험은 제가 박사 학위 과정에서 진행했던 실험이며, 이 포스터에서 그 일부를 소개합니다. 미생물군집과 숙주, 특히 장내 미생물군집 사이에는 매우 활발한 관계와 상호작용이 존재합니다. 예를 들어 성인의 장내 미생물 총량은 약 2.5kg(5파운드)입니다. 엄청난 양이죠. 저희는 이러한 상호작용을 파악하기 위해 주로 동물 실험을 활용하고 있습니다. 실험에 동물을 사용하는 한 가지 장점은 재현성을 높이는 것입니다. 또한, 저희는 UMAP-VC라는 다소 독특한 방법을 도입하고 있습니다. 이는 환경적 또는 유전적 변이가 생쥐의 장내 미생물군집 구성에 미치는 영향을 정량화하기 위한 Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components의 약자입니다.
실험 설계를 위해 여러 마리의 생쥐를 사용하고 있습니다. 다양한 균주, 다양한 지역, 다양한 식단을 가진 생쥐를 사용하고 있으며, 이 실험에서는 두 가지 다른 DNA 추출법을 사용합니다. 하지만 주로 세 가지 실험을 진행하며, 각 실험마다 이러한 요소들을 다르게 적용합니다. 예를 들어, 첫 번째 실험에서는 두 가지 다른 균주의 생쥐로부터 220개의 분변 샘플을 채취했습니다. 각 균주마다 10개의 반복실험을 실시하며, 모두 같은 지역에 같은 식단을 가진 수컷입니다. 하지만 이 실험에서도 두 가지 다른 DNA 추출법을 사용합니다. 각 숫자는 해당 실험에서 각 요인의 범주 수를 나타냅니다.
워크플로우의 요약은 다양한 마우스에서 샘플을 채취하여 16S DNA 유전자의 V1-V2 영역을 PCR 증폭하는 것입니다. 이는 미생물군 연구에 일반적인 방법입니다. 16S 리보솜 DNA 유전자를 사용합니다. 해당 영역에서 DNA를 추출한 후 고처리량 시퀀싱 방법으로 시퀀싱했습니다. 이 실험에서는 Illumina의 MiSeq 장비를 사용합니다. 장비에서 모든 시퀀싱 결과를 얻은 후 모든 시퀀스를 OTU라고 하는 여러 단위로 클러스터링합니다. OTU는 서로 최소 97% 유사한 시퀀스입니다. 그런 다음 모든 OTU를 확보하고 각 샘플별로 바코드를 붙입니다. 이 모든 정보를 바탕으로 OTU를 행으로, 샘플을 색상으로 표시하는 표를 만듭니다.
각 세포는 해당 샘플에 있는 OTU의 개수입니다. 모든 표를 작성한 후, JMP를 사용하여 UMAP 순서 분석과 다양한 성분 분석을 통해 결과를 확인할 수 있습니다. 여기서는 처음에 소개했던 세 가지 실험, 즉 각 실험의 결과 중 일부를 보여드립니다. 슬라이드에 더 잘 어울리는 것 같습니다.
첫 번째 실험에서는 보시다시피 22개의 서로 다른 균주를 가지고 있었는데, DNA 준비 과정도 변화의 요인이었습니다. 이 균주들에 대해 더 자세히 알게 되면서, 실제로 동형접합체인 두 개의 서로 다른 근친교배 균주가 있다는 것을 알게 되었습니다. Black 6 마우스와 AJ 마우스가 근친교배 균주의 배경이 됩니다. AJ 마우스의 염색체 하나를 Black 6 배경으로 치환하여 다른 균주를 만들었습니다. 예를 들어, CSS-01은 Black 6 배경에서 AJ 마우스의 첫 번째 염색체를 가진 균주입니다. 나머지 염색체는 Black 6 마우스에서 유래했습니다.
여기서 각 균주의 미생물군집 구성을 나타내는 샘플에 대한 계층적 클러스터링 결과를 볼 수 있습니다. 이 계층적 클러스터링은 OTU 테이블을 CLR로 변환한 후, 브레이크아웃(break-out)과 유사 거리를 사용하여 계층적 교차 링 그래프를 만든 것입니다. 조금 확대해서 볼 수도 있습니다. 보시다시피, 일부 균주는 서로 약간 교차되어 있을 수 있습니다. 하지만 대부분의 경우, 각 균주는 계층적 클러스터링에서 하위 트리를 가지고 있습니다. 이는 같은 균주에 속하는 마우스들의 미생물군집 구성이 서로 매우 가깝다는 것을 보여줍니다.
UMAP 표 결과에서 UMAP1과 UMAP2의 두 구성 요소 모두에서 각각 99%와 98%의… 이러한 변이는 균주에 따른 것입니다. 엄청난 수치죠. DNA 샘플에서는 큰 영향을 미치지 않았습니다. 0이었습니다. 하지만 균주 간 교차 DNA 샘플에서는 약간의 변이가 나타났습니다. 다른 그룹에서도 동일한 분석을 수행했습니다.
여기 다른 두 가지 실험이 있습니다. 이 실험에서는 위치, 균주, 성별, 그리고 DNA 준비 요인들이 변화하고 있습니다. 각 요인에 대해 서로 다른 범주를 설정했습니다. 이 실험에서는 모두 같은 위치에 있지만, 균주와 먹이, 그리고 케이지가 서로 다르기 때문에 위치와 비슷하지만 훨씬 더 가깝습니다. 결과는 여기에서 확인해 보겠습니다.
두 번째 실험에는 위치, 균주, 성별, 그리고 DNA 전처리 과정이 포함됩니다. 이 두 그래프 A와 B는 UMAP1과 UMAP2에 대한 동일한 그래프이지만, 여기서는 다른 요인으로 색을 칠했습니다. 보시다시피, 이 그래프는 균주별로, 이 그래프는 성별별로 색을 칠했습니다. 도형은 위치를 나타냅니다. 여기서는 점선을 추가하여 각 위치의 클러스터를 표시했습니다. 같은 위치에서 추출된 샘플들이 잘 모여 있는 것을 볼 수 있습니다. 각 위치 클러스터 사이에서 이 그래프에서 균주 간의 클러스터를 확인할 수 있습니다.
또한, 성별에 따라 구분된 여러 섹션을 살펴보면, 각 균주마다 성별이 밀집되어 있는 것을 확인할 수 있습니다. 하지만 일반적으로 위치 효과는… 시각적으로 볼 때, 미생물군집 구성에 가장 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있습니다. 각 위치 내에서는 균주가 가장 강력한 영향을 미칩니다. 각 균주에서 성별이 다른 영역에서 눈에 띄는 것을 볼 수 있습니다. 이는 시각적으로 확인할 수 있는 부분이며, 실제 분산 분석에서도 위치 변동성의 85%가 UMAP1의 위치이고 83%가 UMAP2의 위치입니다. 이는 이전에도 확인된 바와 같이 매우 큰 변화입니다.
UMAP1의 경우, 변이의 약 12%가 전체적으로 균주에 의한 것입니다. 균주와 위치를 교차시켜 약간의 변이를 얻었는데, 여기서 G-E라는 유명한 방법이 있습니다. 또한 성별, 위치 등 다른 요인에 따른 균주도 있습니다. 이 수치들을 보면 각 요인이 표본 간의 변이를 어떻게 만드는지 알 수 있습니다.
세 번째 실험은 모두 한 장소에서 진행되지만, 각 실험마다 강점과 식단이 다릅니다. 이 실험에서는 대사산물 요인, 중성지방 수치를 측정합니다. 이는 다른 실험 단계에서 대사산물 요인을 추가한 것입니다.
이 실험에서 UMAP1과 UMAP2의 그래프를 다시 보면, 한 균주가 샘플을 서로 분리하는 데 매우 큰 영향을 미친다는 것을 시각적으로 확인할 수 있습니다. 이 그래프에서는 각 균주가 다른 균주에 따라 색깔이 칠해져 있습니다. 모양은 식단과 연령 구성을 어떻게든 보여줍니다. 균주의 각 클러스터 내부를 보면 모든 모양이 다시 모여 있는 것을 볼 수 있습니다. 연령별 식단 효과가 균주 효과보다 훨씬 작은 것 같습니다. 식단 효과는 균주 효과보다 작습니다.
같은 그래프지만, 여기서는 시각적으로 확인할 수 있도록 각 샘플의 중성지방 수치를 다르게 색칠했습니다. 다시 말해, 어떤 균주나 식단에서는 중성지방 수치가 더 높거나 낮을 수 있습니다. 예를 들어, 이 샘플의 경우, 모든 샘플이 파란색으로 표시되는 것을 볼 수 있습니다. 즉, 중성지방 수치가 낮다는 것을 의미합니다. 여기, 여기, 또는 이 샘플은 중성지방 수치가 더 높습니다. 시각적으로, 균주나 식단과 같은 실제 요인들이 샘플마다 중성지방 수치를 변화시킬 수 있음을 알 수 있습니다.
다시 UMAP1과 UMAP2에서 분산 성분 분석을 통해 해당 효과를 보여주는 모든 숫자를 볼 수 있습니다. 여기서는 균주가 가장 큰 효과를 나타냅니다. 첫 번째 실험에서 모든 쥐를 같은 위치에 두었던 것과 같습니다. 그런 다음 케이지 ID가 있습니다. 그래프에 케이지 ID 색상이나 그런 것을 넣지 않았는데, 여기서는 약간 지저분했기 때문입니다. 케이지가 너무 많았지만 효과가 있는 것을 볼 수 있습니다. 식단에 따른 균주의 효과가 있는데, 여기 원에서 어떻게든 볼 수 있듯이, 예를 들어 이 균주보다 다른 식단을 통해 같은 균주에서 중성지방 수치가 더 높은 것을 볼 수 있습니다. 이것도 같은 균주이지만 다른 식단입니다.
이 모든 결과를 바탕으로 UMAP-VC는 새로운 접근법이라고 할 수 있습니다. 시각적으로도, 숫자로도 다양한 요인의 변화와 요인 간의 변동성을 보여주고, 차원 축소를 통해 보여줍니다. 과학적 결과, 결론적으로, 장내 미생물 군집에 가장 큰 영향을 미치는 요인은 위치입니다. 그 다음으로 유전적 배경이 장내 미생물 군집에 영향을 미치는 두 번째 요인입니다. 그 다음으로 연령이 영향을 미칩니다. 이 모든 요인이 중성지방 수치와 같은 대사 산물 요인에 영향을 미칠 수 있습니다. 흥미로운 사실입니다. 이 프로젝트는 옥스퍼드 대학교의 협력자인 제쓰로 존슨이 영국에서 진행 중입니다. 그는 주로 다양한 위치의 변동성에 대한 연구를 계속하고 있습니다. 이것이 전부입니다. 이것이 우리의 참고 자료입니다.
파르자네, 정말 훌륭합니다. 이 연구는 정말 흥미로웠습니다. 우리는 이제 막 미생물 군집이 건강에 미치는 흥미로운 영향을 분석하기 시작했고, 유전학과 환경이라는 우리가 연관시키고 싶은 것들에 대한 지도를 그리기 시작했습니다. 이러한 기법들이 앞으로 나아갈 좋은 방법이라고 생각합니다. 기술적인 측면에서 말씀드리자면, 파르자네의 새로운 연구 덕분에 이 분석은 이제 설정, 실행, 그리고 바로 적용하기가 상당히 쉬워졌습니다. UMAP 예측은 이미 다변량 임베딩 플랫폼을 사용하여 수행할 수 있었는데, 참고로 이 플랫폼은 몇 년 전 우리 연구팀의 마이첸 동이 개발했습니다. 주성분 분석을 할 수도 있지만, 저희는 UMAP을 선호합니다. 이 방법이 여기 데이터에 더 잘 맞는 것 같습니다. 그런 다음 혼합 모델을 사용하여 변이를 분석합니다. JMP의 두 가지 강력한 플랫폼을 훌륭하게 결합한 것입니다. 하지만 데이터가 구성적이므로 정규화를 수행해야 합니다. 진화 플랫폼에서 정규화를 수행하는 대신 말입니다. JMP에서는 몇 단계를 거쳐야 하는 건 분명하지만, 지금은 꽤 가능합니다. 그렇게 큰 단계는 아닙니다.
JMP에서 바로 분석하는 것이 정말 좋다고 생각하고, 이렇게 멋진 통찰력을 얻을 수 있게 되었습니다. 또한, 이 모든 연구를 몇 년 전, Farzaneh의 연구 도중 세상을 떠난 뛰어난 연구자 George Weinstock을 기리기 위해 바치고 싶었습니다. Farzaneh, 그 어려운 시기를 잘 견뎌낸 것에 찬사를 보냅니다. 이 모든 연구를 정리하는 동안 여러 가지 어려운 역경이 있었다는 것을 알고 있습니다. 하지만 정말 아름답게 어우러졌다고 생각합니다. 여기에서 보시는 다양한 실험에 대한 여러 논문을 발표하고, 이 데이터를 보유한 많은 고객과 협업할 계획입니다. 매우 유망하고 흥미로운 결과를 볼 수 있습니다. Farzaneh, 잘하셨습니다.
감사합니다.
