マイクロバイオームが宿主の生理機能の多様な側面に影響を与えることを示す証拠が増えています。結果として、動物モデルにホロバイオントの視点を取り入れることは、環境、マイクロバイオーム、そして宿主の遺伝子がどのように組み合わさって疾患の発症と進行に影響を与えるかを理解するための強力なアプローチとなる可能性があります。
しかし、動物モデルが直面する大きな課題は、特定の病原体を排除する以外に、多くのマイクロバイオームが様々な動物施設間で管理されておらず、モニタリングもほとんど行われていないことです。そのため、1) 動物モデルにおけるマイクロバイオームの変異の原因、および2) こうした変異が宿主の表現型に与える影響について、早急に理解する必要があります。
本研究では、これら2つの課題のうち最初の課題に取り組もうとしました。マウス染色体置換系統（CSS）と様々な多変量分散分割手法を組み合わせることで、環境要因と遺伝要因の変異が糞便マイクロバイオームの分類学的構成に及ぼす相対的な影響を定量化しました。
そのために、均一多様体近似・射影法（UMAP）を用いて次元削減を行い、得られた順序軸について分散成分分析（UMAP-VC）を実施しました。すべての分析と可視化はJMPを用いて実施し、クラスタリングパターンのインタラクティブな探索と、施設、系統、性別、食事などの要因による分散寄与の効率的な推定を可能にしました。
本日はご参加いただきありがとうございます。同僚のFarzaneh Rastegariとのプロジェクトに大変興奮しています。ご存知の通り、腸内マイクロバイオームは近年、人間の健康という観点から非常に興味深く、ホットな話題となっており、様々なシナリオで非常に興味深い研究が数多く行われています。本日は、Farzanehが博士研究の一環として、そして現在JMPグループの正式開発者として取り組んでいるマウス研究の、非常に興味深い結果についてお話ししたいと思います。彼女はまた、新しい正規化や距離行列プラットフォームなど、JMP自体の新しいルーチンを容易にするソフトウェアも開発しています。本日のプロジェクトでは、Farzanehが最初から最後まで非常に綿密に取り組んだ実際のデータに焦点を当てたいと思います。これは非常に興味深い設計と設定です。Farzaneh、ぜひこのデータについてお話しください。
皆さん、こんにちは。Farzanehと申します。これは私が博士課程で取り組んでいた実験の一部で、このポスターで発表します。マイクロバイオームと宿主、特に腸内マイクロバイオームの間には、非常に活発な関係性と相互作用が存在します。というのも、例えば成人の場合、腸内には約5ポンド（約2.3kg）の微生物が存在するからです。これは膨大な量です。そのため、私たちは主に動物実験を用いてこれらの相互作用を解明しています。実験に動物を使用する利点の一つは、再現性の向上です。また、私たちは独自の手法を導入しています。それがUMAP-VCです。これは、Uniform Modified approximation and Projection, Variance Components（均一修正近似投影、分散成分）の略称で、環境または遺伝的変異がマウスの腸内マイクロバイオームの構成に及ぼす関連する影響を定量化するための手法です。
実験設計では、マウスを使用しています。系統、飼育場所、餌の種類が異なるマウスを使用し、また、この実験では2種類の異なるDNA抽出法を使用しています。しかし、基本的には3つの異なる実験を行い、各実験でこれらの要因をそれぞれ異なる方法で変更しています。例えば、実験1では、2種類の系統のマウスから220個の糞便サンプルを採取しています。系統ごとに10回の反復実験を行い、すべて雄で、同じ場所で同じ餌を与えています。ただし、この実験では2種類の異なるDNA抽出法を使用しています。ここに表示されている数字は、各実験における各要因のカテゴリー数を示しています。
ワークフローの概要は、異なるマウスからサンプルを取得し、マイクロバイオーム研究で一般的な方法である16S DNA遺伝子のV1-V2領域のPCR増幅を行うことです。16SリボソームDNA遺伝子を使用します。これらの領域から抽出したDNAをすべて取得した後、ハイスループットシーケンシング法でシーケンスしました。この実験では、イルミナのMiSeqマシンを使用しています。マシンからすべてのシーケンス結果を取得した後、すべてのシーケンスを、互いに少なくとも97％類似している類似シーケンスであるOTUと呼ばれる多数の操作型ユニットにクラスター化します。その後、これらすべてのOTUが得られ、各サンプルごとにバーコード化されます。このすべての情報を使用して、たとえばここにOTUが行に表示され、サンプルが色分けされた表を作成します。
各セルは、そのサンプルにおけるOTUの数です。これらの表をすべて用意したら、JMPを使ってUMAP順位付けと各種成分分析を行い、結果を確認できます。ここでは、冒頭で紹介した3つの実験について、それぞれの実験の結果の一部を示しています。スライドにはこちらの方が良いかもしれません。
最初の実験では、ご覧の通り22種類の系統がありましたが、変化していたもう一つの要因はDNAの調製でした。これらの系統についてさらに詳しく調べてみると、実はホモ接合性の近交系が2種類あることが分かりました。これらはBlack 6マウスとAJマウスを背景とした近交系です。これらのマウスから、AJマウスの染色体を1本Black 6マウスに置き換えることで、別の系統を作りました。例えば、CSS-01はBlack 6マウスの背景にAJマウスの最初の染色体を持つ系統で、残りの染色体はBlack 6マウスに由来しています。
こちらは、これらのサンプルの階層的クラスタリングの結果です。これは、各株のマイクロバイオーム構成を表しています。この階層的クラスタリングは、OTUテーブルをCLR変換し、類似度距離のブレイクアウトを用いて階層的クロスリンググラフを作成することで作成されています。少し拡大表示することもできますが、ご覧のとおり、一部の株は少し交差しているように見えます。しかし、ほとんどの場合、各株は階層的クラスタリングにおいてサブツリーを持っていることがわかります。これは、同じ株に属するマウスのマイクロバイオーム構成が互いに非常に近いことを示しています。
UMAPテーブルの結果を見ると、UMAP1とUMAP2の両方の成分について、合計で99%と98%という数値が見られます。この変動は株によるもので、非常に大きな数値です。DNA調製に関しては、それほど大きな影響はありませんでした。ゼロでした。しかし、株間DNA調製では、若干の変動が見られます。他のグループについても同様の分析を行いました。
こちらは他の2つの実験です。この実験では、場所、系統、性別、DNA調製因子が変化しています。それぞれ異なるカテゴリーに分類しています。この実験では、すべて同じ場所にいますが、系統と餌が異なり、ケージも場所と似ていますが、実際にはより近いものになっています。結果については、こちらをご覧ください。
2つ目の実験では、場所、系統、性別、DNA調製物が含まれています。この2つのグラフ（AとB）はUMAP1とUMAP2の同じグラフですが、異なる要素で色分けしています。ご覧のとおり、このグラフは系統別、このグラフは性別別に色分けされています。図形は場所を示しています。ここでは、場所のクラスターを示すために破線を追加しました。同じ場所から採取されたこれらのサンプルがきれいに集まっているのがわかります。各場所のクラスター間では、このグラフの系統間のクラスターも確認できます。
また、ここでは性別ごとに色分けされた異なるセクションが表示されていますが、それぞれの株において、異なる性別が密集していることがわかります。しかし、全体的に見ると、場所の影響が…視覚的に見て、マイクロバイオームの構成に最も影響を与えていることがわかります。そして、それぞれの場所の中で、株が最も影響力を持っています。それぞれの株について、性別は異なるセクターで明確に示されています。これは視覚的に確認できる内容です。また、実際の分散分析では、場所に関して、UMAP1では変動の85%、UMAP2では83%が場所によるものであることがわかります。これは非常に大きな値で、先ほども見ました。
UMAP1では、変動の約12%が系統によるものであることがわかります。系統と場所を掛け合わせることで、ある程度の変動が見られます。これはG by Eという、ここでよく知られているものです。また、性別、場所、その他の要素によって系統が分類されています。これらの数値は、各要因がサンプル間でどのように変動を生み出しているかを示しています。
3つ目の実験はすべて同じ場所で行われますが、強度と食事が異なります。この実験では、代謝因子、トリグリセリド値など、いくつかの代謝因子が用いられます。これは、別のレベルの実験で代謝因子が追加されたものです。
この実験では、UMAP1とUMAP2のグラフを再びご覧いただければ、系統がサンプルを互いに分離させるのに非常に大きな影響を与えていることが視覚的にわかります。このグラフでは、系統ごとに色分けされています。形は食生活、つまり年齢構成を表しています。系統の各クラスター内では、これらの形がすべて集まっているのがわかります。年齢と食生活の影響は、系統の影響よりもかなり小さいようです。
これは同じグラフですが、ここではサンプルをトリグリセリド値ごとに色分けしています。視覚的に確認できるように、菌株や食事によってはトリグリセリド値が高かったり低かったりすることがあります。例えば、このサンプルでは、すべてが青色に傾いているのがわかります。これは、トリグリセリド値が低いことを意味します。ここ、ここ、そしてこのサンプルは高くなっています。視覚的に、菌株や食事といった実際の要因が、異なるサンプルのトリグリセリド値を変化させる可能性があることが分かります。
分散成分分析であるUMAP1とUMAP2では、すべての数値がその効果を示しています。ここでは、系統の影響が最も大きいことがわかります。これは最初の実験と同様に、すべてのマウスを同じ場所に配置した例です。次に、ケージIDがあります。グラフにはケージIDの色分けなどはしていません。少し見づらいからです。ケージが多すぎましたが、それが影響していることがわかります。系統と食事の影響があり、円で囲まれているのが分かります。同じ系統でも、異なる食事を与えた場合、例えばこの系統ではトリグリセリド値が高くなっていることがわかります。これは同じ系統ですが、異なる食事を与えた場合です。
これらすべての結果に基づき、UMAP-VCは斬新なアプローチであると言えます。視覚的にも数値的にも、様々な要因の変動、要因間の変動性、そして次元削減を示すことができます。科学的な結果として、腸内細菌叢に最も影響を与えるのは場所であることがわかります。次に、遺伝的背景が腸内細菌叢に影響を与える2番目の要因です。そして、年齢がそれに影響を与えています。これらすべてが、トリグリセリド値などの代謝因子に影響を与える可能性があります。これは興味深いことです。これは、英国オックスフォード大学の共同研究者であるジェスロ・ジョンソン氏が現在取り組んでいるプロジェクトです。彼は主に、様々な場所における変動性について研究を続けています。以上です。これが参考資料です。
素晴らしいですね、ファルザネさん。この研究は本当に興味深いです。マイクロバイオームが健康に及ぼす興味深い影響をようやく解明し始め、遺伝と環境といった、私たちが関連付けたい事柄へのマッピングが見えてきたところです。これらの技術は本当に素晴らしい前進だと思います。技術的な点について触れておきたいのですが、ファルザネさんの新しい研究のおかげで、この分析はセットアップも実行もかなり簡単にできるようになりました。UMAP予測は、多変量埋め込みプラットフォームを使って既に実行できます。ちなみに、このプラットフォームは数年前に私たちのグループのメイチェン・ドンが行いました。主成分分析もできますが、私たちはUMAPを好みます。今回のデータにはUMAPの方が少し適合しているようです。そして、変異は混合モデルを用いて分析します。これはJMPの2つの強力なプラットフォームの素晴らしい組み合わせです。ただし、データは構成的であるため、正規化を行う必要があります。進化プラットフォームでそれを可能にする作業を行う代わりに。 JMPでいくつかの手順を踏む必要があるのは確かですが、今ではかなり実行可能です。それほど大きな手順ではありません。
JMPで直接分析できるのは本当に素晴らしいと思いますし、このように有益な洞察を導き出すことができるようになりました。ちなみに、この研究はすべて、数年前、Farzanehの研究の最中に亡くなった素晴らしい研究者、George Weinstock氏を偲んで捧げたいと考えていました。Farzanehさん、あの困難な時期を乗り越えてこられたことに心から感謝します。この研究をまとめる過程で、他にも様々な困難があったことは承知しています。しかし、本当に素晴らしい成果に仕上がったと思います。ここに掲載されている様々な実験について、今後複数の論文を発表し、このデータをお持ちの多くのお客様とも共同研究を進めていきたいと思っています。非常に期待が持て、非常に興味深い成果です。Farzanehさん、素晴らしい仕事ぶりでした。
ありがとう。
