Prove sempre più numerose dimostrano che i microbiomi influenzano diversi aspetti della fisiologia dell'ospite. Di conseguenza, adottare una prospettiva olobionte nei modelli animali rappresenta un approccio potenzialmente efficace per migliorare la comprensione di come ambiente, microbioma e genetica dell'ospite si combinino per influenzare l'insorgenza e lo sviluppo delle malattie.
Tuttavia, una delle principali sfide che i modelli animali devono affrontare è che, al di là dell'esclusione di specifici patogeni, la maggior parte dei microbiomi non è controllata e in gran parte non monitorata nei diversi allevamenti. È quindi urgente comprendere 1) le fonti di variazione del microbioma nei modelli animali e 2) l'impatto di tale variazione sul fenotipo dell'ospite.
Qui abbiamo cercato di affrontare la prima di queste due sfide. Utilizzando ceppi di sostituzione cromosomica murina (CSS) combinati con diversi approcci di partizionamento della varianza multivariata, abbiamo quantificato l'impatto relativo delle fonti di variazione ambientali e genetiche sulla composizione tassonomica del microbioma fecale.
Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo applicato l'approssimazione e proiezione uniforme del collettore (UMAP) per la riduzione della dimensionalità, seguita dall'analisi delle componenti di varianza sugli assi di ordinamento risultanti (UMAP-VC). Tutte le analisi e le visualizzazioni sono state eseguite utilizzando JMP, che ha consentito l'esplorazione interattiva dei modelli di clustering e una stima efficiente dei contributi di varianza derivanti da fattori quali struttura, ceppo, sesso e dieta.
La nostra conclusione è che l'allevamento degli animali esercita un effetto sulla composizione del microbioma che eclissa l'influenza della genetica dell'ospite, nonché di altri fattori ambientali come la dieta.
Grazie per aver partecipato oggi. Sono davvero entusiasta di questo progetto con la mia collega Farzaneh Rastegari. Come sapete, il microbioma intestinale è un argomento molto interessante e di grande attualità in termini di salute umana, e sono in corso molte ricerche molto interessanti in diversi scenari. Oggi volevamo condividere alcuni risultati davvero entusiasmanti ottenuti studiando i topi, che Farzaneh ha ottenuto nell'ambito della sua ricerca di dottorato e che ora continua a sviluppare come sviluppatrice a pieno titolo nel gruppo JMP. Sta anche sviluppando un software che aiuta a semplificare nuove routine in JMP stesso, tra cui le nuove piattaforme di normalizzazione e matrice di distanza. Ma per questo progetto di oggi, ci concentreremo su alcuni dati reali su cui Farzaneh ha lavorato in modo molto approfondito dall'inizio alla fine. È un progetto e una configurazione molto interessanti. Farzaneh, potresti portarlo via e raccontarcelo?
Ciao a tutti. Mi chiamo Farzaneh e questo è un esperimento a cui ho lavorato durante la mia ricerca di dottorato, e ne presento una parte in questo poster. Esiste una relazione e interazioni molto attive tra il microbioma e l'ospite, soprattutto nel microbioma intestinale, perché in realtà, sapendo che, ad esempio, un essere umano adulto ha circa 2,2 chili di microbi nel suo intestino. È un numero enorme. Per farlo, utilizziamo principalmente esperimenti sugli animali per scoprire queste interazioni. Un vantaggio dell'utilizzo di animali per l'esperimento è il miglioramento della riproducibilità. Inoltre, stiamo introducendo un metodo in qualche modo nuovo con cui stavamo lavorando. Si tratta di UMAP-VC, che è l'acronimo di Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components, per quantificare l'impatto correlato della variazione ambientale o genetica sulla composizione del microbioma intestinale dei topi.
Per la progettazione sperimentale, stiamo utilizzando alcuni topi. Utilizziamo topi provenienti da ceppi diversi, con diverse località e dieta, e utilizziamo anche due diverse estrazioni di DNA per questo esperimento. Ma principalmente abbiamo tre esperimenti diversi, in cui modifichiamo questi fattori in modo diverso per ogni esperimento. Potete vedere, ad esempio, per l'esperimento 1, abbiamo 220 campioni fecali di topi provenienti da due ceppi diversi che hanno... Abbiamo 10 repliche per ogni ceppo, e sono tutti maschi, nella stessa località e con la stessa dieta, ma anche in questo esperimento abbiamo due diverse preparazioni di DNA. Ogni numero qui indica il numero di categorie per ciascun fattore in quell'esperimento.
Il flusso di lavoro si riassume nel prelevare campioni da diversi topi ed eseguire l'amplificazione PCR della regione V1-V2 del gene del DNA 16S, un metodo comune per gli studi sul microbioma. Utilizzando il gene del DNA ribosomiale 16S. Dopo aver estratto tutto il DNA da quelle regioni, lo abbiamo sequenziato con il metodo di sequenziamento ad alto rendimento. In questo esperimento, utilizziamo la macchina MiSeq di Illumina. Dopo aver ottenuto tutti i risultati del sequenziamento dalla macchina, raggruppiamo tutte le sequenze in base al tipo operativo, ovvero in unità chiamate OTU, sequenze simili tra loro almeno al 97%. Dopodiché, otteniamo tutte queste OTU, che vengono codificate a barre per ciascun campione. Con tutte queste informazioni, creiamo queste tabelle in cui, ad esempio, le OTU sono disposte in righe e i campioni sono colorati.
Ogni cella rappresenta il numero di quell'OTU in quel campione. Dopo aver ottenuto tutte queste tabelle, possiamo, usando JMP, ottenere l'ordinazione UMAP e varie analisi delle componenti per visualizzare i risultati. Qui mostro alcuni dei risultati per ciascun esperimento, i tre esperimenti che ho introdotto all'inizio. Forse è meglio per la diapositiva.
Nel primo esperimento, come avete visto, avevamo 22 ceppi diversi e un altro fattore che stava cambiando era la preparazione del DNA. Conoscendo meglio questi ceppi, abbiamo due diversi ceppi consanguinei che sono in realtà omozigoti. Sono topi Black 6 e AJ come background che sono ceppi consanguinei. Abbiamo creato altri ceppi da questi sostituendo un cromosoma di AJ con il background Black 6 per creare un altro ceppo. Ad esempio, il CSS-01 è il ceppo che ha il primo cromosoma di AJ nel background Black 6. I restanti cromosomi provengono da Black 6.
Qui potete vedere il risultato di un clustering gerarchico per quei campioni, che rappresenta la composizione del microbioma per ciascuno dei ceppi. Questo clustering gerarchico è ottenuto trasformando le tabelle OTU con CLR, quindi utilizzando il break-out, questa distanza di similarità per creare questo grafico gerarchico ad anelli incrociati. Potrei forse ingrandire un po'. Come potete vedere, alcuni di quei ceppi potrebbero essere leggermente incrociati tra loro. Ma per la maggior parte del tempo, potete vedere che ogni ceppo ha un sottoalbero nel clustering gerarchico. Questo dimostra che la composizione del microbioma per quei topi dello stesso ceppo è molto simile tra loro.
Nei risultati della tabella UMAP, potete vedere che per entrambi i componenti di UMAP1 e UMAP2, abbiamo un numero totale del 99% e del 98% di... Questa variazione è dovuta ai ceppi. È un numero enorme. Qui, per la preparazione del DNA, non abbiamo avuto un impatto così grande. Era zero. Ma dal ceppo, dalla preparazione del DNA incrociato, abbiamo una piccola variazione in qualche modo. Abbiamo fatto la stessa analisi per gli altri gruppi.
Ecco gli altri due esperimenti. In questo esperimento, abbiamo fattori che variano in base a posizione, ceppo, sesso e preparazione del DNA. Li abbiamo classificati in categorie diverse. In questo esperimento, si trovano tutti nella stessa posizione, ma abbiamo ceppi diversi, diete diverse e gabbie che in qualche modo sono simili alla posizione, ma in realtà sono più simili. Lasciatemi vedere il risultato.
Per il secondo esperimento, che contiene la posizione, il ceppo, il sesso e la preparazione del DNA, questi due grafici, A e B, sono gli stessi per UMAP1 e UMAP2, ma li stiamo colorando con fattori diversi. Come potete vedere, abbiamo colorato questo grafico per ceppo e questo grafico per sesso. Le forme mostrano le posizioni. Qui, ho appena aggiunto queste linee tratteggiate per mostrare i cluster nelle posizioni. Potete vedere che questi campioni provenienti dalla stessa posizione sono ben raggruppati insieme. Tra ogni cluster di posizione, potete vedere i cluster tra i ceppi qui in questo grafico.
Inoltre, qui per diverse sezioni, colorate in base al sesso, potete vedere, ancora una volta, che per ogni ceppo, i sessi diversi si raggruppano insieme. Ma in generale, potete vedere che l'effetto della posizione è... Visivamente, possiamo vedere che ha l'effetto maggiore sulla composizione del microbioma. Quindi, all'interno di ogni posizione, il ceppo è quello più potente. Per ogni ceppo, potete vedere che il sesso è visibile per diversi settori. Questo è ciò che possiamo vedere visivamente, e anche nell'analisi effettiva delle componenti della varianza, potete vedere qui che per la posizione, l'85% della variabilità è la posizione per UMAP1 e l'83% per UMAP2, il che è enorme, e lo abbiamo già visto prima.
Come potete vedere, per UMAP1, quasi il 12% della variazione è dovuto al ceppo in totale. Abbiamo una certa variabilità incrociando il ceppo e la posizione geografica, che è la famosa regola G per E qui. Abbiamo anche un ceppo per sesso, per posizione geografica e altre variabili. Potete vedere che questi numeri mostrano come ogni fattore determini la variabilità tra questi campioni.
Abbiamo il terzo esperimento, che si svolge tutto nella stessa sede, ma con concentrazioni diverse e una dieta diversa. Per questo esperimento, abbiamo alcuni fattori metabolici, come il livello di trigliceridi, che sono stati aggiunti a un altro livello di esperimenti.
In questo esperimento, potete vedere di nuovo nel grafico di UMAP1 e UMAP2, che un ceppo ha un effetto davvero notevole nel separare i campioni l'uno dall'altro. In questo grafico, sono colorati in base al ceppo. Le forme mostrano in qualche modo la composizione in base alla dieta e all'età. Possiamo vedere all'interno di ogni cluster effettivo del ceppo, che tutte quelle forme si raggruppano di nuovo. Sembra che l'effetto età-dieta sia molto più piccolo di... L'effetto dieta è minore dell'effetto ceppo.
Questo è lo stesso grafico, ma qui abbiamo colorato i campioni in base ai diversi livelli di trigliceridi, che possiamo vedere visivamente. Ancora una volta, in alcuni ceppi o diete, possiamo avere un livello di trigliceridi più alto o più basso. Ad esempio, in questo caso, possiamo vedere che tutti tendono al blu. Ciò significa che sono bassi. Qui, o qui, o questo, sono più alti. Visivamente, possiamo vedere che questi fattori effettivi, come un ceppo o una dieta, possono modificare i livelli di trigliceridi per diversi campioni.
Di nuovo, in UMAP1 e UMAP2, un'analisi delle componenti della varianza, potete vedere tutti quei numeri che mostrano quell'effetto. Qui, il ceppo è l'effetto più elevato. È come nel primo esperimento in cui avevamo tutti quei topi anche nella stessa posizione. Poi abbiamo l'ID della gabbia. Non ho inserito alcuna colorazione dell'ID della gabbia o qualcosa del genere nel grafico perché era un po' disordinato. Avevamo troppe gabbie, ma possiamo vedere che questo ha un effetto su questo. Abbiamo un effetto di un ceppo in base alla dieta, che potete vedere in qualche modo qui nei cerchi, potete vedere livelli di trigliceridi più alti nello stesso ceppo con una dieta diversa rispetto, ad esempio, a questo, che è di nuovo lo stesso ceppo, ma con una dieta diversa.
Sulla base di tutti questi risultati, possiamo affermare che l'UMAP-VC è un approccio innovativo, che mostra sia visivamente che numericamente la variazione di diversi fattori e la variabilità tra i fattori, e attraverso la riduzione dimensionale. Quindi, come risultato scientifico, una conclusione, si può vedere che la posizione ha il maggiore effetto sul microbioma intestinale. Successivamente, il background genetico è il secondo fattore che influenza il microbioma intestinale. Infine, l'età che lo influenza. Tutti questi fattori possono influenzare i fattori metabolici, come il livello di trigliceridi. Questo è interessante. Questo è un progetto in corso nel Regno Unito, condotto dal nostro collaboratore, Jethro Johnson, presso l'Università di Oxford. Sta continuando a lavorare principalmente sulla variabilità in diverse posizioni. Questo è tutto. Questi sono i nostri riferimenti.
Molto interessante, Farzaneh. Questa ricerca per me è semplicemente affascinante. Stiamo appena iniziando a distinguere finalmente questi interessanti effetti del microbioma sulla salute e a tracciare una mappa degli aspetti con cui vogliamo relazionarci, genetica e ambiente. Penso che queste tecniche rappresentino davvero un buon passo avanti. Vorrei sottolineare, a livello tecnico, che questa analisi è ora abbastanza facile da impostare, eseguire e integrare con il nuovo lavoro svolto da Farzaneh. Le proiezioni UMAP le potevamo già realizzare utilizzando la piattaforma di embedding multivariato, che, tra l'altro, è stata sviluppata da Meichen Dong nel nostro gruppo un paio di anni fa. In alternativa, si potrebbero usare le componenti principali, ma a noi piace UMAP. Sembra adattarsi un po' meglio ai dati qui. Poi le varianti vengono elaborate utilizzando modelli misti. È una buona combinazione di due potenti piattaforme in JMP. Ma poiché i dati sono composizionali, è necessario effettuare una normalizzazione. Invece di impegnarsi per abilitarla con la piattaforma di evoluzione. Ci sono sicuramente alcuni passaggi da seguire in JMP, ma ora sono abbastanza fattibili. Non sono enormi.
Penso che siano davvero utili da analizzare direttamente in JMP, e possiamo davvero iniziare a trarre spunti interessanti come questo. Vorrei anche menzionare, a titolo di nota, che abbiamo voluto dedicare tutta questa ricerca alla memoria di George Weinstock, un brillante ricercatore scomparso qualche anno fa, proprio nel bel mezzo della ricerca di Farzaneh. Complimenti a te, Farzaneh, per aver superato quel momento difficile. So che hai dovuto affrontare diverse altre avversità mentre mettevi insieme tutta questa ricerca. Ma amico, penso che sia andata davvero a meraviglia. Stiamo cercando di pubblicare diversi articoli su questi diversi esperimenti che vedi qui, oltre a collaborare con molti dei nostri clienti che ora hanno questi dati. Molto promettente e molto interessante da vedere. Ottimo lavoro, Farzaneh.
Grazie.
