Immer mehr Forschungsergebnisse belegen, dass Mikrobiome vielfältige Aspekte der Wirtsphysiologie beeinflussen. Daher stellt die Betrachtung von Tiermodellen aus der Perspektive des Holobionten einen potenziell wirkungsvollen Ansatz dar, um das Verständnis dafür zu verbessern, wie Umwelt, Mikrobiom und Wirtsgenetik zusammenwirken und so den Ausbruch und die Entwicklung von Krankheiten beeinflussen.
Eine große Herausforderung für Tiermodelle besteht jedoch darin, dass – abgesehen vom Ausschluss bestimmter Krankheitserreger – die meisten Mikrobiome in verschiedenen Tierhaltungseinrichtungen unkontrolliert und weitgehend unüberwacht sind. Daher ist es dringend notwendig, 1) die Ursachen der Mikrobiomvariation in Tiermodellen und 2) die Auswirkungen dieser Variation auf den Phänotyp des Wirts zu verstehen.
Hier wollten wir die erste dieser beiden Herausforderungen angehen. Mithilfe von Mauschromosomen-Substitutionsstämmen (CSSs) in Kombination mit verschiedenen multivariaten Varianzzerlegungsansätzen quantifizierten wir den relativen Einfluss von Umwelt- und genetischen Variationsquellen auf die taxonomische Zusammensetzung des fäkalen Mikrobioms.
Dazu verwendeten wir Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) zur Dimensionsreduktion, gefolgt von einer Varianzkomponentenanalyse der resultierenden Ordinationsachsen (UMAP-VC). Alle Analysen und Visualisierungen wurden mit JMP durchgeführt, was die interaktive Untersuchung von Clustermustern und die effiziente Schätzung der Varianzbeiträge von Faktoren wie Einrichtung, Stamm, Geschlecht und Ernährung ermöglichte.
Unsere Schlussfolgerung ist, dass die Haltungsbedingungen der Tiere einen Einfluss auf die Zusammensetzung des Mikrobioms ausüben, der den Einfluss der Wirtsgenetik sowie anderer Umweltfaktoren wie der Ernährung in den Schatten stellt.
Vielen Dank fürs Einschalten. Ich freue mich sehr über dieses Projekt mit meiner Kollegin Farzaneh Rastegari. Wie Sie wissen, ist das Darmmikrobiom derzeit ein hochaktuelles und spannendes Thema im Bereich der menschlichen Gesundheit, und es gibt viele interessante Forschungsarbeiten zu diesem Thema. Heute möchten wir Ihnen einige besonders spannende Ergebnisse aus Farzanehs Mäusestudie vorstellen, die sie im Rahmen ihrer Doktorarbeit durchgeführt hat und nun als Entwicklerin in der JMP-Gruppe fortführt. Sie entwickelt außerdem Software, die neue Abläufe in JMP selbst erleichtert, darunter die neuen Plattformen für Normalisierung und Distanzmatrix. In diesem Projekt konzentrieren wir uns heute jedoch auf reale Daten, mit denen Farzaneh von Anfang bis Ende intensiv gearbeitet hat. Es handelt sich um ein sehr interessantes Studiendesign. Farzaneh, bitte erzählen Sie uns mehr darüber.
Hallo zusammen! Mein Name ist Farzaneh, und ich präsentiere hier einen Teil eines Experiments aus meiner Doktorarbeit auf diesem Poster. Zwischen dem Mikrobiom und dem Wirt besteht eine sehr aktive Beziehung und Wechselwirkung, insbesondere im Darmmikrobiom. Ein erwachsener Mensch beherbergt beispielsweise etwa 2,3 Kilogramm Mikroben im Darm – eine enorme Menge. Um diese Wechselwirkungen zu erforschen, nutzen wir hauptsächlich Tierversuche. Ein Vorteil von Tierversuchen ist die verbesserte Reproduzierbarkeit. Außerdem stellen wir hier eine für uns neuartige Methode vor: UMAP-VC, die Abkürzung für Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components. Mit dieser Methode quantifizieren wir den Einfluss von Umwelt- und Genvariationen auf die Zusammensetzung des Darmmikrobioms von Mäusen.
Für das Versuchsdesign verwenden wir Mäuse. Wir verwenden Mäuse verschiedener Stämme und aus unterschiedlichen Regionen mit unterschiedlicher Ernährung. Außerdem verwenden wir zwei verschiedene DNA-Extraktionsmethoden. Im Wesentlichen führen wir drei verschiedene Experimente durch, in denen wir diese Faktoren jeweils unterschiedlich variieren. Beispielsweise verwenden wir für Experiment eins 220 Kotproben von Mäusen zweier verschiedener Stämme. Wir haben zehn Replikate pro Stamm. Alle Mäuse sind männlich, stammen aus derselben Region und erhalten die gleiche Ernährung. Auch hier verwenden wir zwei verschiedene DNA-Präparationen. Die Zahlen geben jeweils die Anzahl der Kategorien für den entsprechenden Faktor im jeweiligen Experiment an.
Der Arbeitsablauf lässt sich wie folgt zusammenfassen: Wir entnehmen Proben von verschiedenen Mäusen und führen eine PCR-Amplifikation der V1-V2-Region des 16S-rDNA-Gens durch – ein gängiges Verfahren in der Mikrobiomforschung. Anschließend sequenzieren wir die extrahierte DNA mittels Hochdurchsatzsequenzierung. In diesem Experiment verwenden wir das MiSeq-System von Illumina. Die Sequenzergebnisse werden anschließend in operationelle Einheiten (OTUs) gruppiert, die mindestens 97 % Sequenzähnlichkeit aufweisen. Jede Probe erhält einen Barcode. Anhand dieser Informationen erstellen wir Tabellen, in denen die OTUs in den Zeilen und die Proben farblich dargestellt sind.
Jede Zelle enthält die Anzahl der jeweiligen OTU in der entsprechenden Probe. Nachdem wir all diese Tabellen erstellt haben, können wir mithilfe von JMP die UMAP-Ordination und verschiedene Komponentenanalysen durchführen, um die Ergebnisse zu visualisieren. Hier zeige ich einige Ergebnisse der drei Experimente, die ich eingangs vorgestellt habe. Das ist vielleicht besser für die Präsentation geeignet.
Im ersten Experiment verwendeten wir, wie Sie gesehen haben, 22 verschiedene Stämme. Ein weiterer Faktor, der variiert wurde, war die DNA-Präparation. Wir haben zwei verschiedene Inzuchtstämme, die homozygot sind. Es handelt sich dabei um Inzuchtstämme der Linien Black 6 und AJ. Durch den Austausch eines Chromosoms von AJ gegen ein Chromosom des Black-6-Hintergrunds erzeugten wir weitere Stämme. Beispielsweise besitzt der Stamm CSS-01 das erste Chromosom von AJ im Black-6-Hintergrund. Die übrigen Chromosomen stammen von Black 6.
Hier sehen Sie das Ergebnis eines hierarchischen Clusterings der Proben, das die Mikrobiomzusammensetzung der einzelnen Stämme darstellt. Dieses Clustering erfolgt durch CLR-Transformation der OTU-Tabellen und anschließende Aufschlüsselung anhand der Ähnlichkeitsdistanz zur Erstellung dieses hierarchischen Kreuzringdiagramms. Ich kann vielleicht etwas hineinzoomen. Wie Sie sehen, überschneiden sich einige Stämme leicht. In den meisten Fällen bildet jedoch jeder Stamm einen eigenen Unterbaum im hierarchischen Clustering. Dies zeigt, dass die Mikrobiomzusammensetzung von Mäusen desselben Stammes einander sehr ähnlich ist.
In der UMAP-Tabelle sehen Sie für beide Komponenten, UMAP1 und UMAP2, Werte von 99 % bzw. 98 %. Diese Variation ist auf die Stämme zurückzuführen. Das ist eine enorme Zahl. Bei der DNA-Präparation hatten wir hingegen keinen nennenswerten Einfluss. Dieser lag bei null. Durch die Stämme und die DNA-Kreuzpräparation ergaben sich jedoch geringfügige Variationen. Die gleiche Analyse führten wir für die anderen Gruppen durch.
Hier sehen wir die beiden anderen Experimente. In diesem Experiment verändern wir die Faktoren Standort, Stamm, Geschlecht und DNA-Präparation. Wir haben verschiedene Kategorien dafür. In diesem Experiment befinden sich alle Tiere am selben Ort, aber wir verwenden unterschiedliche Stämme, verschiedene Futtermittel und Käfige, die in gewisser Weise dem Standort ähneln, aber viel näher beieinander liegen. Ich schaue mir hier die Ergebnisse an.
Das zweite Experiment umfasst Standort, Stamm, Geschlecht und DNA-Präparation. Die beiden Diagramme A und B zeigen die gleichen Daten für UMAP1 und UMAP2, jedoch mit unterschiedlichen Farbskalen. Diagramm A ist nach Stamm, Diagramm B nach Geschlecht farblich gekennzeichnet. Die Formen stellen die Standorte dar. Die gestrichelten Linien markieren die Cluster innerhalb der Standorte. Proben vom selben Standort bilden deutlich gruppierte Cluster. Zwischen den Standortclustern sind weitere Cluster zwischen den Stämmen erkennbar.
Hier sieht man für verschiedene, nach Geschlecht farblich gekennzeichnete Bereiche, dass sich die Geschlechter für jeden Stamm in Gruppen zusammenfinden. Generell lässt sich jedoch feststellen, dass der Standort den größten Einfluss auf die Zusammensetzung des Mikrobioms hat. Innerhalb jedes Standorts ist der jeweilige Stamm der entscheidende Faktor. Für jeden Stamm ist der Einfluss des Geschlechts in den verschiedenen Bereichen sichtbar. Dies lässt sich visuell und auch in der Varianzanalyse beobachten: Der Standort erklärt 85 % der Variabilität von UMAP1 und 83 % von UMAP2 – ein enormer Wert, wie wir bereits festgestellt haben.
Wie man bei UMAP1 sieht, sind fast 12 % der Variation insgesamt auf den Stamm zurückzuführen. Eine weitere Variabilität ergibt sich aus der Kombination von Stamm und Standort, dem hier bekannten Gen-Umwelt-Interaktionseffekt. Zusätzlich beeinflussen Stamm, Geschlecht, Standort und andere Faktoren die Variabilität. Diese Zahlen verdeutlichen, wie die einzelnen Faktoren die Variabilität zwischen den Proben beeinflussen.
Wir haben das dritte Experiment, das komplett am selben Ort stattfindet, aber mit unterschiedlichen Versuchsstärken und unterschiedlicher Ernährung. In diesem Experiment untersuchen wir unter anderem Stoffwechselfaktoren wie den Triglyceridspiegel; dies ist ein Aspekt, der in einem anderen Experiment ebenfalls berücksichtigt wurde.
In diesem Experiment lässt sich anhand der Diagramme UMAP1 und UMAP2 erneut erkennen, dass ein bestimmter Stamm einen sehr großen Einfluss auf die Trennung der Proben hat. Die Proben sind im Diagramm nach Stamm farblich dargestellt. Die Formen spiegeln gewissermaßen die Zusammensetzung in Bezug auf Ernährung und Alter wider. Innerhalb jedes Stammclusters sind die Formen wieder eng beieinander angeordnet. Der Einfluss von Alter und Ernährung scheint deutlich geringer zu sein als der Einfluss der Ernährung selbst.
Hier sehen wir dasselbe Diagramm, nur dass die Proben hier nach ihrem Triglyceridgehalt farblich gekennzeichnet sind. Wie man sieht, kann der Triglyceridgehalt je nach Bakterienstamm oder Ernährung höher oder niedriger sein. In diesem Diagramm beispielsweise sind alle Proben blau, was auf einen niedrigen Triglyceridgehalt hindeutet. Hier, hier oder hier ist er höher. Man erkennt also, dass Faktoren wie Bakterienstamm oder Ernährung den Triglyceridgehalt verschiedener Proben beeinflussen können.
In den Varianzkomponentenanalysen UMAP1 und UMAP2 sind die entsprechenden Werte gut zu erkennen. Der Einfluss des Stammes ist hier am größten. Ähnlich wie im ersten Experiment, als sich alle Mäuse am selben Ort befanden, spielt auch hier die Käfig-ID eine Rolle. Ich habe auf eine farbliche Kennzeichnung der Käfig-IDs im Diagramm verzichtet, da dies die Übersichtlichkeit beeinträchtigt hätte. Es gab zu viele Käfige, aber der Einfluss ist dennoch sichtbar. Außerdem gibt es einen Einfluss des Stammes auf die Ernährung, der sich in den Kreisen erkennen lässt. So zeigt sich beispielsweise ein höherer Triglyceridspiegel bei Mäusen desselben Stammes mit unterschiedlicher Ernährung als bei Mäusen desselben Stammes mit anderer Ernährung.
Auf Grundlage all dieser Ergebnisse lässt sich sagen, dass UMAP-VC ein neuartiger Ansatz ist, der sowohl visuell als auch numerisch die Variation verschiedener Faktoren und deren Variabilität sowie die Dimensionsreduktion aufzeigt. Wissenschaftlich betrachtet, zeigt sich, dass der Standort den größten Einfluss auf das Darmmikrobiom hat. An zweiter Stelle folgt der genetische Hintergrund, gefolgt vom Alter. All diese Faktoren können sich auf Stoffwechselparameter wie den Triglyceridspiegel auswirken. Das ist interessant. Dieses Projekt wird derzeit in Großbritannien von unserem Kooperationspartner Jethro Johnson an der Universität Oxford weitergeführt. Er untersucht weiterhin die Variabilität an verschiedenen Standorten. Das war’s. Dies sind unsere Referenzen.
Sehr schön, Farzaneh. Diese Forschung finde ich einfach faszinierend. Wir beginnen endlich, die interessanten Auswirkungen des Mikrobioms auf die Gesundheit zu entschlüsseln und einen Zusammenhang zu erkennen, den wir mit Genetik und Umwelt in Verbindung bringen möchten. Ich denke, diese Techniken sind ein vielversprechender Ansatz. Technisch gesehen ist diese Analyse dank Farzanehs neuer Arbeit jetzt recht einfach einzurichten und durchzuführen. Die UMAP-Projektionen konnten wir bereits mit der multivariaten Einbettungsplattform durchführen, die übrigens vor einigen Jahren von Meichen Dong aus unserer Gruppe entwickelt wurde. Alternativ könnte man auch Hauptkomponentenanalysen verwenden, aber wir bevorzugen UMAP. Es scheint hier etwas besser zu den Daten zu passen. Die Varianten werden dann mithilfe von gemischten Modellen analysiert. Es ist eine gelungene Kombination zweier leistungsstarker Plattformen in JMP. Da die Daten jedoch kompositionell sind, ist eine Normalisierung erforderlich. Anstatt den Aufwand zu betreiben, dies mit der Evolutionsplattform zu ermöglichen, sind in JMP zwar einige Schritte nötig, aber jetzt gut machbar. Sie sind nicht riesig.
Ich finde, sie lassen sich direkt in JMP sehr gut analysieren, und wir können wirklich interessante Erkenntnisse wie diese gewinnen. Ich möchte auch noch erwähnen, dass wir diese Forschung George Weinstock widmen, einem brillanten Forscher, der vor einigen Jahren, mitten in Farzanehs Forschungsprojekt, verstorben ist. Hut ab, Farzaneh, dass du diese schwierige Zeit durchgestanden hast. Ich weiß, dass du während der Durchführung dieser Forschung noch einige andere Hürden überwinden musstest. Aber ich finde, das Ergebnis ist wirklich hervorragend. Wir planen, mehrere Artikel zu diesen verschiedenen Experimenten zu veröffentlichen und mit vielen unserer Kunden, die diese Daten nutzen, zusammenzuarbeiten. Es ist sehr vielversprechend und äußerst interessant, das zu sehen. Großartige Leistung, Farzaneh!
Danke schön.
