De plus en plus de données probantes montrent que les microbiomes influencent divers aspects de la physiologie de l'hôte. Par conséquent, l'adoption d'une perspective holobionte chez les modèles animaux représente une approche potentiellement puissante pour mieux comprendre comment l'environnement, le microbiome et la génétique de l'hôte interagissent pour influencer l'apparition et le développement des maladies.
Cependant, un défi majeur pour les modèles animaux réside dans le fait que, hormis l'exclusion de pathogènes spécifiques, la plupart des microbiomes sont incontrôlés et largement non surveillés d'un élevage à l'autre. Il est donc urgent de comprendre : 1) les sources de variation du microbiome chez les modèles animaux ; et 2) l'impact de cette variation sur le phénotype de l'hôte.
Nous avons cherché ici à répondre au premier de ces deux défis. En utilisant des lignées de souris à substitution chromosomique (CSS) combinées à différentes approches de partitionnement de la variance multivariée, nous avons quantifié l'impact relatif des sources de variation environnementales et génétiques sur la composition taxonomique du microbiome fécal.
Pour ce faire, nous avons appliqué l'approximation et la projection de variétés uniformes (UMAP) afin de réduire la dimensionnalité, puis nous avons effectué une analyse des composantes de la variance sur les axes d'ordination obtenus (UMAP-VC). Toutes les analyses et visualisations ont été réalisées à l'aide de JMP, ce qui a permis une exploration interactive des modèles de regroupement et une estimation efficace des contributions de facteurs tels que l'établissement, la souche, le sexe et le régime alimentaire.
Notre conclusion est que les installations animales exercent sur la composition du microbiome un effet qui surpasse l'influence de la génétique de l'hôte, ainsi que d'autres facteurs environnementaux tels que l'alimentation.
Merci de nous rejoindre aujourd'hui. Je suis vraiment enthousiaste à propos de ce projet avec ma collègue, Farzaneh Rastegari. Comme vous le savez, le microbiome intestinal est un sujet d'actualité passionnant en matière de santé humaine, et de nombreuses recherches très intéressantes sont menées dans différents contextes. Aujourd'hui, nous souhaitions partager des résultats particulièrement intéressants obtenus par Farzaneh sur des souris dans le cadre de sa thèse de doctorat, recherches qu'elle poursuit désormais en tant que développeuse à part entière au sein du groupe JMP. Elle développe également un logiciel qui facilite l'intégration de nouvelles routines dans JMP, notamment les nouvelles plateformes de normalisation et de matrice de distance. Mais pour ce projet d'aujourd'hui, nous allons nous concentrer sur des données réelles que Farzaneh a analysées en profondeur du début à la fin. Il s'agit d'une conception et d'une configuration très intéressantes. Farzaneh, pourriez-vous nous en parler plus en détail ?
Bonjour à tous. Je m'appelle Farzaneh et je vous présente ici une partie d'une expérience menée dans le cadre de ma thèse de doctorat. Il existe une relation et des interactions très actives entre le microbiome et l'hôte, notamment au niveau du microbiome intestinal. En effet, un adulte humain abrite environ 2,3 kg de microbes dans son intestin, ce qui est considérable. Pour étudier ces interactions, nous utilisons principalement des expériences sur des animaux. L'un des avantages de cette approche est l'amélioration de la reproductibilité des résultats. De plus, nous présentons ici une méthode relativement nouvelle que nous avons développée : l'UMAP-VC (Uniform Modified Approximation and Projection, Variance Components), qui permet de quantifier l'impact des variations environnementales ou génétiques sur la composition du microbiome intestinal de souris.
Pour notre protocole expérimental, nous utilisons des souris de différentes souches, provenant de différents lieux d'élevage et soumises à différents régimes alimentaires. Nous utilisons également deux méthodes d'extraction d'ADN différentes. Nous menons principalement trois expériences distinctes, chacune faisant varier ces facteurs. Par exemple, pour la première expérience, nous disposons de 220 échantillons fécaux de souris appartenant à deux souches différentes. Chaque souche est échantillonnée en 10 réplicats. Il s'agit de souris mâles élevées au même endroit et soumises au même régime alimentaire. Là encore, nous utilisons deux méthodes de préparation d'ADN différentes. Chaque chiffre indique le nombre de catégories pour chaque facteur dans l'expérience correspondante.
Le protocole expérimental consiste à prélever des échantillons de différentes souris et à réaliser une amplification PCR de la région V1-V2 du gène d'ADN ribosomique 16S, une méthode courante pour les études du microbiome. Après extraction de l'ADN de ces régions, nous l'avons séquencé par séquençage à haut débit. Dans cette expérience, nous avons utilisé la plateforme MiSeq d'Illumina. Les séquences obtenues ont ensuite été regroupées en unités opérationnelles (OTU), c'est-à-dire des séquences similaires présentant une similarité d'au moins 97 %. Chaque OTU a ensuite été identifié par un code-barres spécifique à un échantillon. Ces informations nous ont permis de créer des tableaux présentant les OTU en lignes et les échantillons par couleur.
Chaque cellule représente le nombre d'OTU correspondants dans l'échantillon. Une fois ces tableaux obtenus, nous pouvons, à l'aide de JMP, réaliser une ordination UMAP et diverses analyses en composantes principales afin d'observer les résultats. Je présente ici quelques résultats pour chacune des trois expériences que j'ai introduites au début. Cela sera peut-être plus clair sur la diapositive.
Dans la première expérience, comme vous l'avez vu, nous avions 22 souches différentes, et un autre facteur variable était la préparation de l'ADN. En connaissant mieux ces souches, nous avons identifié deux lignées consanguines homozygotes : les souris Black 6 et AJ. Nous avons créé d'autres lignées à partir de celles-ci en remplaçant un chromosome AJ par un chromosome Black 6. Par exemple, la lignée CSS-01 possède le premier chromosome AJ sur un fond génétique Black 6, les autres chromosomes provenant de Black 6.
Vous pouvez observer ici le résultat d'un regroupement hiérarchique appliqué à ces échantillons, représentant la composition du microbiome de chaque souche. Ce regroupement est obtenu par transformation CLR des tables d'OTU, puis par utilisation de la distance de similarité pour construire ce graphe hiérarchique en anneau croisé. Un léger zoom est possible. Comme vous pouvez le constater, certaines souches peuvent se chevaucher légèrement. Cependant, la plupart du temps, chaque souche possède un sous-arbre dans le regroupement hiérarchique. Cela indique que la composition du microbiome des souris d'une même souche est très proche.
Dans le tableau des résultats UMAP, on constate que pour les deux composantes UMAP1 et UMAP2, les pourcentages sont respectivement de 99 % et 98 %. Cette variation est due aux souches. C'est un nombre important. La préparation d'ADN n'a eu qu'un impact négligeable, voire nul. En revanche, la préparation d'ADN croisée entre les souches induit une légère variation. Nous avons effectué la même analyse pour les autres groupes.
Voici les deux autres expériences. Dans cette expérience, les facteurs suivants varient : lieu, souche, sexe et préparation de l’ADN. Nous les avons catégorisés différemment. Dans cette autre expérience, les animaux sont tous au même endroit, mais avec des souches, des régimes alimentaires et des cages différents. Ces cages, bien que similaires au lieu initial, sont en réalité plus proches. Voici les résultats.
Pour la deuxième expérience, qui inclut la localisation, la souche, le sexe et la préparation d'ADN, les graphiques A et B sont identiques pour UMAP1 et UMAP2, mais la coloration diffère. Comme vous pouvez le constater, le premier graphique est coloré selon la souche et le second selon le sexe. Les formes représentent les localisations. J'ai ajouté des lignes pointillées pour visualiser les regroupements au sein de ces localisations. On observe que les échantillons provenant d'une même localisation sont bien regroupés. Entre chaque regroupement de localisation, on distingue également des regroupements entre les souches.
Ici aussi, pour différentes sections colorées selon le sexe, on observe, là encore, que pour chaque souche, les individus de sexes différents se regroupent. De manière générale, l'effet de la localisation est prépondérant. Visuellement, on constate que c'est le facteur qui influence le plus la composition du microbiome. Ensuite, au sein de chaque localisation, c'est la souche qui joue un rôle prépondérant. Pour chaque souche, le sexe est visible dans différentes zones. C'est ce que l'on observe visuellement, et c'est également ce que révèle l'analyse de variance. On constate ici que, pour la localisation, 85 % de la variabilité est attribuable à la localisation pour UMAP1 et 83 % pour UMAP2, ce qui est considérable, comme nous l'avons déjà vu.
On constate que pour l'UMAP1, près de 12 % de la variation totale est due à la souche. On observe une certaine variabilité liée à l'interaction entre la souche et le lieu, un phénomène connu sous le nom d'interaction gène-environnement. On observe également une interaction entre la souche, le sexe, le lieu et d'autres facteurs. Ces chiffres illustrent comment chaque facteur contribue à la variabilité entre les échantillons.
Nous avons une troisième expérience menée au même endroit, mais avec des groupes de différentes forces et régimes alimentaires. Pour cette expérience, nous avons mesuré certains facteurs métaboliques, notamment le taux de triglycérides ; il s'agit d'un paramètre ajouté à un autre niveau d'expérimentation.
Dans cette expérience, comme le montrent les graphiques UMAP1 et UMAP2, on constate que la souche influence fortement la composition des échantillons. Sur ce graphique, les échantillons sont colorés selon leur souche. Les formes représentent en quelque sorte l'influence du régime alimentaire et de l'âge. À l'intérieur de chaque groupe, on observe que les formes se regroupent. L'effet du régime alimentaire et de l'âge semble donc nettement inférieur à celui de la souche.
Voici le même graphique, mais nous avons coloré les échantillons en fonction de leur taux de triglycérides. On constate visuellement que, selon les souches ou le régime alimentaire, ce taux peut être plus élevé ou plus faible. Par exemple, sur ce graphique, la plupart des échantillons sont bleus, ce qui indique un faible taux. Ici, là, et encore ici, le taux est plus élevé. Visuellement, on observe que des facteurs tels que la souche ou le régime alimentaire peuvent modifier le taux de triglycérides des différents échantillons.
Encore une fois, dans les graphiques UMAP1 et UMAP2, l'analyse des composantes de la variance permet de visualiser tous ces chiffres illustrant cet effet. Ici, la souche présente l'effet le plus important. C'est comme dans la première expérience où toutes les souris étaient placées au même endroit. Ensuite, nous avons l'identifiant de la cage. Je n'ai pas utilisé de couleur pour les identifiants de cage sur le graphique, car cela le rendait difficile à lire. Nous avions trop de cages, mais on constate tout de même un effet. Nous observons un effet de l'interaction entre la souche et le régime alimentaire, visible ici par les cercles : on constate un taux de triglycérides plus élevé chez la même souche soumise à un régime alimentaire différent de celui observé ici, par exemple, pour la même souche soumise à un régime alimentaire différent.
D'après ces résultats, l'UMAP-VC représente une approche novatrice, tant visuellement que numériquement, illustrant la variation de différents facteurs, leur variabilité et la réduction de dimensionnalité. En conclusion, on constate que la localisation est le facteur ayant l'influence la plus importante sur le microbiote intestinal. Vient ensuite le patrimoine génétique, puis l'âge. Tous ces facteurs peuvent affecter les taux de métabolites, comme le taux de triglycérides. Ce projet est en cours au Royaume-Uni, mené par notre collaborateur Jethro Johnson à l'Université d'Oxford. Il poursuit principalement ses travaux sur la variabilité en fonction de la localisation. Voilà pour nos références.
Très bien, Farzaneh. Cette recherche est vraiment fascinante. Nous commençons enfin à décrypter les effets intéressants du microbiome sur la santé et à établir un lien avec les facteurs que nous souhaitons relier, comme la génétique et l'environnement. Je pense que ces techniques représentent une excellente piste à explorer. Sur le plan technique, je tiens à préciser que cette analyse est désormais assez simple à mettre en place, à exécuter et à exploiter grâce aux nouveaux travaux de Farzaneh. Nous pouvions déjà réaliser les projections UMAP à l'aide de la plateforme d'intégration multivariée, développée par Meichen Dong de notre équipe il y a quelques années. On pourrait également utiliser l'analyse en composantes principales, mais nous privilégions UMAP. Cette méthode semble mieux adaptée aux données. Les variants sont ensuite analysés à l'aide de modèles mixtes. C'est une combinaison intéressante de deux plateformes puissantes de JMP. Cependant, la nature compositionnelle des données nécessite une normalisation, ce qui nous évite de développer cette fonctionnalité avec la plateforme d'évolution. Il y a effectivement quelques étapes à suivre dans JMP, mais c'est tout à fait faisable maintenant. Ce n'est pas très compliqué.
Je pense que ces données sont vraiment intéressantes à analyser directement dans JMP, et nous pouvons ainsi en extraire des informations précieuses. Je voulais également mentionner, à titre personnel, que nous souhaitions dédier ces recherches à la mémoire de George Weinstock, un chercheur brillant décédé il y a quelques années, en plein milieu des travaux de Farzaneh. Bravo à toi, Farzaneh, pour avoir surmonté cette période difficile. Je sais que tu as dû faire face à de nombreuses autres difficultés pendant la réalisation de ces recherches. Mais franchement, le résultat est magnifique. Nous prévoyons de publier plusieurs articles sur ces différentes expériences et de collaborer avec de nombreux clients qui possèdent ces données. C'est très prometteur et passionnant. Beau travail, Farzaneh !
Merci.
