Cerba Researchは、世界中の臨床試験向けにカスタマイズされた最高水準の分析・診断ソリューションを提供する、世界的に名高い企業です。Cerba Research Montpellierでは、専任チームが免疫組織化学プロトコルをカスタマイズし、患者の組織切片内の特定の標的発現を検出します。プロトコル開発に対する需要の高まりに対応し、プロセスの収益性を向上させるため、開発期間の短縮とコスト削減が不可欠であると認識しています。
開発すべきカスタムプロトコルの多様性を考慮すると、従来のOFAT（一度に1つの因子のみを対象とする）アプローチではもはや十分ではありません。そこで、JMPを用いて、カスタム設計や空間充填設計など、さまざまな実験計画法（DOE）手法を比較する詳細な評価を実施しました。これらのDOEアプローチは、以前に開発されたOFATプロトコルと比較して評価されます。本稿では、費用対効果と品質の観点から、OFATアプローチとDOEアプローチの比較優位性を示すデータを提示します。
こんにちは。マリー・ジェラス＝デュランと申します。セルバ・リサーチでバリデーションエンジニアとして勤務しております。本日は、免疫組織化学の臨床プロトコルを策定する際に、実験計画法を用いることでコスト削減と品質向上を実現できる方法をご紹介します。セルバ・リサーチは世界各地に事業を展開するグローバル企業です。私が所属する部署を黄色でハイライト表示しました。
病理学と免疫組織化学部門です。免疫組織化学の主な研究部門は、私が勤務しているモンペリエにあります。免疫組織化学とは何ですか？免疫組織化学とは、組織中のタンパク質や様々な標的を研究することです。生検を行うと、組織を切り出してスライド標本を作成し、抗体ベースの技術を使用して、顕微鏡やスキャナーでデジタル画像として見ることができる組織上の様々な標的を検出します。
例えば、ここには赤い染色が施されたきれいなターゲットが見える皮膚組織があります。Cerba Research Montpellier では、クライアント向けのプロトコル設定に関する活動が全体の 4 分の 1 を占めています。クライアントは 50 社以上あります。これらのお気に入りのターゲットはそれぞれです。臨床試験のプロトコル設定の分野全体で競争力を維持するためには、迅速に最良の開発戦略を実行できることが私たちにとって重要です。
こちらは別の染色例です。最初の例で使用する染色法です。お見せします。これはIHCによる茶色の標的の検出です。このプロトコルでは、1つの標的のみを検出できます。これをシンプレックスと呼び、私たちが普段行っていることの多くに当てはまります。
私たちの実際のアプローチは、一度に1つの要素ずつ検討していくというものです。まず、認識対象となる標的組織における抗原のアクセス可能性を評価し、次に抗体の滴定を行い、最適なシグナル対比が得られる条件を見つけ出します。必要に応じて、さらに最適化を行います。ここにある各矢印は開発プロトコルのステップを表しており、各ステップは少なくとも1つの自動サイクルに相当します。各サイクルは、依頼からテスト結果が出るまで少なくとも4日間かかります。
助成金の収益性と開発するプロトコルの数を向上させるには、最適なプロトコルに到達するまでの時間とテストの数を減らす必要があります。ここでは、私たちの戦略を概略的に説明します。抗体なし、または定義された抗体コンサルテーションの2つの抗原アクセス条件をテストし、4つのポイントを取得します。次に、最も良いものを選択します。つまり、より多くのポイントを持つ条件2で抗体の滴定を行います。しかし、実際には、最適なポイントがテスト範囲外の条件1のどこかにあった場合はどうでしょうか？
これを見ると、JNPのウェビナーで見た実験計画法を強く思い出します。これはマニュアルルームのスライドの一例で、現在私たちが使用している手法を、一度に1つの要因ずつ変更しながら実験計画法（DOE）と比較しています。すると、実験領域をより広くカバーできることがわかります。これは、私たちの実験設定において大きな改善点となり得ます。そこで、試してみることにしました。
まず、最も単純なことから始めます。これからお見せするように、この問題ではターゲットを1つだけ検出する、シンプルなプロトコル開発です。最初に制約とパラメータを定義します。この実験で使用するオートマトンでは、独立した位置があります。実験計画法の1つのテストと組み合わせると、オートマトン内の1つのスライドになります。応答と要因を定義する必要があります。
分析したい応答は信号強度です。これを最大化し、バックグラウンドを最小化したいと考えています。この段階で調整できる因子は、カテゴリ変数である抗原賦活化と、連続変数である一次抗体濃度です。では、実験計画法を見ていきましょう。ここでは、異なる実験計画法を比較することにしました。
カスタムデザインと空間充填デザインをお見せします。このデザインは一緒に設定します。DOEプラットフォームにアクセスしてカスタムデザインを選択し、昨年の応答と因子または応答をここに入力する必要があります。最初の要素は、最大化したい信号強度です。
信号なしのゼロから信号ありの３までの任意の値で評価すると仮定し、ここに別の応答を追加します。これは最小化したいバックグラウンドなので、今回は最小化する必要があります。ここにバックグラウンドを配置します。同様に、ゼロはバックグラウンドなし、３は非常に高いバックグラウンドであり、次に係数を追加します。
少し分かりにくかったので、お見せしましょう。因子としては、2段階のカテゴリ因子である抗原回収があります。これは簡単に変更できます。また、通常PH6とPH9の2つのPHがあります。これはオートマトンによって呼び方が異なりますが、実際には問題ありません。
連続因子として抗体濃度があります。通常、これは10と最大値でテストするので、0から10まで変化させます。こうすると、共変量はなくなります。先ほど申し上げたように、最も単純なものを選びました。モデルを続けます。考えられるすべての相互作用を確認したいので、RSMを実行します。繰り返しは行いません。中心点も使用しません。すでに最も単純なものに移動しました。デフォルトでそれがわかると思います、と彼女は言いました。
11 個の 1 個を実行する必要があります。11 個は通常、私たちが実行しているものと一致しているので問題ありません。JNP 17 にあるこの設計エクスプローラーを活用するには、ここをクリックして、OK と言います。別の設計を探索してみましょう。クリックすると、再び因子、モデルが表示され、さまざまなオプションがあります。左側では、設計ごとに表現するだけです。右側では、組み合わせを行うことができます。RSM では通常、アイ オプティミリティを実行しますが、たとえば、実行回数を変えて試したいとします。
最低でも5としましょう。例えば、ここから始めて、11まで上げていきます。例えば、15まで、ステップを1としたらどうでしょう。中心点は特に気にしませんが、試してみてどうなるか確認し、再現してみましょう。再現した方が良いでしょう。
「すべてのデザインを生成」をクリックすると、さまざまなパラメータでデザインが作成されました。そこで「目の最適性」を選択したので、すべての箇所で目の最適性が確保されます。次に、5番目から15番目の実行を選択すると、繰り返し実験が行われます。
そうはなりませんでしたが、5 の複製があります。理由はわかりませんが、大丈夫です。たとえば 7 の場合、複製が 2 つあり、すべて同じ 1 つまたは 0 つです。中心点についても、可能な場合は中心点が 1 つまたは 2 つあります。下部にはリネン テーブルがあるので、作成でき、素敵な列が追加されます。
これは、それらすべてに合わせてカスタムデザインされています。この表でデザインを選択すると、[カスタムデザイン] をクリックして、表のコストが開きます。ここでは、グラフを作成して、「よし、見てみよう。効率は、フロントの数に応じて、私がやります」と言うことができるので便利です。
ご覧のとおり、この2つの間には強い相関関係があります。列切り替え機能を使って、他の変数を追加して見ることができます。ここでは、ランと中心点、そして繰り返しも表示したいと思います。すみません、忘れていました。ランを選択する方法でしたが、とにかく、ここにランが表示されています。
センターポイントは良い影響を与えていないようで、複製もできないので、準備は整ったようです。ラン数を調整してみましょう。ラン数を確認すれば、この結果に戻ってくるでしょう。ユーザーとセンターポイントをブロックして、参照番号だけを見るようにします。
すべて削除したわけではありません。事前にすべて削除しておくことをお勧めします。そうしないと、すべて追加されてしまいます。すべて削除しました。選択しただけです。メモを取っていませんでした。すみません。それを取得するので、選択されたものを選択することにします。つまり、12 回実行します。
ちょっとここに戻って、「わかりました。デフォルト値は11ですか？」と聞きます。実際には、同位体を含む抗体を全く使用しない2つのネガティブコントロールを確実に取得したいので、10とします。
10個の要素でデザインを作成し、手動で2つのコントロールを追加します。ご覧のように、これは小さなデザインです。わずか10秒で、ここに表が表示されます。実際には、実行するたびに、ここに表示される数値が異なります。以前に作成したものを使用します。このスクリプトを実行するだけです。お見せしている他の誰ともまったく同じデータが得られます。ここに表が表示されているので、異なっていることがわかります。
濃度は0か10か5しかありませんが、これを安定させておきましょう。表を見ると、モデルと設計の評価が既に表示されています。DOEダイアログボックスに戻ることができます。評価は、2つの設計を比較したいので、今回は行いません。今回は、先ほど持ってきた設計を、最後に各ポイントごとに複製します。
重複を要求していなくても、重複が出てきました。実験空間のこの領域をカバーしています。空間充填設計を試してみます。同じです。良いDOEですが、今回は特殊目的設計で、ここで空間充填、そして私があなたに見せたいものなので、カスタム設計に戻る必要があります。設計を比較したいのですが、応答と要因は同じになります。応答と要因を保存するだけで済みます。ああ、写真を保存するのと同じように、応答を保存するだけです。
それから、スペース充填デザインに戻ると、応答を読み込むことができます。すみません。ウィンドウを選択しておく必要がありますので、それを見つけてください。要因についても同様で、要因を書きました。制約はありません。もう一度言いますが、保証の数は20ですが、2つのデザインを比較したいので、10個同じようにします。
私には選択肢がありません。ただ柔軟な感覚です。このデザインが生成され、今回は濃度が0105のように厳密ではないことがわかります。濃度の範囲が非常に広く、テーブルも同じように作成できます。これらすべてを閉じることができます。カスタムデザインに関しては、私が作成したものを再実行したので、まったく同じ数値が得られ、デザインを比較したかったのです。デザインをどのように比較するのですか？ああ、まず。すみません。忘れていました。
ご覧のとおり、抗体濃度の変動は同じではありません。ここにあるコントロール以外に重複はありません。これはより広い範囲の抗体濃度をカバーしており、実際には私たちが求めているものに適しています。
デザインを比較したかったんです。まず、それぞれのデザインがカバーする領域が異なるので、図で比較できます。私の考えでは、空間充填法ではより多くの抗体濃度を試すことができるので、それは良い点かもしれませんが、デザインを比較することもできます。DOEにはデザイン診断があり、デザインを比較できるので、両方持っていることがわかります。
すでに Fast Flexible があるので、カスタム デザインを追加します。列名は同じなので、列はそれほど必要ありません。彼はそれを実行するので、要因を日付にまとめます。Fast Flexible の場合、正確にはゼロから始まるわけではなく、10 まで上がるわけでもありませんが、ほぼそこにあります。それらを消去するためにモデルを作成します。これにはカテゴリカル ファクターを含めることはできませんが、含めることができます。抗体ごとの抗体と抗体ごとの抗原のリスク 報酬に戻りましょう。ファクター 2 で抗原を取得することはできませんが、問題ありません。デザイン評価に進みます。
だから、一つずつやらなかったんです。比較したかったんです。ここで青色で示されているのは、パワー プロットで、オレンジ色で示されているのはカスタム デザインです。ご覧のとおり、モデルの決定の 4 つの点で、カスタム デザインの方がファスト フレキシブル デザインよりも優れているように見えます。デザイン スペース プロットの割合を見ても、同じです。
カスタムデザインの方がより適切のようです。デザイン診断を比較すると、カスタムデザインとの比較になります。つまり、カスタムデザインでは値が1つ増えますが、高効率、高速で柔軟なデザインを求めると7つ開くので、センサーのカスタムデザインよりも効率が30%低いとしましょう。これは私がここに書いたものです。
ここで紹介するのは 3 つの診断だけですが、カスタム デザインの方がスペース フィル ワンよりも優れているようです [聞き取れない 00:18:18]。結果が何を示しているか見てみましょう。プロファイラは [聞き取れない 00:18:26] を入力した後に取得されます。データの例をお見せするために、ここに DOE テーブルがあります。信号強度とバックグラウンド レスポンスを追加したので、画像を見て、強度がない、少しある、もっとある、などと言います。両方のデザインで同じことをしました。
こちらも同じです。そうでなければ、2 回の実行、つまり 2 つの異なるデータセットになります。最後に、モデルを作成しました。モデルをクリックするだけです。標準的な 2 乗法効果スクリーニングであることがわかります。ここにすべての相互作用があり、すべてを一緒に適合させました。削除できる因子がいくつかありますが、すべてを残すことにしました。次に、プロファイラーに移動します。最良の条件を見ると、実行されたように障害を最大化します。
強度を最大化します。ご覧のように、ここで最高点に達し、バックグラウンドを最小化して、この条件を見つけました。その後、信号強度を最大化したいわけではないかもしれないと気づきました。ターゲットに一致させたいだけです。なぜなら、ここで使用しているサンプルは、低発現のサンプルではない可能性があるので、ターゲットの低発現を検出できるようにしたいからです。
少し変更して、「わかりました」と言います。ターゲットに合わせたいのですが、それは中程度の強度です。診断されたものではなく、中間の強度です。バックグラウンドは好ましくないので、バックグラウンドを最小限に抑えたいです。ここで望ましさを最大化すると、使用する抗体の濃度が変わることがわかります。これは、ここで得られたものとほぼ同じです。少し数値が違うかもしれませんが、問題ありません。同じことをしましたが、これはFast Flexible Designでも同じです。
私は2つの異なる条件を得ました。1つはCC2に抗体が3.8近くある場合、もう1つはCC2に2つある場合です。ここではPHCCN9ではありません。この自動装置ではCC1とCC2と呼ばれていますが、同じものです。それで、わかりました。この2つの条件があります。最初のプロトコルと比較します。
つまり、私たちの基準となるのは、先ほどお見せした画像のような、標準的なブラシです。ここには、カスタムデザイン条件とスペース充填デザイン条件があります。ご覧のとおり、これら2つの条件は、少なくとも同等、あるいはそれ以上に優れたデータを提供します。スペース充填データは、より高濃度の抗体をテストするために作成しました。これは、難しいターゲットを扱う場合に役立ちます。
これを選びます。というのも、ここに示されている2つの条件は、実際にはスペース充填設計に存在していたからです。スペース充填設計にデータがあったので、条件に対して実行する必要はありませんでした。この画像は、それがうまく機能していることを二重に確認するためのものです。別のプロトコルでテストするためにスペース充填設計を選択しました。それが機能するかどうかを確認するためです。
すべてを調べなくてもいいんです。同じ紙を使って、新しいターゲットに合わせて反応を変えるだけです。中心強度の2つのターゲットに合わせ、バックグラウンドを最小限に抑えるモデルが得られました。彼は、CC2条件で男性1人あたり2.8マイクログラムの抗体が必要だと言いました。
私たちが開発したプロトコルと比較すると、CC1と5マイクログラムのプログラムと言われていたので、同じではありません。両方とも変更されていますが、画像でわかるように、Space Filing Designによって定義された同じプロトコルは、私たちが通常開発しているものと少なくとも同等です。運用担当者と管理者を納得させるために不足しているのは、間違いなくコストと時間です。ここで提案する設計アプローチです。
まず、カスタムデザインとスペースフィリングデザインについて、すべてを設計するのにかかった時間を、当社の標準的なアプローチと比較します。このグラフでは、当社の標準的なアプローチは青色、スペースフィリングは赤色、カスタムデザインは緑色で示されています。比較対象は、時間のかかるサイクル数、スライド数、設計からプロトコル作成までの時間、リクエストを受けてから予約するまでの時間です。
技術的な要求から調査までの時間を見ると、技術チームにとって新しいやり方であるにもかかわらず、すべてを設計する必要があったにもかかわらず、結果が出るまでの時間を短縮できました。次に、2つ目の例ですが、すべてを再度設計する必要はありませんでした。このアプローチを新しい実際のアプローチとして採用した場合、次のステップで私たちが行う可能性が高いのはこれなので、このプロジェクトで使用されている標準的なアプローチと比較します。
青色で、縞模様の赤色で、DOE セットアップを配置し、比較サイクルを押しました。これは、参照プロトコルがあるためです。比較サイクルを実行しましたが、新しいアプローチを使用する場合は、参照がないため比較サイクルは実行しません。DOE セットアップのみを実行し、赤色で示します。ご覧のとおり、サイクル数、サイト数、使用した抗体の数が減少し、最終結果の日数は ALF だけ短縮され、非常に良い結果となっています。
結論として、私はスティーブ・ジョブズのこの言葉が好きです。「小さく始めて、大きく考えよう」。最初は、これらすべてを見て[聞き取れない 00:24:53]ああ、いいけど、適用できるのかと思いました。少し苦労しましたが、よし、最もシンプルな方法で始めようと言って、このシンプルなIHCのために設定し、考えたときにさらに迅速に設定するようにマネージャーを説得しました。それから運用チーム、そして最終的には他のリーダーにも、このアプローチがIHCに適用できると納得させました。
現在のように最適化が必要になった場合、開発が容易か困難かは最初から分からないため、保証することはできません。次のステップとして、研究室にマルチプレックスセットアップを導入したいと考えています。これは、同じ組織上の複数のターゲットを検出するもので、最初は抑制されたターゲットに対して2つのターゲットから始め、最大5つのターゲットまで増やしていくものです。これは現在進行中です。
最後に、感謝の意を表したいと思います。私の抄録を選考してくださった運営委員会に感謝いたします。また、Cerba Research Montpellierのチーム、そして私の突飛なアイデアについていくのが時々大変な実験室の技術者にも感謝いたします。
私のマネージャーは、新しい戦略や物事の新しい見方を既にサポートしてくれており、コンセプトと検証チーム全員もこのテストで私をフォローしてくれています。JNP フランスチームのステファンにも感謝したいと思います。サポートしてくれて、あらゆる質問をしてくれたおかげで、この新しい JNP 17 人（16 人）をロードすることができ、デザイン探求の素晴らしいプラットフォームを見ることができました。皆さんの注目に感謝します。
