Cerba Research è un'azienda di fama mondiale specializzata nella fornitura di soluzioni analitiche e diagnostiche di altissimo livello, personalizzate per studi clinici in tutto il mondo. Presso Cerba Research Montpellier, il nostro team dedicato personalizza i protocolli di immunoistochimica per rilevare specifiche espressioni target all'interno di sezioni di tessuto dei pazienti. Per far fronte alla crescente domanda di sviluppo di protocolli e migliorare la redditività dei processi, riconosciamo l'importanza fondamentale di ottimizzare i tempi di sviluppo e ridurre i costi.
Data la diversità dei protocolli personalizzati da sviluppare, l'approccio OFAT (un fattore alla volta) convenzionale non è più sufficiente. Abbiamo pertanto intrapreso una valutazione approfondita, confrontando diverse metodologie di progettazione degli esperimenti (DOE), tra cui la progettazione personalizzata e la progettazione a riempimento di spazio, utilizzando JMP. Questi approcci DOE sono stati valutati rispetto a protocolli OFAT precedentemente sviluppati. Presentiamo dati che illustrano i vantaggi comparativi degli approcci OFAT e DOE, in termini di rapporto costi-efficacia e qualità.
Salve. Sono Marie Gérus-Durand e lavoro presso Cerba Research come ingegnere di validazione. Oggi vi mostrerò come possiamo ridurre i costi e migliorare la qualità utilizzando la progettazione degli esperimenti nella definizione dei protocolli clinici di immunoistochimica. A titolo informativo, Cerba Research è un'azienda globale con attività in tutti i continenti. Ho evidenziato in giallo il dipartimento in cui lavoro.
Si tratta del dipartimento di patologia e di immunoistochimica (IHC). Il principale dipartimento di ricerca per l'IHC ha sede a Montpellier, dove lavoro. Cos'è l'immunoistochimica? L'immunoistochimica è uno studio delle proteine o di vari bersagli nei tessuti. Quando si effettuano biopsie, si tagliano sezioni di tessuto e si utilizza una tecnologia basata sugli anticorpi per rilevare diversi bersagli di un terrorista sul tessuto, che possiamo osservare al microscopio o con uno scanner, su immagini digitalizzate.
Qui, ad esempio, avete un tessuto cutaneo dove vedete un bel bersaglio, colorato di rosso. Oltre un quarto delle nostre attività sono in protocolli impostati per i nostri clienti presso Cerba Research Montpellier. Abbiamo più di 50 clienti. Ognuno di questi è un bersaglio preferito. Per noi è fondamentale essere in grado di essere rapidi nella migliore strategia di sviluppo per rimanere competitivi in un intero settore di un protocollo impostato per gli studi clinici.
Ecco un esempio di un'altra colorazione, ed è la colorazione che userò nel primo esempio. Ve la mostrerò. Si tratta del rilevamento di un bersaglio in marrone tramite IHC, quindi questo protocollo ha permesso di rilevare un solo bersaglio. Lo chiamiamo simplex, ed è gran parte di ciò che facciamo.
Il nostro approccio attuale prevede di considerare un fattore alla volta: innanzitutto, valutiamo l'accessibilità dell'antigene al tessuto per i bersagli da riconoscere, poi effettuiamo una titolazione dell'anticorpo per trovare la condizione ottimale che fornisca il miglior rapporto segnale/rumore e, se necessario, eseguiamo ulteriori ottimizzazioni. Ogni freccia rappresenta una fase del protocollo di sviluppo, e ogni fase corrisponde ad almeno un ciclo di elaborazione automatizzato, con una durata di almeno quattro giorni dalla richiesta ai risultati del test.
Per migliorare la redditività dei nostri finanziamenti e il numero di protocolli sviluppati, dobbiamo ridurre i tempi e la quantità di test necessari per arrivare al protocollo ottimizzato. Qui schematizzo la nostra strategia: testiamo due condizioni di accessibilità dell'antigene, una senza anticorpo e una con una specifica consulenza sull'anticorpo, ottenendo così quattro punti. Scegliamo quindi la migliore, che corrisponde alla seconda condizione, per la quale effettuiamo la titolazione dell'anticorpo, ottenendo così un punteggio più alto. Ma cosa succederebbe se, in realtà, il punto ottimale si trovasse in una condizione al di fuori dell'intervallo testato?
Osservando questo, mi ricorda molto la progettazione degli esperimenti e i webinar che ho seguito con JNP. Questa è una diapositiva di esempio tratta da una presentazione manuale, in cui si confronta l'approccio proposto, fattore per fattore (che è quello che stiamo usando ora), con il DOE (Design of Experiments), e si nota che si ottiene una copertura maggiore dell'area sperimentale. Il che può rappresentare un grande miglioramento, nel nostro caso. Ho deciso di provarlo.
Innanzitutto, inizio con la cosa più semplice, ovvero lo sviluppo di un protocollo semplice, come vi mostrerò, che rileva un solo bersaglio su questo problema. Dobbiamo prima definire i nostri vincoli e parametri. Nel nostro automa, quello che sto usando per questo esperimento, questo automa ha posizioni indipendenti. È combinato con un test del progetto degli esperimenti è una diapositiva nell'automa, e dobbiamo definire le risposte e i fattori.
La risposta che vogliamo analizzare è l'intensità del segnale. Vogliamo massimizzarla e minimizzare il rumore di fondo. I fattori con cui possiamo intervenire in questa fase sono il recupero dell'antigene, che è un fattore categorico, e la concentrazione dell'anticorpo primario, che è una variabile continua. Procediamo con il disegno sperimentale. Scelgo di confrontare diversi disegni sperimentali.
Vi mostro il design personalizzato e il design che riempie lo spazio. Imposteremo insieme questo design. Vado semplicemente sulla piattaforma DOE e sul design personalizzato, e dovremo inserire qui le risposte e i fattori o le risposte dell'anno scorso. Il primo è un'intensità del segnale che vogliamo massimizzare.
Presuppongo una valutazione arbitraria tra zero, che indica assenza di segnale, e tre, che indica la presenza di un segnale, e aggiungerò un'altra risposta qui. Si tratta di un rumore di fondo che vogliamo minimizzare, quindi questa volta dovrei minimizzarlo, e inserisco il rumore di fondo qui. Allo stesso modo, zero indica assenza di rumore di fondo e tre indica un rumore di fondo molto elevato, e poi aggiungeremo i fattori.
Ve lo mostro subito perché qui ero un po' nascosto. Come fattori, abbiamo il fattore categoriale, che è a due livelli, il recupero dell'antigene. È abbastanza facile da modificare, e di solito abbiamo due PH, PH 6 e PH 9. Che viene chiamato diversamente a seconda dell'automa, ma questo non ha molta importanza.
Abbiamo il fattore continuo, che è la concentrazione di anticorpi. Di solito, testiamo 10 e un massimo, quindi lo farò variare da zero a 10. Detto questo, non ho covariate. Come ti ho detto, ho scelto la più semplice. Continueremo con il modello. Voglio vedere tutte le possibili interazioni, quindi uso la RSM. Non uso repliche. Non uso punti centrali. Sono già passato alla più semplice, e vedi che per impostazione predefinita, ha detto, okay.
Dovresti fare 11 unità, 11 unità si adattano a quello che stiamo facendo di solito, quindi va bene. Per sfruttare questo esploratore di design che si trova in JNP 17, clicco qui e dico, ok. Esploriamo magari un design diverso. Vedi che quando clicchi, hai di nuovo i fattori, il modello qui, e hai diverse opzioni, quindi a sinistra, serve solo per esprimere design per design. A destra, puoi fare una combinazione. Per RSM di solito, facciamo l'ottimalità visiva e una volta, diciamo, voglio provare un numero diverso di esecuzioni.
Diciamo un minimo di cinque. Diciamo che partiamo da questo e arriviamo fino a, diciamo, 11. E se facessimo 15, ad esempio, con un passo di, diciamo, uno? I punti centrali non mi interessano molto, ma possiamo provare e vedere cosa succede e replicare. Vediamo, è meglio se replichiamo.
Ho cliccato su "Genera tutto il progetto" e ha generato il progetto anche con parametri diversi, quindi ho scelto l'ottimalità visiva, quindi è ottimale ovunque. Ho scelto il numero di prove da 5 a 15 e poi ci sono le repliche.
Non è successo, ma ecco una replica per cinque. Non so perché, ma va bene. Vedi, per sette, ad esempio, ho due repliche, una o zero come uguale per tutti. Anche per i punti centrali, ho uno o due punti centrali quando possibile. In basso, hai un tavolo di lino così puoi realizzarlo e aggiunge una bella colonna.
Questo è semplicemente progettato su misura per ognuno di loro. Se scegli un design in questa tabella, fai clic su Design personalizzato e si apre la tabella dei costi. Il che è utile in questo caso perché puoi creare dei grafici e dire, ok. Vediamo. L'efficienza, a seconda del numero di fronti, lo farò.
Come potete vedere, c'è una forte correlazione tra i due. Possiamo aggiungere altre variabili da analizzare con lo strumento di selezione delle colonne. Voglio visualizzare le sequenze, i punti centrali e le repliche. Scusate, ho dimenticato. Per selezionare le sequenze, ma comunque, ecco qui le sequenze.
I punti centrali non sembrano avere un buon impatto e non replicano nulla, quindi sembra che sia pronto. Dovremmo giocare con il numero di run. Se guardo il numero di run, tornerei su questo. Bloccherei semplicemente gli utenti, i punti centrali, e ora guarderesti solo i numeri di riferimento.
Non ho rimosso tutto. Spero che tu abbia rimosso tutto prima. Altrimenti, li aggiunge tutti. Ho rimosso tutto. Ho solo selezionato. Non ho preso nota. Scusa. Prende quello, quindi diciamo che sceglierò quello che è stato selezionato, quindi 12 esecuzioni.
Torno qui e dico, okay. È il valore predefinito? 11? In realtà, voglio essere sicuro di avere i miei due controlli negativi, che non contengono alcun anticorpo con isotopi, quindi direi 10.
Creerei un disegno con 10, e poi aggiungerei manualmente i miei due controlli. Qui vedete, è un piccolo disegno. Ci vogliono solo 10 secondi, ed ecco una tabella. In effetti, ogni volta che lo eseguiamo, qui ci saranno numeri diversi. Userò quello che ho fatto prima. Eseguendo questo script, avrò esattamente gli stessi dati di chiunque altro vi stia mostrando. Qui c'è una tabella, quindi vedete che era diverso.
Ho solo 0 o 10 o cinque della concentrazione, ma manteniamo questo stabile. Nella tabella, vedi che hai già il modello, la valutazione del progetto, e puoi tornare alla finestra di dialogo DOE. Valutazione, non la farò perché voglio confrontare due progetti. La farò ora. L'ho appena portata, quindi il progetto che ho, si duplica per ogni punto alla fine.
Anche se non ho richiesto duplicati, me li ha forniti. Copre quest'area dello spazio sperimentale. Provo un design che riempie lo spazio. È lo stesso. Buon DOE, ma questa volta si tratta di un design a scopo speciale, che riempie lo spazio, ed è quello che voglio mostrarti, quindi dovrei tornare al mio Design Personalizzato. Voglio confrontare il design, ma le risposte e i fattori sarebbero gli stessi. Posso semplicemente salvare le mie risposte e i miei fattori. Oh, salverei solo le risposte, nello stesso modo in cui salvo le foto.
Quindi, se torno al disegno di riempimento dello spazio, posso caricare le risposte. Mi dispiace. Devi avere la finestra selezionata, così la trovi. Lo stesso vale per i fattori, e ho scritto i fattori. Nessun vincolo. Ancora una volta, il numero di warrant è 20, ma voglio confrontare due disegni, quindi ne farò 10 allo stesso modo.
Non ho scelta. È solo una sensazione di flessibilità. Genera questo progetto e vedi che questa volta la concentrazione non è rigida come 0105. È un'ampia gamma di concentrazioni e puoi fare la tabella allo stesso modo. Posso chiudere tutto questo. Per quanto riguarda il progetto personalizzato, ho rieseguito quello che ho fatto, quindi ho esattamente gli stessi numeri e volevo confrontare il progetto. Come si confronta il progetto? Oh, prima. Scusa. Ho dimenticato.
Come potete vedere, la variazione nella concentrazione degli anticorpi non è la stessa. Non ho duplicati, a parte questo controllo. Copre una gamma più ampia di concentrazioni di anticorpi, il che è positivo per quello che stiamo cercando.
Volevo confrontare i due design. Innanzitutto, posso farlo graficamente perché l'area coperta da ciascun design è diversa. E dal mio punto di vista, il metodo Space Filling mi permetterà di provare una maggiore concentrazione di anticorpi, il che potrebbe essere un vantaggio, ma posso confrontare i design. Nel DOE (Design of Experiments) si hanno strumenti di diagnostica del design, che permettono di confrontare i design, quindi come vedi li ho entrambi.
Ho già il modello Fast Flexible, quindi aggiungerò il modello Custom Design. I nomi delle colonne sono gli stessi, quindi non ho bisogno di troppe colonne. Lo farà lui, lo sai, e quindi riepiloghiamo i fattori fino ad oggi. Per il modello Fast Flexible, non parte esattamente da zero e non arriva a 10, ma ci si avvicina molto. Farò il modello per eliminarli. Non posso avere il fattore categorico in questo, ma ce l'ho. Torniamo al rapporto rischio-beneficio anticorpo per anticorpo e anticorpo per antigene. Non posso ottenere l'antigene al fattore due, ma va bene, e passiamo alla valutazione del progetto.
Ecco perché non l'ho fatto uno per uno. Volevo fare un confronto. In blu qui, se guardate il grafico della potenza, c'è un Fast Flexible Design, e in arancione c'è il Custom Design. Vedete che [inaudibile 00:17:23], il Custom Design sembra migliore nel nome di quattro della determinazione del modello rispetto al Fast Flexible Design. Se andate ai grafici della frazione di Design Space, è lo stesso.
Il design personalizzato sembra più adatto. Se confrontiamo la diagnostica del design, è relativo al design personalizzato. Ovvero, il design personalizzato aggiunge un valore, e se cerco alta efficienza, design veloce e flessibile, ne apro sette, quindi è il 30% meno efficiente, diciamo, rispetto a un design personalizzato per sensori. L'ho appena inserito qui.
Ecco tre diagnostiche che vi mostro qui, e sembra che il Design Personalizzato sia migliore di quello Riempimento Spazio [inaudibile 00:18:18], ma vediamo cosa ci diranno i risultati. I profili vengono ottenuti dopo l'inserimento [inaudibile 00:18:26] quindi, giusto per mostrarvi un esempio dei dati, ho qui la mia tabella DOE. Ho appena aggiunto l'intensità del segnale e la risposta di fondo, quindi guardo le mie immagini e dico: ok. Non ho intensità. Ne ho un po'. Ne ho di più, e così via, e ho fatto lo stesso per entrambi i design.
Ecco lo stesso. Se non fosse così, si tratterebbe di due esecuzioni, quindi due set di dati diversi. Alla fine, ho creato il modello. Basta cliccare sul modello. Vedete, è uno screening standard dell'effetto quadrato. Con tutte le interazioni qui, ho adattato tutto. Ho alcuni fattori che potrei rimuovere, ma ho deciso di mantenere tutto. Poi vado al profiler qui. Se guardiamo la condizione migliore, massimizzerò la mia disabilità come è stato fatto.
Massimizzando la mia intensità. Vedete, va al punto più alto qui, minimizzando lo sfondo, e ha trovato questa condizione. Dopo questo, ho capito che forse non è così, non voglio massimizzare l'intensità del segnale. Voglio solo abbinare un target perché forse il campione che sto usando qui non è il campione con basso, quindi voglio essere in grado di rilevare basso ed espressione dei miei target.
Modificherò un po' e dirò: "Okay". Voglio abbinare un target, che ha un'intensità media. Non quella diagnosticata, ma quella intermedia. Voglio comunque ridurre al minimo il rumore di fondo perché non è un buon segno. Ora, se massimizzo la desiderabilità, vedete che cambia la concentrazione di anticorpi da utilizzare. Questo è quasi quello che abbiamo ottenuto qui. Forse ho usato un numero leggermente diverso, ma va bene. Ho fatto la stessa cosa, ed è la stessa cosa per un Fast Flexible Design.
Ho ottenuto due condizioni diverse, una in cui ho quasi 3,8 di anticorpi in CC2 e due in CC2. Qui non è PHCCN9 perché su questo automatico è chiamato CC1 e CC2, ma è lo stesso. Quindi dico, ok. Ho queste due condizioni. Le confronterei con il protocollo iniziale.
Ovvero, il nostro riferimento, che è il nostro pennello standard, ovvero le immagini che vi ho mostrato prima. Qui, avete le condizioni di progettazione personalizzata e le condizioni di progettazione a riempimento dello spazio. Come potete vedere, queste due condizioni forniscono dati almeno altrettanto buoni, direi persino migliori, rispetto a quelli che definiamo con il nostro approccio standard. Per quanto mi riguarda, ho scritto i dati relativi al riempimento dello spazio per testare una maggiore concentrazione di anticorpi, il che è utile quando si hanno bersagli difficili.
Procederò in questo modo perché, inoltre, queste due condizioni che vedete qui erano presenti nel progetto di riempimento dello spazio. Non ho dovuto eseguire il test rispetto alle condizioni perché avevo i dati nel progetto di riempimento dello spazio e l'immagine serve per verificare che funzioni correttamente. Ho scelto un progetto di riempimento dello spazio per testarlo su un altro protocollo, solo per vedere se funziona.
Non analizzare tutto nel dettaglio. Prendo semplicemente lo stesso foglio e modifico le mie risposte per i nuovi target. Ho ottenuto questo modello in cui per abbinare il target di due qui di intensità centrale e per minimizzare quello sfondo, ha detto, okay, dovresti avere 2,8 microgrammi per maschio di anticorpo e in condizione CC2.
Se lo confronto con il protocollo che abbiamo sviluppato, si parlava di CC1 e programma da 5 microgrammi, quindi non è lo stesso. Entrambi cambiano, ma come potete vedere nell'immagine, è lo stesso protocollo definito da Space Filing Design, che è almeno altrettanto valido di quello che sviluppiamo di solito. Ora, ciò che manca per convincere le operazioni e i manager sono sicuramente i costi e i tempi. Il nostro approccio alla progettazione qui proposto.
Innanzitutto, confronto il tempo impiegato per la progettazione di un Design Personalizzato e di un Design a Riempimento di Spazio con quello impiegato per la progettazione standard. Il nostro approccio standard è rappresentato in blu in questo grafico, il Design a Riempimento di Spazio in rosso e il Design Personalizzato in verde. Confronto inoltre il numero di cicli, ovvero il tempo impiegato per la realizzazione delle diapositive, il tempo che intercorre tra la progettazione e la definizione del protocollo, e il tempo che intercorre tra la ricezione della richiesta e la prenotazione.
Se si considera il tempo intercorso tra la richiesta tecnica e la ricerca, anche considerando la necessità di progettare tutto, e tenendo conto che si tratta di un nuovo metodo di lavoro per il team tecnico, abbiamo ridotto i tempi per ottenere i risultati. Ora, con un secondo esempio, non ho dovuto riprogettare tutto da capo. È più probabile che il passo successivo sarà quello che faremo se adottiamo questo approccio come nuovo metodo effettivo, e quindi lo confronto con l'approccio standard utilizzato per questo progetto.
In blu, a strisce rosse, ho inserito la configurazione DOE premendo il ciclo di confronto perché abbiamo un protocollo di riferimento. Ho eseguito un ciclo di confronto, ma se si tratta del nuovo approccio che stiamo utilizzando, allora non eseguiremo un ciclo di confronto perché non avremo un riferimento. Eseguiremo semplicemente la configurazione DOE, ed è in rosso. Come potete vedere, ha ridotto il numero di cicli, il numero di siti, il numero di anticorpi che abbiamo utilizzato e i risultati finali in giorni, è stato accorciato da ALF, il che è piuttosto buono.
In conclusione, mi piace questa citazione di Steve Jobs: "Inizia in piccolo, pensa in grande". All'inizio, quando ho visto tutte queste cose [inaudibile 00:24:53] oh, è bello, ma posso applicarlo. Ho faticato un po', ma ho detto: okay, inizierò nel modo più semplice, e l'ho impostato per questo semplice IHC, e ho convinto il mio manager ancora più rapidamente quando ho pensato. Poi il team operativo e infine altri leader che l'approccio poteva essere applicato all'IHC.
Non possiamo concedere finanziamenti nel caso in cui sia necessaria un'ottimizzazione come quella attuale, perché all'inizio non si può sapere se lo sviluppo sarà facile o meno. Il prossimo passo, che vorrei presentare al laboratorio, è la configurazione multiplex. Rilevamento di più bersagli sullo stesso tessuto, partendo da due bersagli contro quello soppresso e arrivando fino a cinque bersagli. Questo è in corso.
Infine, vorrei ringraziarvi. Vorrei ringraziare il comitato direttivo per aver selezionato il mio abstract, il team di Cerba Research Montpellier e anche il tecnico di laboratorio, perché a volte è difficile seguire le mie idee stravaganti.
Il mio manager, che mi supporta già nella nuova strategia e nel nuovo modo di vedere le cose, e tutto il team di ideazione e validazione, di cui faccio parte, mi seguono anche in questo test. Voglio ringraziare il team francese di JNP, Stephane, per il supporto e per avermi posto tutte le domande, il che mi ha permesso di caricare questa nuova versione di JNP 17, dove prima ero bloccato con la 16, e di poter vedere la bella piattaforma di esplorazione del design. Ringrazio tutti voi per la vostra attenzione.
