Cerba Research est une entreprise de renommée mondiale spécialisée dans la fourniture de solutions analytiques et diagnostiques de pointe, adaptées aux essais cliniques internationaux. À Cerba Research Montpellier, notre équipe dédiée personnalise les protocoles d'immunohistochimie afin de détecter l'expression de cibles spécifiques dans les coupes tissulaires des patients. Pour répondre à la demande croissante de développement de protocoles et améliorer la rentabilité des processus, nous sommes conscients de l'importance cruciale d'optimiser les délais de développement et de réduire les coûts.
Compte tenu de la diversité des protocoles personnalisés à développer, l'approche OFAT (un facteur à la fois) classique n'est plus suffisante. Nous avons donc entrepris une évaluation approfondie, comparant différentes méthodologies de plans d'expériences (DOE), notamment les plans personnalisés et les plans d'expériences par remplissage d'espace, à l'aide de JMP. Ces approches DOE sont évaluées par rapport aux protocoles OFAT précédemment développés. Nous présentons des données illustrant les avantages comparatifs des approches OFAT et DOE, en termes de rapport coût-efficacité et de qualité.
Bonjour. Je suis Marie Gérus-Durand et je travaille chez Cerba Research en tant qu'ingénieure validation. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment nous pouvons réduire les coûts et améliorer la qualité de nos analyses grâce à la planification d'expériences lors de la mise en place de protocoles cliniques d'immunohistochimie. Pour information, Cerba Research est une entreprise internationale présente sur tous les continents. Le département dans lequel je travaille est surligné en jaune.
Il s'agit du service d'anatomopathologie et d'immunohistochimie. Le principal laboratoire de recherche en immunohistochimie est basé à Montpellier, où je travaille. Qu'est-ce que l'immunohistochimie ? L'immunohistochimie est l'étude des protéines ou de diverses cibles dans les tissus. Lors de biopsies, on réalise des coupes de tissu pour en extraire des fragments, puis on utilise une technique basée sur les anticorps pour détecter différentes cibles d'un agent pathogène sur le tissu. Ces cibles sont ensuite visualisées au microscope ou à l'aide d'un scanner, sur des images numérisées.
Ici, par exemple, vous avez un échantillon de tissu cutané où l'on distingue une cible bien visible, colorée en rouge. Plus d'un quart de nos activités chez Cerba Research Montpellier sont consacrées à la mise en place de protocoles pour nos clients. Nous comptons plus de 50 clients. Chacun de ces cibles est privilégiée. Il est crucial pour nous de mettre en œuvre rapidement la meilleure stratégie de développement afin de rester compétitifs dans tout le domaine des protocoles d'essais cliniques.
Voici un autre exemple de coloration, celle que j'utiliserai dans le premier exemple. Je vais vous la montrer. Il s'agit de la détection d'une cible en brun par immunohistochimie (IHC). Ce protocole permet donc de détecter une seule cible. On parle alors d'un marquage simplex, et c'est ce que nous faisons le plus souvent.
Notre approche consiste à analyser chaque facteur individuellement. Nous évaluons d'abord l'accessibilité des antigènes tissulaires pour la reconnaissance des cibles, puis nous procédons à un titrage des anticorps afin de déterminer les conditions optimales offrant le meilleur rapport signal/bruit. Si nécessaire, nous effectuons une optimisation supplémentaire. Chaque flèche représente une étape du protocole de développement, et chaque étape correspond à au moins un cycle automatisé. Chaque cycle dure au moins quatre jours, de la demande à l'obtention des résultats.
Pour améliorer la rentabilité de nos subventions et le nombre de protocoles développés, nous devons réduire le temps et le nombre de tests nécessaires pour parvenir au protocole optimisé. Voici un schéma de notre stratégie : nous testons deux conditions d'accessibilité à l'antigène, avec ou sans anticorps, ce qui nous donne quatre points. Nous choisissons ensuite la meilleure, par exemple la condition deux, pour effectuer un titrage de l'anticorps, car elle présente le plus de points. Mais que se passerait-il si, en réalité, le point optimal se situait dans la condition un, en dehors de la plage testée ?
En y regardant de plus près, cela me rappelle beaucoup la conception d'expériences et les webinaires que j'ai suivis avec JNP. Voici une diapositive d'exemple tirée d'une salle de formation, où l'on compare l'approche proposée, facteur par facteur (celle que nous utilisons actuellement), à la méthode DOE. On constate ainsi une meilleure couverture de la zone expérimentale, ce qui représente une amélioration considérable pour notre configuration. J'ai donc décidé de l'essayer.
Je commence par le plus simple : le développement d'un protocole simple, comme je vous le montre, en détectant une seule cible. Nous devons d'abord définir nos contraintes et paramètres. Dans l'automate que j'utilise pour cette expérience, chaque position est indépendante. Chaque position correspond à un test issu du plan d'expériences, et nous devons définir les réponses et les facteurs.
La réponse que nous souhaitons analyser est l'intensité du signal. Nous voulons la maximiser et minimiser le bruit de fond. À ce stade, nous pouvons agir sur la récupération de l'antigène (variable catégorielle) et la concentration de l'anticorps primaire (variable continue). Passons à la conception expérimentale. J'ai choisi de comparer différentes conceptions.
Je vous montre le plan d'expérience personnalisé et le plan d'expérience à remplissage d'espace. Nous allons élaborer ce plan ensemble. Je me rends simplement sur la plateforme DOE et je sélectionne « Plan personnalisé ». Nous devrons y saisir les réponses et les facteurs, ou les réponses, de l'année dernière. Le premier facteur est l'intensité du signal que nous souhaitons maximiser.
Je vais supposer une évaluation arbitraire entre zéro (absence de signal) et trois (présence d'un signal), et j'ajouterai une autre réponse ici. Il s'agit d'un bruit de fond que nous voulons minimiser ; je dois donc le minimiser cette fois-ci, et je l'indique ici. De même, zéro correspond à une absence de bruit de fond et trois à un bruit de fond très élevé. Ensuite, nous additionnerons les facteurs.
Je vais vous montrer, car j'étais un peu caché. Parmi les facteurs, on trouve le facteur catégoriel, qui est à deux niveaux : la récupération de l'antigène. Il est assez facile à modifier, et on a deux pH, généralement pH 6 et pH 9. Leur appellation varie selon l'automate, mais cela n'a pas vraiment d'importance.
Nous avons le facteur continu, qui est la concentration d'anticorps. Habituellement, nous testons 10 valeurs et un maximum, je vais donc la faire varier de zéro à 10. Une fois cela fait, je n'ai plus de covariables. Comme je vous l'ai dit, j'ai choisi le modèle le plus simple. Nous allons continuer avec le modèle. Je veux voir toutes les interactions possibles, donc j'utilise la méthodologie des surfaces de réponse (RSM). Je n'utilise pas de réplicats. Je n'utilise pas de points centraux. J'ai déjà utilisé le modèle le plus simple, et vous voyez que par défaut, elle a dit : « D'accord. »
Il faut en faire 11, cela correspond à ce que nous faisons habituellement, donc c'est bon. Pour utiliser l'explorateur de conception de JNP 17, je clique ici et je dis : « OK, explorons différentes conceptions. » Vous voyez qu'en cliquant, les facteurs réapparaissent, le modèle aussi, et différentes options s'offrent à vous. À gauche, on peut exprimer chaque conception individuellement. À droite, on peut faire une combinaison. Pour la RSM, on recherche généralement l'optimalité visuelle, et parfois, par exemple, je veux essayer différents nombres d'exécutions.
Disons un minimum de cinq. On commencerait par ça, et on monterait jusqu'à, disons, 11. Et si on faisait 15, par exemple, avec un pas de un ? Les points centraux, peu importe, mais on peut essayer pour voir ce que ça donne et reproduire le résultat. Voyons voir, il vaut mieux reproduire.
J'ai cliqué sur « Générer tous les plans », et le logiciel a également généré des plans avec différents paramètres. J'ai donc choisi l'optimalité visuelle, qui est donc appliquée partout. J'ai sélectionné les essais numérotés de 5 à 15, ce qui correspond aux réplicats.
Ça n'a pas fonctionné, mais voici une réplique pour cinq. Je ne sais pas pourquoi, mais ce n'est pas grave. Vous voyez, pour sept par exemple, j'ai deux répliques, une ou zéro étant la même pour tous. Pour les points centraux également, j'en ai un ou deux lorsque c'est possible. En bas, vous avez un tableau en lin qui permet de le réaliser et qui ajoute une jolie colonne.
C'est un modèle personnalisé pour chacun d'eux. Si vous choisissez un modèle dans ce tableau, cliquez sur « Modèle personnalisé » pour ouvrir le tableau des coûts. C'est pratique pour créer des graphiques et analyser l'efficacité en fonction du nombre de façades.
Vous voyez qu'il existe une forte corrélation entre les deux. On peut explorer et ajouter d'autres variables à analyser grâce au sélecteur de colonnes. Je souhaite visualiser les séries, ainsi que les points centraux et les réplicats. Oups, j'avais oublié de sélectionner les séries. Bref, voici les séries.
Les points centraux ne semblent pas avoir d'impact significatif ni se répliquer correctement ; le système semble donc prêt. Il faudrait tester le nombre d'exécutions. Je reviendrai sur ce point après avoir examiné ce nombre. Je bloquerais simplement les utilisateurs et les points centraux, et vous pourriez vous concentrer uniquement sur les numéros de référence.
Je n'ai pas tout supprimé. J'espère que vous devriez tout supprimer avant. Sinon, ça ne fait que les ajouter. J'ai tout supprimé. Juste la sélection. Je n'ai pas pris de note. Désolé. Ça prend ça en compte, donc disons que je vais choisir ce qui était sélectionné, donc 12 essais.
Je vais revenir en arrière et dire : d’accord. Est-ce la valeur par défaut ? 11 ? En fait, je veux m’assurer d’avoir mes deux témoins négatifs, c’est-à-dire sans aucun anticorps avec des isotopes, donc je dirais 10.
Je vais créer un schéma avec 10 éléments, puis j'ajouterai manuellement mes deux commandes. Vous voyez, c'est un schéma simple. Cela ne prend que 10 secondes, et voici un tableau. En fait, à chaque exécution, les valeurs affichées seront différentes. J'utiliserai celui que j'ai créé précédemment. En exécutant simplement ce script, j'obtiendrai exactement les mêmes données que toutes les personnes que je vous montre. Voici un tableau ; vous voyez, les valeurs étaient différentes.
Je n'ai que 0, 10 ou 5 valeurs de concentration, mais gardons cela stable. Dans le tableau, vous voyez que le modèle est déjà présent, ainsi que l'évaluation du plan d'expériences. Vous pouvez retourner à la boîte de dialogue DOE. Je ne ferai pas l'évaluation pour l'instant, car je souhaite comparer deux plans. Je la ferai plus tard. Je viens de l'importer ; le plan que j'ai est dupliqué pour chaque point à la fin.
Même sans demander de doublons, j'en ai obtenu. Cela couvre cette zone de l'espace expérimental. J'essaie un plan d'expériences de remplissage d'espace. C'est pareil. Bon plan d'expériences, mais cette fois, c'est un plan spécifique, de remplissage d'espace, et c'est ce que je veux vous montrer. Je dois donc revenir à mon plan personnalisé. Je veux comparer les plans, mais les réponses et les facteurs seraient les mêmes. Je peux simplement enregistrer mes réponses et mes facteurs. Oh, j'enregistrerais juste les réponses, de la même manière que j'enregistre des photos.
Ensuite, si je retourne à la conception de remplissage d'espace, je peux charger les réponses. Toutes mes excuses. Vous devez avoir la fenêtre sélectionnée pour la trouver. Idem pour les facteurs, que j'ai saisis. Aucune contrainte. Le nombre de garanties est de 20, mais je souhaite comparer deux conceptions ; je vais donc en réaliser 10 identiques.
Je n'ai pas le choix. C'est juste une question de flexibilité. Le logiciel génère ce schéma, et vous voyez que cette fois, la concentration n'est pas aussi stricte que pour 0105. Il y a une très large plage de concentrations, et vous pouvez reproduire le tableau de la même manière. Je peux tout fermer. Concernant le schéma personnalisé, j'ai relancé celui que j'avais créé, j'ai donc exactement les mêmes valeurs, et je voulais comparer les schémas. Comment compare-t-on les schémas ? Ah oui, d'abord. Pardon. J'avais oublié.
Vous voyez que les variations de concentration d'anticorps ne sont pas identiques. Je n'ai aucun duplicata, à l'exception de ce contrôle. Il couvre une gamme de concentrations d'anticorps plus étendue, ce qui est idéal pour notre objectif.
Je voulais comparer les plans d'expériences. D'abord, graphiquement, car la surface couverte par chaque plan est différente. À mon avis, le plan à remplissage d'espace me permettra de tester différentes concentrations d'anticorps, ce qui pourrait être intéressant. Je peux donc comparer les plans. Dans le cadre de la planification d'expériences (DOE), on trouve des outils de diagnostic et de comparaison de plans ; comme vous pouvez le constater, j'ai les deux plans.
J'ai déjà le modèle Fast Flexible, donc j'ajouterai le modèle personnalisé. Les noms des colonnes sont identiques, je n'ai donc pas besoin de trop de colonnes. Il s'en chargera, vous le savez, et récapitulons les facteurs à ce jour. Pour le modèle Fast Flexible, la valeur ne commence pas exactement à zéro et ne va pas jusqu'à 10, mais on s'en approche. Le modèle que je vais créer permettra de les supprimer. Je ne peux pas inclure le facteur catégoriel ici, mais je l'ai. Revenons à l'analyse risque-récompense anticorps par anticorps et anticorps par antigène. Je ne peux pas inclure l'antigène au deuxième facteur, mais ce n'est pas grave, et nous passons à l'évaluation du modèle.
C'est pourquoi je ne l'ai pas fait étape par étape. Je voulais comparer. En bleu, sur le graphique de puissance, il s'agit d'une conception rapide et flexible, et en orange, d'une conception personnalisée. Vous voyez que [inaudible 00:17:23], la conception personnalisée semble plus performante, en termes de détermination du modèle, que la conception rapide et flexible. Si vous regardez les graphiques de fraction de l'espace de conception, c'est identique.
La conception personnalisée semble plus appropriée. Si l'on compare les diagnostics de conception, c'est relatif à la conception personnalisée. Autrement dit, la conception personnalisée ajoute une valeur, et si je recherche une efficacité élevée et une conception rapide et flexible, j'en ouvre sept, ce qui la rend, disons, 30 % moins efficace qu'une conception personnalisée avec capteur. Je viens de l'ajouter.
Je vous montre ici trois diagnostics, et il semble que la conception personnalisée soit meilleure que le remplissage d'espace [inaudible 00:18:18]. Voyons ce que les résultats nous révéleront. Les profils sont obtenus après avoir saisi [inaudible 00:18:26]. Pour vous donner un exemple de données, voici mon tableau DOE. J'y ai ajouté l'intensité du signal et la réponse du bruit de fond. J'observe mes images et je constate : « Pas d'intensité. J'en ai une. J'en ai une plus importante, etc. » J'ai procédé de la même manière pour les deux conceptions.
Voici la même chose. Sinon, il s'agirait de deux essais, donc de deux ensembles de données différents. À la fin, j'ai créé le modèle. Cliquez simplement dessus. Vous voyez, c'est un criblage standard à effets carrés. Avec toutes les interactions, j'ai tout ajusté. J'aurais pu supprimer certains facteurs, mais j'ai décidé de tout conserver. Ensuite, je suis allé dans le profileur. Si l'on considère la meilleure condition, je maximiserai mon handicap, comme cela a été fait.
Je cherche à maximiser l'intensité. Vous voyez, elle atteint son maximum ici, en minimisant le bruit de fond. C'est ainsi qu'il a trouvé cette condition. Après cela, j'ai réalisé que ce n'était peut-être pas la bonne solution ; je ne veux pas maximiser l'intensité du signal. Je veux simplement cibler un niveau précis, car l'échantillon que j'utilise ici n'est peut-être pas celui avec un faible niveau d'expression. Je veux donc pouvoir détecter les faibles niveaux d'expression de mes cibles.
Je vais apporter quelques modifications. Je souhaite cibler une valeur intermédiaire, pas une valeur diagnostiquée, mais une valeur moyenne. Je veux minimiser le bruit de fond, car il est indésirable. En maximisant la désirabilité, vous constatez que la concentration d'anticorps à utiliser a été modifiée. C'est quasiment le résultat obtenu. J'ai peut-être utilisé des valeurs légèrement différentes, mais ce n'est pas grave. J'ai procédé de la même manière, et c'est la même chose pour une conception rapide et flexible.
J'ai obtenu deux résultats différents : l'un avec un taux d'anticorps proche de 3,8 dans le CC2 et l'autre avec un taux de 2 dans le CC2. Il ne s'agit pas du PHCCN9, car sur cet automate, on parle de CC1 et CC2, mais c'est la même chose. Je me dis donc : « D'accord. J'ai ces deux résultats. » Je vais les comparer au protocole initial.
Autrement dit, notre référence, c'est-à-dire notre pinceau standard, comme les images que je vous ai montrées précédemment. Ici, vous avez les conditions de conception personnalisée et les conditions de conception de remplissage d'espace. Vous constatez que ces deux conditions donnent des données au moins aussi bonnes, voire meilleures, que celles obtenues avec notre approche standard. Personnellement, j'ai créé les données de remplissage d'espace pour tester différentes concentrations d'anticorps, ce qui est utile pour les cibles difficiles.
Je vais opter pour cette solution car, en outre, ces deux conditions, que vous voyez ici, étaient déjà présentes dans le schéma de remplissage spatial. Je n'ai pas eu besoin de les tester car les données étaient déjà dans le schéma de remplissage spatial, et l'image sert à vérifier son bon fonctionnement. J'ai choisi un schéma de remplissage spatial pour le tester sur un autre protocole, simplement pour m'assurer de son bon fonctionnement.
Inutile de tout reprendre. Je reprends simplement le même document et j'adapte mes réponses aux nouvelles cibles. J'ai obtenu ce modèle où, pour correspondre à la cible de deux ici d'intensité centrale et minimiser ce bruit de fond, il a dit : « D'accord, vous devriez avoir 2,8 microgrammes d'anticorps par mâle et dans la condition CC2. »
Si je compare avec le protocole que nous avons développé (programme CC1 et 5 microgrammes), ce n'est pas identique. Les deux évoluent, mais comme vous pouvez le constater sur l'image, il s'agit du même protocole défini par Space Filing Design, au moins aussi performant que celui que nous développons habituellement. Il ne manque plus que les coûts et les délais pour convaincre les équipes d'exploitation et de gestion. Voici notre approche de conception.
Tout d'abord, je compare le temps nécessaire à la conception d'une conception personnalisée et d'une conception optimisée par rapport à notre approche standard. Notre approche standard est représentée en bleu sur ce graphique, la conception optimisée en rouge et la conception personnalisée en vert. Je compare ensuite le nombre de cycles (qui est chronophage), le nombre de diapositives, le délai entre la conception et le protocole, et le délai entre la réception de la demande et la mise en place des réservations.
Si l'on considère le délai entre la demande technique et la recherche, en tenant compte de la conception initiale (une méthode de travail inédite pour l'équipe technique), nous avons réduit le délai d'obtention des résultats. Dans un second exemple, je n'ai pas eu à tout repenser. Cette approche, que nous adopterons probablement comme nouvelle méthode de travail, est plus susceptible d'être la prochaine étape. Je la compare donc à l'approche standard utilisée pour ce projet.
En bleu, en rouge rayé, j'ai indiqué la configuration du plan d'expériences (DOE) et le cycle de comparaison, car nous disposons d'un protocole de référence. J'ai effectué un cycle de comparaison, mais avec la nouvelle approche, nous n'en effectuerons pas, faute de référence. Nous réaliserons directement la configuration du DOE, représentée en rouge. Comme vous pouvez le constater, cela a permis de réduire le nombre de cycles, le nombre de sites, le nombre d'anticorps utilisés et le délai d'obtention des résultats finaux (en jours), raccourci de 100 %, ce qui est très appréciable.
En conclusion, j'aime cette citation de Steve Jobs : « Commencez petit, voyez grand. » Au début, quand j'ai vu tous ces concepts [inaudible 00:24:53], je me suis dit : « C'est bien beau, mais je ne sais pas comment l'appliquer. » J'ai eu un peu de mal, mais je me suis dit : « D'accord, je vais commencer par le plus simple. » J'ai donc mis en place ce système pour cette petite structure IHC, et j'ai convaincu mon responsable encore plus rapidement. Ensuite, j'ai convaincu l'équipe opérationnelle, puis les autres responsables, que cette approche pouvait s'appliquer à IHC.
Nous ne pouvons pas accorder de financement si une optimisation s'avère nécessaire, comme c'est le cas actuellement, car il est impossible de savoir au départ si le développement sera simple ou non. La prochaine étape, que je souhaite présenter au laboratoire, est la mise en place d'un système multiplex. Il s'agit de détecter plusieurs cibles sur un même tissu, en commençant par deux cibles contre une cible supprimée, et en allant jusqu'à cinq cibles. Ce travail est en cours.
Enfin, je tiens à vous remercier. Je remercie le comité de pilotage d'avoir sélectionné mon résumé. Je remercie également l'équipe de Cerba Research Montpellier ainsi que le technicien de laboratoire, car il est parfois difficile de suivre mes idées un peu farfelues.
Mon manager, qui soutient déjà cette nouvelle stratégie et cette nouvelle approche, ainsi que toute l'équipe de conception et de validation, dont je fais partie, m'accompagneront dans ce test. Je tiens à remercier l'équipe française de JNP, et plus particulièrement Stéphane, pour son soutien et ses questions pertinentes. Grâce à lui, j'ai pu intégrer cette nouvelle plateforme JNP 17, alors que j'étais auparavant bloqué avec la version 16, et découvrir son excellent espace d'exploration de design. Merci à tous pour votre attention.
