Pharmaron ha desarrollado una plataforma para generar terapias génicas con virus adenoasociados (AAV), con un conjunto de herramientas altamente adaptable para gestionar diversos productos y serotipos de AAV. Nuestras herramientas permiten evaluar rápidamente la compatibilidad de un producto con nuestra plataforma mediante un análisis de viabilidad de fabricación y ajustar con precisión varios parámetros para una optimización específica del proceso.
Una herramienta esencial para el enfoque de optimización de Pharmaron es el diseño de experimentos (DOE). Demostramos cómo un enfoque DOE compuesto central puede maximizar la recuperación de AAV monomérico al identificar el tiempo de residencia óptimo, la densidad de carga y el pH de carga para la etapa de captura del proceso inicial de purificación de AAV. Las condiciones de carga óptimas se midieron utilizando el título por ELISA de cápside y dispersión dinámica de luz multiángulo (MADLS) y el porcentaje de monómero por DLS. El análisis DOE mostró una fuerte relación entre la densidad de carga y el contenido de monómero, donde una mayor densidad de carga resultó en un mayor rendimiento de virus monomérico. El pH de carga y el tiempo de residencia tuvieron efectos insignificantes sobre la recuperación y la monomeridad.
Gracias a que facilita el análisis de múltiples parámetros en una fracción del tiempo, el diseño de experimentos (DOE) ha permitido a Pharmaron identificar rápidamente las condiciones óptimas para la captura por afinidad. Esto mejora significativamente el rendimiento del proceso e impulsa la generación de un virus monomérico de alta pureza.
Hola, me llamo Damon Ho y soy Asociado Científico III en Pharmaron Biologics UK, con sede en Liverpool. Gracias por acompañarme en esta charla. Me enorgullece haber completado este trabajo durante mis prácticas de estudiante en Pharmaron Biologics, gracias a mi colaboración con la Universidad John Moores de Liverpool. Y me complace aún más anunciar que JMP fue fundamental para el éxito de la optimización de nuestra etapa de cromatografía de captura.
Pasando a la primera sección del póster, para presentar Pharmaron a quienes no nos conozcan, somos un proveedor líder de servicios de investigación y desarrollo farmacéutico con operaciones a nivel mundial. En Liverpool, actualmente trabajamos en el desarrollo y la fabricación clínica de terapias génicas basadas en vectores virales, centrándonos en los virus adenoasociados (AAV).
En Pharmaron, contamos con una plataforma de procesos impresionante que permite fabricar múltiples serotipos y productos de AAV, como se ilustra en la Figura 1.
Este proceso utiliza filtración en profundidad, seguida de cromatografía de captura, luego cromatografía de pulido intermedia, seguida de cromatografía de pulido, en nuestras etapas de formulación y, finalmente, filtración estéril.
Ahora les presentaré nuestro robot y el uso de JMP. Nos enorgullece enormemente compartir que contamos con un robot de desarrollo de procesos de alto rendimiento y tecnología de punta llamado Beckman Biomek i7, como pueden ver en las figuras 2 y 3, que puede evaluar rápidamente la compatibilidad de un producto con nuestra plataforma y, finalmente, ajustar los parámetros para su perfecta integración en nuestro proceso.
Al utilizar este robot para HTPD junto con el uso de JMP para DoE, podemos generar un producto farmacéutico de alto rendimiento y alta pureza en una fracción del tiempo en comparación con los métodos convencionales.
Este póster se centra en la optimización del paso inicial de cromatografía de captura en nuestro proceso de plataforma para un producto AAV.
Se diseñó un diseño de experimentos (DoE) utilizando el software JMP para determinar las condiciones de carga óptimas para el procesamiento. Se seleccionaron tres factores para optimizar: el tiempo de residencia, la densidad de carga y el pH de carga, y se midieron el título viral y la agregación viral como variables de salida.
Ahora, veamos información breve sobre cómo se diseñó el DoE en JMP. Se eligió un diseño compuesto central (CCD) para crear el DoE por varias razones. En primer lugar, porque requiere un número mínimo de combinaciones de factores para estimar los efectos principales y permite analizar interacciones de dos factores y efectos cuadráticos.
El CCD también cuenta con una buena detección de la falta de ajuste, lo que permite identificar fácilmente qué factores afectan al resultado elegido, y es posible realizar análisis gráficos mediante diversas herramientas disponibles en JMP, como se puede apreciar en todo el póster.
El diseño compuesto central (CCD) se creó en JMP seleccionando primero un diseño de superficie de respuesta, introduciendo los nombres de los parámetros de pH de carga, densidad de carga y tiempo de residencia, y luego ingresando los rangos máximo y mínimo predefinidos. El objetivo era maximizar el contenido de virus monomérico y la recuperación de la cápside viral, por lo que estos parámetros se ingresaron en la sección de respuestas.
El software es muy flexible y siempre se pueden añadir más respuestas al modelo final. En este caso, al tratarse de un CCD convencional, se seleccionó la opción "en la cara". Se seleccionaron mediciones por triplicado para el punto central. El CCD quedó entonces listo para su generación. En total, se generaron 17 condiciones experimentales diferentes mediante el modelo CCD con parámetros bajos, medios y altos variables. Los puntos centrales se definen como todos los parámetros medios que constituyen la base del modelo CCD, mientras que los parámetros bajos y altos actúan como sondas para comprobar cómo interactúan e influyen los factores entre sí.
Esto genera una superficie de respuesta tridimensional que puede predecir con bastante precisión las interacciones entre factores. Mediante JMP, se pueden formular hipótesis sobre las condiciones finales y comprobarlas en una ejecución de confirmación posterior.
Nuestro robot HTPD se utilizó para realizar la cromatografía de captura a muy pequeña escala, lo que permitió analizar múltiples condiciones simultáneamente, un proceso que habría requerido mucho más tiempo a escala de laboratorio. Este sistema, gracias a su automatización, permite un proceso altamente preciso y reproducible.
Una vez que se ejecutaron todas las condiciones en la plataforma Biomek i7, utilizamos nuestro sistema analítico de vanguardia para medir el título de la cápside de AAV mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA), un dualizador acortado y dispersión dinámica de luz multiángulo, también conocida como MADLS.
El contenido de virus monoméricos se midió mediante dispersión dinámica de luz (DLS) convencional. JMP no solo utiliza el diseño de un estudio experimental, sino también el análisis de los resultados.
Una vez disponibles los datos analíticos, se introdujeron en JMP, donde se pudieron visualizar de diversas maneras, incluyendo los gráficos de conteo mostrados en las figuras 4a, 4b y 4c. Se realizó una simulación para generar decenas de miles de resultados virtuales que ayudaron a construir un modelo optimizado y a compararlo con datos experimentales reales para establecer un nivel de confianza en el modelo. Esto se muestra en la figura 5.
Los gráficos de contorno resaltan el impacto de una mayor densidad de carga, que aumenta el contenido de monómero viral, como se muestra en la Figura 4a en color marrón. Sin embargo, al analizar la recuperación de la cápside mediante ELISA, resaltada en la Figura 4b, se observó que una menor densidad de carga, también representada en marrón, produce el mayor rendimiento de cápside. Esto fue refutado por los datos de MADLS mostrados en la Figura 4c, que aportaron evidencia que respalda el impacto de una mayor densidad de carga en el aumento del contenido de monómero viral, representado en marrón, rojo y naranja en la esquina inferior derecha.
Es importante tener en cuenta que MADLS no mide agregados, lo que confirma los hallazgos de DLS. El pH y el tiempo de residencia no tuvieron un impacto significativo en el título de la cápside ni en los resultados de MADLS o DLS, por lo que los gráficos de contorno no se incluyen en este póster.
Ahora podemos pasar a la interpretación de los resultados. Tras analizar las tres condiciones de aprendizaje, la densidad de aprendizaje tuvo el impacto más significativo en la recuperación de la cápside y en la naturaleza monomérica del AAV, lo cual se visualiza mediante la pronunciada pendiente de la línea en el injerto izquierdo del perfilador predictivo que se muestra en la figura 6.
El tiempo de residencia que se muestra en el gráfico central no tuvo ningún impacto notable ni siquiera en la recuperación del virus monomérico o de la cápside mediante ELISA, como lo indica la línea casi horizontal del perfilador de predicción.
El pH de carga que se muestra en el gráfico de la derecha tampoco afectó significativamente la recuperación de la cápside ni el virus monomérico, que también tiene una línea casi horizontal.
La condición óptima sugerida por el diseño experimental (DoE) es una mayor densidad de carga con un menor tiempo de residencia y carga a pH A. Este es un resultado ideal del modelo, ya que con una mayor densidad de carga se utiliza menos material cromatográfico para lograr la misma densidad de carga objetivo.
Un menor tiempo de residencia también se traduce en un proceso más rápido, lo que agiliza la etapa de carga del AAV.
La carga con una condición de pH A también es ideal, ya que no requiere el ajuste del pH del material de carga, lo que ahorra tiempo durante la preparación del material de carga.
Utilizando estas condiciones de carga optimizadas, determinadas mediante el diseño de experimentos (DoE), se puede realizar una prueba de confirmación para verificar los resultados del DoE. Una vez confirmadas, estas condiciones óptimas se pueden utilizar en una prueba a mayor escala, diseñada específicamente para obtener un producto AAV de alta calidad, alta pureza y baja impureza.
Este enfoque permitió realizar una evaluación rápida, con bajos requerimientos de recursos y a bajo costo, para optimizar la etapa de cromatografía de captura en nuestro proceso de plataforma Pharmaron.
En total, los experimentos de optimización se llevaron a cabo en tan solo tres días. Si se hubieran realizado a escala de laboratorio, habrían requerido muchas semanas, además de utilizar mucho más material AAV y un coste mucho mayor al aumentar la escala, ya que solo se puede ejecutar una condición a la vez.
El uso del software JMP junto con nuestras capacidades HTPD nos permite optimizar de forma exhaustiva el proceso de nuestra plataforma para adaptarlo a las necesidades específicas de cada producto de terapia génica. Esto acelera considerablemente las etapas de viabilidad y optimización, que suelen ser las más laboriosas del proceso de desarrollo. En definitiva, reduce drásticamente el tiempo transcurrido desde el desarrollo del producto hasta su administración exitosa a un paciente en la clínica.
Para finalizar, me gustaría agradecerles su atención durante mi presentación en formato póster. Espero que hayan aprendido algo sobre lo que podemos hacer en Pharmaron y sobre la importancia de JMP en nuestro proceso de desarrollo de productos. Muchas gracias.
