Pharmaron 开发了一种平台工艺，用于生成腺相关病毒 (AAV) 基因疗法，并配备了一套高度适应性的工具箱，可管理不同的 AAV 产品和血清型。我们的工具箱能够通过生产可行性评估快速评估产品与我们平台的兼容性，并可对多个参数进行精细调整，从而实现针对性的工艺优化。
药明康德优化方法的关键工具之一是实验设计 (DOE)。我们展示了如何通过中心复合 DOE 方法，确定初始 AAV 纯化过程捕获步骤的最佳停留时间、载药密度和载药 pH 值，从而最大限度地提高单体 AAV 的回收率。最佳载药条件通过衣壳 ELISA 和多角度动态光散射 (MADLS) 测定滴度，并通过动态光散射 (DLS) 测定单体百分比来确定。DOE 分析表明，载药密度与单体含量之间存在密切联系，更高的载药密度可带来更高的单体病毒产量。载药 pH 值和停留时间对回收率和单体性的影响可以忽略不计。
大家好，我叫Damon Ho，是Pharmaron Biologics UK（位于利物浦）的三级科学助理。感谢各位收听本次演讲。我非常荣幸能在Pharmaron Biologics完成这项工作，这是我在利物浦约翰摩尔斯大学实习期间完成的。更令人高兴的是，JMP在我们优化捕获色谱步骤的过程中发挥了至关重要的作用。
接下来是海报的第一部分。为了让可能之前不了解我们的人认识Pharmaron，我们是一家领先的医药研发服务提供商，业务遍及全球。我们在利物浦的实验室目前致力于基于病毒载体的基因疗法开发和临床生产，重点研究腺相关病毒（AAV）。
在 Pharmaron，我们拥有令人印象深刻的平台工艺，可以生产多种 AAV 血清型和产品，如图 1 所示。
该工艺采用深度过滤，然后进行捕获色谱，再进行中间精制色谱，再进行精制色谱，然后进行制剂步骤，最后进行无菌过滤。
现在，我将向大家介绍我们的机器人以及JMP软件的应用。我们非常自豪地宣布，我们拥有一台名为Beckman Biomek i7的先进高通量工艺开发机器人，如图2和图3所示，它可以快速评估产品与我们平台的契合度，并最终调整参数，使其无缝集成到我们的工艺流程中。
结合使用这款机器人进行 HTPD 和 JMP 进行 DoE，我们可以在比传统方法短得多的时间内生产出高产量、高纯度的药物产品。
本海报重点介绍如何优化我们平台工艺中 AAV 产品的初始捕获色谱步骤。
使用JMP软件设计了实验设计（DoE），以确定最佳的进样条件。选择三个因素进行优化，分别是停留时间、进样密度和进样pH值，并以病毒滴度和病毒聚集作为输出指标。
现在，我们来快速了解一下JMP中实验设计（DoE）是如何实现的。之所以选择中心复合设计（CCD）来创建DoE，原因有很多。首先，CCD只需要最少数量的因子组合即可估计主效应，并且能够分析双因子交互作用和二次效应。
CCD 还具有良好的拟合度检测功能，可以轻松显示哪些因素会影响所选结果，并且可以通过 JMP 中提供的各种工具进行图形分析，正如您在海报中看到的那样。
在 JMP 中创建中心复合设计 (CCD) 时，首先选择响应面设计，输入上样 pH 值、上样密度和停留时间等参数名称，然后输入预定义的高低范围。目标是最大化单体病毒含量和病毒衣壳回收率，因此这些参数输入在响应部分。
该软件非常灵活，您可以随时在最终模型中添加更多响应。在本例中，由于使用的是传统的CCD相机，因此选择了面部作为测量点。中心点进行了三次重复测量。之后，即可生成CCD数据。通过CCD模型，共生成了17种不同的实验条件，这些条件包含不同的低、中、高参数。中心点定义为构成CCD模型基础的所有中等参数，而低参数和高参数则作为探针，用于测试各因素之间的相互作用和影响。
由此形成一个三维响应曲面，可以相当准确地预测各因素之间的相互作用。利用JMP软件，可以对最终条件进行假设，并在后续的验证性运行中进行检验。
我们的HTPD机器人用于小规模捕获色谱分析，可同时运行多种条件，而这在实验室规模下需要花费更长的时间。该系统的自动化特性使其能够实现高精度和高重复性的分析过程。
在 Biomek i7 平台上完成所有条件后，我们利用世界一流的分析技术，通过酶联免疫吸附试验、缩短的双化器和多角度动态光散射（也称为 MADLS）来测量 AAV 衣壳滴度。
采用常规动态光散射法（DLS）测定单体病毒含量。JMP不仅用于实验研究设计，还用于结果分析。
分析数据获取后，将其导入JMP软件，并以多种方式进行可视化，包括图4、图4a、4b和4c所示的对比图。运行模拟生成数万个虚拟结果，用于构建优化模型，并与真实世界的实验数据进行比较，从而建立模型的置信度。如图5所示。
等高线图突显了较高载药密度的影响，如图 4a 中棕色部分所示，较高载药密度会增加病毒单体含量。然而，分析衣壳 ELISA 回收率（如图 4b 所示）发现，较低的载药密度（图中也以棕色显示）却能获得最高的衣壳产量。图 4c 中的 MADLS 数据对此提出了质疑，该数据提供了证据，支持较高载药密度会增加病毒单体含量（图中以棕色以及右下角的红色和橙色部分显示）。
一个重要的考虑因素是，MADLS 无法测量聚集体，因此证实了 DLS 的结果。pH 值和停留时间对衣壳滴度、MADLS 或 DLS 结果均无显著影响，因此本海报中未包含等高线图。
现在，我们可以开始解释研究结果了。在分析了三种学习条件后，学习密度对衣壳回收率和AAV的单体性质影响最为显著，这可以从图6所示预测分析器左侧移植线上的陡峭梯度看出。
中心图所示的停留时间对单体病毒或衣壳 ELISA 回收率没有任何显著影响，这由预测分析器的近乎水平的线表明。
右图所示的加载 pH 值对衣壳回收率或单体病毒也没有显著影响，其曲线也接近水平。
实验设计建议的最佳条件是：在pH条件A下，采用较高的上样密度、较短的停留时间和上样量。这是该模型的理想结果，因为较高的上样密度意味着只需更少的捕获色谱介质即可达到相同的目标上样密度。
更短的停留时间也意味着更快的流程，从而简化了 AAV 装载阶段。
加载 pH 条件 A 也是理想的选择，因为它不需要调整加载材料的 pH 值，从而节省加载材料制备时间。
利用实验设计（DoE）确定的优化装载条件，可以进行验证性运行以确认DoE的输出结果。一旦确认，这些最佳条件即可用于放大实验，该实验旨在获得高质量、高纯度和低杂质的AAV产品。
这种方法实现了对 Pharmaron 平台工艺中捕获色谱步骤的快速、低资源需求和低成本评估，从而优化了我们的捕获色谱步骤。
整个优化实验仅用了三天时间就完成了。如果是在实验室规模下进行，则需要数周时间才能完成，而且由于一次只能运行一种实验条件，还需要使用更多的AAV材料，成本也会高得多。
将JMP软件与我们的高通量工艺开发（HTPD）能力相结合，可以让我们针对特定基因治疗产品的需求，对平台工艺进行稳健的优化。这极大地加快了可行性研究和优化阶段，而这两个阶段通常是工艺开发过程中最耗时的环节。最终，这将显著缩短从产品开发到成功将基因治疗产品交付临床患者所需的时间。
最后，我要感谢各位聆听我的海报展示，希望大家对Pharmaron的业务以及JMP在我们产品开发流程中的重要性有所了解。非常感谢。
