파마론은 다양한 아데노 관련 바이러스(AAV) 제품 및 혈청형을 관리할 수 있는 고도로 적응 가능한 툴박스를 갖춘 AAV 유전자 치료제 생산 플랫폼 공정을 개발했습니다. 당사의 툴박스는 제조 타당성 평가를 통해 제품과 플랫폼의 호환성을 신속하게 평가하고, 목표에 맞춘 공정 최적화를 위해 여러 매개변수를 정밀하게 조정할 수 있습니다.
파마론의 최적화 접근 방식에서 필수적인 도구 중 하나는 실험 설계(DOE)입니다. 본 연구에서는 중심 합성 DOE 접근법을 통해 초기 AAV 정제 공정의 포획 단계에서 최적의 체류 시간, 로딩 밀도 및 로딩 pH를 파악함으로써 단량체 AAV 회수율을 극대화하는 방법을 제시합니다. 최적의 로딩 조건은 캡시드 ELISA 및 다각도 동적 광산란(MADLS)을 이용한 역가 측정과 동적 광산란(DLS)을 이용한 단량체 함량 측정을 통해 확인했습니다. DOE 분석 결과, 로딩 밀도와 단량체 함량 사이에 강한 상관관계가 있음을 확인했으며, 로딩 밀도가 높을수록 단량체 바이러스 수율이 증가했습니다. 로딩 pH와 체류 시간은 회수율 및 단량체 함량에 미미한 영향을 미쳤습니다.
실험설계법(DOE)은 여러 매개변수를 단시간에 분석할 수 있도록 해주기 때문에 파마론은 이를 통해 친화성 포획에 대한 최적 조건을 신속하게 파악할 수 있었습니다. 이는 공정 성능을 크게 향상시키고 고순도 단량체 바이러스 생성을 촉진합니다.
안녕하세요, 저는 데이먼 호입니다. 리버풀에 위치한 파마론 바이오로직스 UK에서 과학 연구원 3급으로 근무하고 있습니다. 오늘 발표에 귀 기울여 주셔서 감사합니다. 리버풀 존 무어스 대학교를 통해 파마론 바이오로직스에서 학생 인턴십 기간 동안 이 연구를 완료하게 되어 매우 자랑스럽습니다. 그리고 JMP가 포획 크로마토그래피 단계 최적화 성공에 큰 역할을 했다는 사실을 알려드리게 되어 더욱 기쁩니다.
포스터의 첫 번째 부분으로 넘어가겠습니다. 파마론(Pharmaron)에 대해 잘 모르시는 분들을 위해 소개드리자면, 저희는 전 세계적으로 사업을 운영하는 선도적인 제약 연구 개발 서비스 제공업체입니다. 리버풀 사무소에서는 현재 바이러스 벡터 기반 유전자 치료제 개발 및 임상 생산에 주력하고 있으며, 특히 아데노 관련 바이러스(AAV)에 집중하고 있습니다.
파마론은 그림 1에서 보여주는 것처럼 여러 AAV 혈청형과 제품을 생산할 수 있는 뛰어난 플랫폼 공정을 보유하고 있습니다.
이 공정은 심층 여과, 포획 크로마토그래피, 중간 정제 크로마토그래피, 정제 크로마토그래피를 거쳐 제형화 단계로 진행되며, 마지막으로 멸균 여과를 거칩니다.
이제 저희 로봇과 JMP 활용법을 소개해 드리겠습니다. 그림 2와 그림 3에서 보시는 바와 같이, 저희는 Beckman Biomek i7이라는 최첨단 고처리량 공정 개발 로봇을 보유하고 있으며, 이 로봇을 통해 제품이 저희 플랫폼에 적합한지 신속하게 평가하고, 최종적으로 공정에 원활하게 통합될 수 있도록 매개변수를 조정할 수 있다는 점을 매우 자랑스럽게 생각합니다.
이 로봇을 HTPD에 활용하고 JMP를 DoE에 사용하면 기존 방식에 비해 훨씬 짧은 시간 안에 고수율, 고순도 의약품을 생산할 수 있습니다.
본 포스터는 AAV 제품 개발을 위한 플랫폼 공정에서 초기 포획 크로마토그래피 단계를 최적화하는 데 중점을 두고 있습니다.
최적의 처리 조건을 결정하기 위해 JMP 소프트웨어를 사용하여 실험설계(DoE)를 설계했습니다. 최적화 대상으로는 체류 시간, 투입 밀도, 투입 pH의 세 가지 요인을 선택했으며, 바이러스 역가와 바이러스 응집도를 측정 변수로 설정했습니다.
이제 JMP에서 실험계획법(DoE)을 어떻게 설계했는지 간단히 설명드리겠습니다. 실험계획법 설계에 중심합성설계(CCD)를 선택한 데에는 여러 가지 이유가 있습니다. 첫째, 주효과를 추정하는 데 필요한 요인 조합의 수가 최소화되고, 둘째, 이차 효과와 2차 효과를 분석할 수 있기 때문입니다.
CCD는 적합성 부족 감지 기능도 뛰어나 선택된 결과에 영향을 미치는 요인을 쉽게 파악할 수 있으며, 포스터에서 볼 수 있듯이 JMP에서 제공하는 다양한 도구를 통해 그래프 분석도 가능합니다.
CCD는 JMP에서 반응 표면 설계를 선택하고, 로딩 pH, 로딩 밀도, 체류 시간 등의 매개변수 이름을 입력한 후, 미리 정의된 상한 및 하한 범위를 입력하여 생성되었습니다. 목표는 단량체 바이러스 함량과 바이러스 캡시드 회수율을 최대화하는 것이었으므로, 이러한 값들을 반응 영역에 입력했습니다.
이 소프트웨어는 매우 유연하여 완성된 모델에 언제든지 더 많은 반응 변수를 추가할 수 있습니다. 이 경우, 일반적인 CCD 모델이었기 때문에 한쪽 면만 선택했습니다. 중심점에 대해서는 3회 반복 측정을 선택했습니다. 그런 다음 CCD 모델을 생성할 준비가 되었습니다. 총 17가지의 서로 다른 실험 조건이 CCD 모델을 통해 생성되었으며, 각 조건은 낮은, 중간, 높은 매개변수 값을 가집니다. 중심점은 CCD 모델의 기초를 이루는 모든 중간 매개변수 값으로 정의되며, 낮은 매개변수와 높은 매개변수 값은 요인들이 어떻게 상호작용하고 서로에게 영향을 미치는지 검증하는 데 사용됩니다.
이를 통해 요인 간 상호작용을 상당히 정확하게 예측할 수 있는 3차원 반응 표면을 생성할 수 있습니다. JMP를 사용하면 최종 조건을 가설로 설정하고 후속 검증 실행을 통해 테스트할 수 있습니다.
당사의 HTPD 로봇은 매우 작은 규모로 포획 크로마토그래피를 수행하는 데 활용되어 여러 조건을 동시에 진행할 수 있었으며, 이는 실험실 규모에서라면 훨씬 더 오랜 시간이 걸렸을 것입니다. 이 시스템은 자동화된 특성 덕분에 매우 정확하고 재현성 있는 공정을 가능하게 합니다.
Biomek i7 플랫폼에서 모든 조건을 실행한 후, 효소결합면역흡착법(ELISA), 단축형 이중화기(dualizer), 그리고 다각도 동적 광산란법(MADLS)으로 알려진 방법을 사용하여 세계적 수준의 분석 기술을 활용해 AAV 캡시드 역가를 측정했습니다.
단량체 바이러스 함량은 기존의 동적 광산란법(DLS)으로 측정했습니다. JMP는 실험 연구 설계뿐만 아니라 결과 분석에도 이러한 방식을 적용하고 있습니다.
분석 데이터가 확보되면 JMP에 입력하여 그림 4, 그림 4a, 4b, 4c에 표시된 것과 같은 다양한 방식으로 시각화할 수 있었습니다. 수만 개의 가상 결과를 생성하는 시뮬레이션을 실행하여 최적화된 모델을 구축하고 실제 실험 데이터와 비교하여 모델의 신뢰도를 높였습니다. 이는 그림 5에 나타나 있습니다.
등고선 그래프는 로딩 밀도가 높을수록 바이러스 단량체 함량이 증가하는 것을 보여주며, 이는 그림 4a에서 갈색으로 나타납니다. 그러나 그림 4b에서 강조된 캡시드 ELISA 회수율 분석 결과, 로딩 밀도가 낮을수록 캡시드 수율이 가장 높은 것으로 나타났습니다(여기서도 갈색으로 표시됨). 하지만 그림 4c의 MADLS 데이터는 로딩 밀도가 높을수록 바이러스 단량체 함량이 증가한다는 것을 뒷받침하는 증거를 제시하며, 이는 그림 4b의 오른쪽 하단 모서리에 있는 빨간색과 주황색으로 나타납니다.
중요한 고려 사항은 MADLS가 응집체를 측정하지 않으므로 DLS 결과를 뒷받침한다는 점입니다. pH와 체류 시간은 캡시드 역가, MADLS 또는 DLS 결과에 유의미한 영향을 미치지 않았으므로 이 포스터에는 등고선 그래프가 포함되어 있지 않습니다.
이제 분석 결과를 해석해 보겠습니다. 분석된 세 가지 학습 조건 중 학습 밀도가 캡시드 회복률과 AAV의 단량체 특성에 가장 큰 영향을 미쳤으며, 이는 그림 6에 나타난 예측 프로파일러의 왼쪽 그래프에서 선의 가파른 기울기로 확인할 수 있습니다.
중앙 그래프에 나타난 체류 시간은 단량체 바이러스 또는 캡시드 ELISA 회수율에 뚜렷한 영향을 미치지 않았으며, 이는 예측 프로파일러의 거의 수평선으로 나타납니다.
오른쪽 그래프에 나타난 로딩 pH는 캡시드 회수율이나 단량체 바이러스에 큰 영향을 미치지 않았으며, 단량체 바이러스는 거의 수평선을 이루고 있습니다.
실험설계도(DoE)에서 제시하는 최적 조건은 체류 시간을 단축하고 pH 조건 A에서 로딩하는 동시에 로딩 밀도를 높이는 것입니다. 이는 모델의 이상적인 결과로, 로딩 밀도가 높을수록 동일한 목표 로딩 밀도를 달성하는 데 필요한 포획 크로마토그래피 매체의 양이 줄어듭니다.
체류 시간이 짧아지면 처리 속도가 빨라져 AAV 로딩 단계가 간소화됩니다.
pH 조건 A를 적용하는 것도 이상적인데, 이는 로딩 재료의 pH를 조절할 필요가 없어 로딩 재료 준비 시간을 절약할 수 있기 때문입니다.
실험부(DoE)에서 결정한 최적화된 투여 조건을 사용하여 확인 실험을 수행하여 DoE 결과를 검증할 수 있습니다. 검증이 완료되면 이러한 최적 조건을 사용하여 고품질, 고순도, 저불순물 AAV 제품을 생산하도록 특별히 설계된 대규모 생산 실험을 진행할 수 있습니다.
이러한 접근 방식을 통해 자원 소모와 비용을 최소화하면서 신속하게 평가를 수행하여 Pharmaron 플랫폼 공정의 포획 크로마토그래피 단계를 최적화할 수 있었습니다.
최적화 실험은 총 3일 만에 완료되었습니다. 만약 실험실 규모였다면 완료하는 데 수 주가 걸렸을 뿐 아니라 훨씬 더 많은 AAV 재료가 사용되었고, 규모를 확대할 경우 한 번에 하나의 조건만 실행할 수 있기 때문에 비용도 훨씬 더 많이 들었을 것입니다.
JMP 소프트웨어와 당사의 HTPD(고처리량 제품 개발) 역량을 결합하여 사용하면 특정 유전자 치료 제품 요구 사항에 맞춰 플랫폼 프로세스를 강력하게 최적화할 수 있습니다. 이는 공정 개발 과정에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계인 타당성 검토 및 최적화 단계를 크게 단축시켜 줍니다. 궁극적으로 이는 제품 개발부터 임상 현장에서 환자에게 유전자 치료 제품을 성공적으로 제공하기까지 걸리는 시간을 획기적으로 줄여줍니다.
제 포스터 발표를 경청해 주셔서 감사드리며, 파마론에서 할 수 있는 일들과 제품 개발 과정에서 JMP(제네릭 의약품 허가 프로그램)의 중요성에 대해 몇 가지 유용한 정보를 얻으셨기를 바랍니다. 감사합니다.
