ファーマロン社は、アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療薬を製造するためのプラットフォームプロセスを開発しました。このプロセスは、多様なAAV製品および血清型に対応できる高度な適応性を備えたツールボックスによって実現されます。当社のツールボックスは、製造可能性評価を通じて製品とプラットフォームとの適合性を迅速に評価し、ターゲットを絞ったプロセス最適化のために多数のパラメータを微調整することができます。
Pharmaron社の最適化アプローチにおける重要なツールの1つは、実験計画法（DOE）です。本稿では、中心複合DOEアプローチを用いて、初期AAV精製プロセスの捕捉ステップにおける最適な滞留時間、負荷密度、および負荷pHを特定することで、モノマーAAVの回収率を最大化する方法を示します。最適な負荷条件は、カプシドELISAおよび多角度動的光散乱（MADLS）による力価測定と、DLSによるモノマー含有率測定によって決定しました。DOE分析の結果、負荷密度とモノマー含有量の間には強い相関関係があり、負荷密度が高いほどモノマーウイルスの収量が高くなることが示されました。負荷pHと滞留時間は、回収率とモノマー性にほとんど影響を与えませんでした。
DOE（実験計画法）は、複数のパラメータを短時間で分析できるため、Pharmaron社はアフィニティーキャプチャーの最適条件を迅速に特定することができました。これにより、プロセス性能が大幅に向上し、高純度の単量体ウイルスの生成が促進されます。
こんにちは、デイモン・ホーと申します。リバプールを拠点とするファーマロン・バイオロジクスUKのサイエンティフィック・アソシエイトIIIです。この講演にご参加いただきありがとうございます。リバプール・ジョン・ムーアズ大学の学生インターンシップ期間中にファーマロン・バイオロジクスでこの研究を完成させることができたことを大変誇りに思っています。そして、キャプチャークロマトグラフィー工程の最適化においてJMPが大きな役割を果たしたことを、さらに嬉しく思います。
ポスターの最初のセクションに移ります。弊社についてまだご存知でない方のために、ファーマロン社をご紹介いたします。弊社は、世界中で事業を展開する大手医薬品研究開発サービスプロバイダーです。リバプールでは現在、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療の開発と臨床製造に取り組んでおり、特にアデノ随伴ウイルス（AAV）に注力しています。
ファーマロン社では、図1に示すように、複数のAAV血清型および製品を製造できる優れたプラットフォームプロセスを有しています。
このプロセスでは、深層ろ過、続いて捕捉クロマトグラフィー、中間精製クロマトグラフィー、続いて精製クロマトグラフィー、製剤化工程、そして最後に滅菌ろ過という工程を経ています。
それでは、当社のロボットとJMPの使用方法についてご紹介します。図2と図3に示すように、当社は最先端のハイスループットプロセス開発ロボットであるBeckman Biomek i7を保有しており、このロボットは製品が当社のプラットフォームに適合するかどうかを迅速に評価し、最終的に当社のプロセスにシームレスに統合するためのパラメータを調整することができます。このロボットを皆様にご紹介できることを大変誇りに思います。
このロボットをHTPDに利用し、JMPをDoEに用いることで、従来の方法に比べてはるかに短い時間で、高収率かつ高純度の医薬品を製造することが可能になります。
このポスターでは、AAV製品を製造する当社のプラットフォームプロセスにおける、最初の捕捉クロマトグラフィー工程の最適化に焦点を当てています。
処理における最適な負荷条件を決定するために、JMPソフトウェアを用いて実験計画法（DoE）を設計した。最適化対象として、滞留時間、負荷密度、負荷pHの3つの因子を選択し、出力としてウイルス力価とウイルス凝集度を測定した。
さて、JMPでDoEがどのように設計されたかについて簡単に説明します。DoEを作成するために中心複合計画（CCD）が選択された理由はいくつかあります。まず、主効果を推定するために必要な因子の組み合わせの数が最小限で済み、2因子交互作用と二次効果を分析できることです。
CCDには適合度不足の検出機能も優れており、選択した結果に影響を与える要因を容易に示すことができます。また、ポスター全体を通してご覧いただけるように、JMPで利用可能なさまざまなツールを通してグラフ分析も可能です。
CCDは、まず応答曲面設計を選択し、pH負荷量、密度負荷量、滞留時間というパラメータ名を入力し、次に定義済みの高値範囲と低値範囲を入力することで、JMPで作成されました。目標は、モノマーウイルス含有量とウイルスキャプシド回収率を最大化することだったので、これらの値は応答セクションに入力されました。
このソフトウェアは非常に柔軟性が高く、完成したモデルにいつでも応答を追加できます。この例では、従来型のCCDであったため、1つの面が選択されました。中心点には3回の測定値が選択されました。その後、CCDの生成準備が整いました。合計で、低、中、高のパラメータを変化させたCCDモデルを介して17種類の実験条件が生成されました。中心点は、CCDモデルの基礎を形成するすべての中パラメータとして定義され、低および高パラメータは、要因がどのように相互作用し、互いに影響し合うかをテストするためのプローブとして機能します。
これにより、因子間の相互作用をかなり正確に予測できる3次元応答曲面が形成されます。JMPを使用することで、最終的な条件を仮説として立て、後続の確認実験で検証することができます。
当社が開発したHTPDロボットは、非常に小規模な捕捉クロマトグラフィーを実施するために活用され、複数の条件を同時に実行することが可能になりました。これは、従来の実験室規模では相当な時間を要していたでしょう。このシステムは自動化されているため、非常に高精度で再現性の高いプロセスを実現します。
Biomek i7プラットフォーム上で全ての条件を実行した後、世界最高水準の分析技術を用いて、酵素結合免疫吸着法、短縮型デュアライザー、およびMADLSとしても知られる多角度動的光散乱法により、AAVカプシド力価を測定しました。
モノマーウイルス含有量は、従来の動的光散乱法（DLS）によって測定されました。JMPは、実験研究の設計だけでなく、結果の分析にも利用されています。
分析データが利用可能になると、JMPに入力され、図4、図4a、4b、4cに示すような対比プロットなど、さまざまな方法でデータを視覚化できるようになりました。シミュレーションを実行して数万の仮想結果を生成し、最適化されたモデルの構築に役立てるとともに、実際の実験データと比較することでモデルの信頼性を高めました。これは図5に示されています。
等高線図は、図4aで茶色で示されているように、ウイルスモノマー含有量が増加する高負荷密度の影響を強調しています。しかし、図4bで強調されているカプシドELISA回収を分析したところ、ここでも茶色で示されている低負荷密度が最高のカプシド収量をもたらすことがわかりました。これは、図4cに示すMADLSデータによって異議を唱えられました。このデータは、右下隅の茶色、赤、オレンジで示されているように、高負荷密度がウイルスモノマー含有量を増加させる影響を裏付ける証拠を提供しました。
重要な考慮事項として、MADLSは凝集体を測定しないため、DLSの結果を裏付けています。pHと滞留時間はカプシド力価、MADLS、DLSの結果に大きな影響を与えなかったため、等高線図はこのポスターには含まれていません。
それでは、結果の解釈に移りましょう。分析した3つの学習条件のうち、学習密度がカプシドの回復とAAVの単量体性に最も大きな影響を与えました。これは、図6に示す予測プロファイラーの左側のグラフト上の線の急勾配によって視覚化されています。
中央のグラフに示されている滞留時間は、単量体ウイルスやカプシドのELISA回収率にも顕著な影響を与えなかった。これは、予測プロファイラーのほぼ水平な線で示されている。
右のグラフに示されているように、負荷時のpHもカプシドの回収率やモノマーウイルスに大きな影響を与えず、これもほぼ水平線を示しています。
DoEが提案する最適条件は、滞留時間を短縮し、pH条件Aで負荷密度を高めることです。負荷密度が高いほど、同じ目標負荷密度を達成するために必要な捕捉クロマトグラフィー媒体の使用量が少なくなるため、これはモデルの理想的な結果と言えます。
滞留時間が短くなることで処理速度も向上し、AAVのロード段階が効率化される。
pH条件Aでのロードは、ロード材料のpH調整が不要なため、ロード材料の準備時間を節約できるという点でも理想的です。
DoEによって決定されたこれらの最適化された負荷条件を用いて、確認実験を行い、DoEの出力結果を検証することができます。確認が取れたら、これらの最適条件をスケールアップした実験に用いることができます。この実験は、高品質、高純度、低不純物のAAV製品を得るために特別に設計されています。
このアプローチにより、リソース消費量とコストを抑えながら迅速に評価を行い、当社のPharmaronプラットフォームプロセスにおける捕捉クロマトグラフィー工程を最適化することができました。
最適化実験は合計でわずか3日間で完了しました。もしこれが実験室規模であれば、完了までに何週間もかかり、AAV材料の使用量も大幅に増加し、一度に実行できる条件が1つしかないため、規模拡大に伴うコストもはるかに高額になったでしょう。
JMPソフトウェアと当社のHTPD機能を組み合わせることで、特定の遺伝子治療製品のニーズに合わせてプラットフォームプロセスを徹底的に最適化することが可能になります。これにより、プロセス開発プロセスの中で最も時間のかかる段階である実現可能性調査と最適化の段階が大幅に短縮されます。結果として、製品開発から臨床現場で患者に遺伝子治療製品を届けるまでの期間が劇的に短縮されます。
最後に、私のポスター発表をお聞きいただき、ありがとうございました。ファーマロンの取り組みや、製品開発プロセスにおけるJMPの重要性について、少しでもご理解いただけたなら幸いです。ありがとうございました。
