Pharmaron ha sviluppato una piattaforma per la generazione di terapie geniche basate su virus adeno-associati (AAV), dotata di un set di strumenti altamente adattabile per la gestione di diversi prodotti e sierotipi di AAV. Il nostro set di strumenti consente di valutare rapidamente la compatibilità di un prodotto con la nostra piattaforma attraverso una valutazione di fattibilità produttiva e di ottimizzare con precisione una serie di parametri per un'ottimizzazione mirata del processo.
Uno strumento essenziale per l'approccio di ottimizzazione di Pharmaron è il DOE (Design of Experiments). Mostriamo come un approccio DOE a composizione centrale possa massimizzare il recupero di AAV monomerico identificando il tempo di residenza ottimale, la densità di caricamento e il pH di caricamento per la fase di cattura del processo di purificazione iniziale di AAV. Le condizioni di caricamento ottimali sono state misurate utilizzando il titolo tramite ELISA del capside e diffusione dinamica della luce multi-angolo (MADLS) e la percentuale di monomero tramite DLS. L'analisi DOE ha mostrato una forte correlazione tra densità di caricamento e contenuto di monomero, per cui una maggiore densità di caricamento ha comportato una maggiore resa di virus monomerico. Il pH di caricamento e il tempo di residenza hanno avuto effetti trascurabili sul recupero e sulla monomericità.
Grazie alla sua capacità di facilitare l'analisi di molteplici parametri in una frazione del tempo, il DOE ha permesso a Pharmaron di identificare rapidamente le condizioni ottimali per la cattura per affinità. Ciò migliora significativamente le prestazioni del processo e favorisce la generazione di un virus monomerico ad elevata purezza.
Ciao, mi chiamo Damon Ho e sono Scientific Associate III presso Pharmaron Biologics UK, con sede a Liverpool. Grazie per aver seguito questa presentazione. Sono davvero orgoglioso di aver completato questo lavoro durante il mio tirocinio studentesco presso Pharmaron Biologics, tramite la Liverpool John Moores University. E sono ancora più felice di annunciare che JMP ha avuto un ruolo fondamentale nel successo dell'ottimizzazione della nostra fase di cromatografia di cattura.
Passiamo ora alla prima sezione del poster. Per presentare Pharmaron a chi non ci conoscesse, siamo un'azienda leader nella fornitura di servizi di ricerca e sviluppo farmaceutico con attività a livello globale. A Liverpool, ci occupiamo attualmente dello sviluppo e della produzione clinica di terapie geniche basate su vettori virali, concentrandoci in particolare sui virus adeno-associati (AAV).
In Pharmaron disponiamo di una piattaforma di processo all'avanguardia in grado di produrre molteplici sierotipi e prodotti AAV, come illustrato nella Figura 1.
Questo processo utilizza la filtrazione profonda, seguita dalla cromatografia di cattura, quindi la cromatografia di purificazione intermedia, seguita dalla cromatografia di purificazione, sulle nostre fasi di formulazione e, infine, la filtrazione sterile.
Ora vi presenterò il nostro robot e l'utilizzo di JMP. Siamo estremamente orgogliosi di annunciare che disponiamo di un robot all'avanguardia per lo sviluppo di processi ad alta produttività, chiamato Beckman Biomek i7, come potete vedere nelle Figure 2 e 3, in grado di valutare rapidamente l'idoneità di un prodotto alla nostra piattaforma e di ottimizzare i parametri per una perfetta integrazione nel nostro processo.
Utilizzando questo robot per l'HTPD insieme all'uso di JMP per DoE, possiamo generare un prodotto farmaceutico ad alta resa e alta purezza in una frazione del tempo rispetto ai metodi convenzionali.
Questo poster si concentra sull'ottimizzazione della fase iniziale di cromatografia di cattura nel nostro processo di piattaforma per un prodotto AAV.
È stato progettato un DoE (Design of Experiments) utilizzando il software JMP per determinare le condizioni di caricamento ottimali per il processo. Sono stati scelti tre fattori da ottimizzare: il tempo di residenza, la densità di caricamento e il pH di caricamento, con il titolo virale e l'aggregazione virale come parametri di output.
Ora, ecco alcune brevi informazioni su come è stato progettato il DoE in JMP. È stato scelto un disegno composito centrale, o CCD, per creare il DoE per una serie di motivi. In primo luogo, perché richiede un numero minimo di combinazioni di fattori per stimare gli effetti principali ed è in grado di analizzare le interazioni tra due fattori e gli effetti quadratici.
Il CCD presenta anche una buona capacità di rilevamento della mancanza di adattamento, che può facilmente mostrare quali fattori influenzano il risultato scelto, e l'analisi grafica è possibile tramite vari strumenti disponibili in JMP, come si può vedere nel poster.
Il CCD è stato creato in JMP selezionando innanzitutto un disegno di superficie di risposta, inserendo i nomi dei parametri di pH di caricamento, densità di caricamento e tempo di residenza, e infine inserendo gli intervalli predefiniti di valori massimi e minimi. L'obiettivo era massimizzare il contenuto di virus monomerico e il recupero del capside virale, quindi questi parametri sono stati inseriti nella sezione delle risposte.
Il software è molto flessibile ed è sempre possibile aggiungere ulteriori risposte al modello finale. In questo caso, trattandosi di un CCD convenzionale, è stata selezionata l'opzione "una faccia". Sono state selezionate tre misurazioni per il punto centrale. Il CCD era quindi pronto per essere generato. In totale, sono state generate 17 diverse condizioni sperimentali tramite il modello CCD con parametri bassi, medi e alti variabili. I punti centrali sono definiti come tutti i parametri medi che costituiscono la base del modello CCD, mentre i parametri bassi e alti fungono da sonde per testare come i fattori interagiscono e si influenzano reciprocamente.
Questo crea una superficie di risposta tridimensionale in grado di prevedere con notevole precisione le interazioni tra i fattori. Utilizzando JMP, è quindi possibile ipotizzare le condizioni ottimali e verificarle in una successiva fase di conferma.
Il nostro robot HTPD è stato utilizzato per eseguire la cromatografia di cattura su scala molto ridotta, consentendo l'esecuzione simultanea di diverse condizioni, operazione che avrebbe richiesto tempi considerevolmente più lunghi su scala di laboratorio. Questo sistema, grazie alla sua natura automatica, permette di ottenere un processo estremamente preciso e riproducibile.
Una volta eseguite tutte le prove sulla piattaforma Biomek i7, abbiamo utilizzato le nostre analisi di livello mondiale per misurare il titolo del capside AAV mediante un test immunoenzimatico (ELISA), un dualizzatore abbreviato e la diffusione dinamica della luce multiangolo, nota anche come MADLS.
Il contenuto virale monomerico è stato misurato mediante diffusione dinamica della luce convenzionale o DLS. JMP non si limita a utilizzare la progettazione di uno studio sperimentale, ma lo fa anche nell'analisi dei risultati.
Una volta disponibili i dati analitici, questi sono stati inseriti in JMP, consentendo la visualizzazione in diversi modi, tra cui i grafici di controllo mostrati nelle Figure 4a, 4b e 4c. È stata eseguita una simulazione per generare decine di migliaia di risultati virtuali, utili per costruire un modello ottimizzato e per confrontarli con dati sperimentali reali, al fine di stabilire un livello di affidabilità del modello. Questo è illustrato nella Figura 5.
I grafici di contorno evidenziano l'impatto di una maggiore densità di carico, che aumenta il contenuto di monomeri virali, come mostrato in marrone nella Figura 4a. Tuttavia, analizzando il recupero del capside tramite ELISA, evidenziato nella Figura 4b, è emerso che una minore densità di carico, anch'essa mostrata in marrone, produce la resa di capside più elevata. Questo risultato è stato messo in discussione dai dati MADLS mostrati nella Figura 4c, che hanno fornito la prova a supporto dell'impatto di una maggiore densità di carico sull'aumento del contenuto di monomeri virali, mostrato in marrone e in rosso e arancione nell'angolo in basso a destra.
Un aspetto importante da considerare è che MADLS non misura gli aggregati, confermando quindi i risultati di DLS. Il pH e il tempo di residenza non hanno avuto un impatto significativo sul titolo del capside, sui risultati di MADLS o DLS, pertanto i grafici di contorno non sono inclusi in questo poster.
Ora possiamo passare all'interpretazione dei risultati. Dopo le tre condizioni di apprendimento analizzate, la densità di apprendimento ha avuto l'impatto più significativo sul recupero del capside e sulla natura monomerica dell'AAV, che è visualizzata dalla forte pendenza della linea sull'innesto sinistro del profilo predittivo mostrato in figura 6.
Il tempo di residenza mostrato nel grafico centrale non ha avuto alcun impatto significativo sul recupero del virus monomerico o del capside tramite ELISA, come indicato dalla linea quasi orizzontale del profilo di previsione.
Il pH di caricamento mostrato nel grafico a destra non ha avuto un impatto significativo sul recupero del capside o del virus monomerico, che presenta anch'esso una linea quasi orizzontale.
La condizione ottimale suggerita dal DoE è una maggiore densità di carico con un tempo di residenza più breve e il caricamento in condizioni di pH A. Questo è un risultato ideale del modello, poiché con una maggiore densità di carico si utilizza una minore quantità di materiale cromatografico di cattura per raggiungere la stessa densità di carico target.
Un tempo di permanenza più breve si traduce anche in un processo più rapido, che semplifica la fase di caricamento dell'AAV.
Il caricamento in condizioni di pH A è ideale anche perché non richiede la regolazione del pH del materiale di carico, consentendo così di risparmiare tempo durante la preparazione del materiale stesso.
Utilizzando queste condizioni di caricamento ottimizzate determinate dal DoE, è possibile eseguire una prova di conferma per verificare i risultati del DoE. Una volta confermate, queste condizioni ottimali possono essere utilizzate in una produzione su scala maggiore, specificamente progettata per ottenere un prodotto AAV di alta qualità, elevata purezza e basso contenuto di impurità.
Questo approccio ha permesso una valutazione rapida, con risorse limitate e costi ridotti, per ottimizzare la fase di cromatografia di cattura del nostro processo sulla piattaforma Pharmaron.
Complessivamente, gli esperimenti di ottimizzazione si sono svolti in soli tre giorni. Su scala di laboratorio, sarebbero state necessarie molte settimane per completare un'operazione del genere, oltre a un notevole consumo di materiale AAV e costi molto più elevati, dato che è possibile eseguire una sola condizione alla volta.
L'utilizzo del software JMP in combinazione con le nostre capacità HTPD ci consente di ottimizzare in modo efficace il processo della nostra piattaforma per adattarlo alle esigenze specifiche dei prodotti di terapia genica. Ciò accelera notevolmente le fasi di fattibilità e ottimizzazione, che spesso rappresentano le fasi più lunghe del percorso di sviluppo del processo. In definitiva, questo riduce drasticamente il tempo necessario dallo sviluppo del prodotto alla consegna con successo di un prodotto di terapia genica a un paziente in ambito clinico.
Vorrei concludere ringraziandovi per aver ascoltato la mia presentazione del poster e spero che abbiate appreso qualcosa di nuovo su ciò che Pharmaron è in grado di fare, nonché sull'importanza del JMP nel nostro percorso di sviluppo del prodotto. Grazie mille.
