Pharmaron hat ein Plattformverfahren zur Herstellung von Gentherapien mit adeno-assoziierten Viren (AAV) entwickelt, das über einen hochgradig adaptiven Werkzeugkasten zur Handhabung verschiedener AAV-Produkte und -Serotypen verfügt. Unser Werkzeugkasten ermöglicht eine schnelle Bewertung der Kompatibilität eines Produkts mit unserer Plattform durch eine Machbarkeitsstudie und die präzise Anpassung zahlreicher Parameter zur gezielten Prozessoptimierung.
Ein wesentliches Werkzeug für Pharmarons Optimierungsansatz ist die Versuchsplanung (Design of Experiments, DOE). Wir zeigen, wie ein zentral zusammengesetzter DOE-Ansatz die Ausbeute an monomerem AAV maximieren kann, indem er die optimale Verweilzeit, Beladungsdichte und den optimalen pH-Wert der Beladung für den ersten Aufreinigungsschritt von AAV ermittelt. Die optimalen Beladungsbedingungen wurden mittels Titerbestimmung durch Capsid-ELISA und dynamische Lichtstreuung unter verschiedenen Winkeln (Multi-Angle Dynamic Light Scattering, MADLS) sowie mittels Monomeranteilsbestimmung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen. Die DOE-Analyse zeigte einen starken Zusammenhang zwischen Beladungsdichte und Monomergehalt: Eine höhere Beladungsdichte führte zu einer höheren Ausbeute an monomerem Virus. pH-Wert und Verweilzeit der Beladung hatten vernachlässigbare Auswirkungen auf die Ausbeute und die Monomerität.
Da DOE die Analyse mehrerer Parameter in kürzester Zeit ermöglicht, konnte Pharmaron mithilfe dieser Methode die optimalen Bedingungen für die Affinitätsanreicherung schnell ermitteln. Dies verbessert die Prozessleistung signifikant und treibt die Herstellung eines hochreinen, monomeren Virus voran.
Hallo, mein Name ist Damon Ho und ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter III bei Pharmaron Biologics UK in Liverpool. Vielen Dank für Ihr Interesse an diesem Vortrag. Ich bin sehr stolz darauf, diese Arbeit im Rahmen meines Praktikums bei Pharmaron Biologics über die Liverpool John Moores University abgeschlossen zu haben. Umso mehr freue ich mich, Ihnen mitteilen zu können, dass JMP maßgeblich zum Erfolg der Optimierung unseres Capture-Chromatographie-Schritts beigetragen hat.
Kommen wir nun zum ersten Abschnitt des Posters. Für diejenigen, die Pharmaron vielleicht noch nicht kennen: Wir sind ein führender Anbieter von pharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsdienstleistungen mit weltweiter Präsenz. In Liverpool arbeiten wir derzeit an der Entwicklung und klinischen Herstellung von Gentherapien auf Basis viraler Vektoren, wobei unser Fokus aktuell auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) liegt.
Bei Pharmaron verfügen wir über einen beeindruckenden Plattformprozess, der die Herstellung mehrerer AAV-Serotypen und -Produkte ermöglicht und in Abbildung 1 dargestellt ist.
Bei diesem Verfahren werden Tiefenfiltration, gefolgt von Auffangchromatographie, Zwischenpolierchromatographie, Polierchromatographie, unseren Formulierungsschritten und schließlich Sterilfiltration eingesetzt.
Nun möchte ich Ihnen unseren Roboter und die Anwendung von JMP vorstellen. Wir sind sehr stolz darauf, Ihnen mitteilen zu können, dass wir über einen hochmodernen Prozessentwicklungsroboter mit hohem Durchsatz verfügen, den Beckman Biomek i7 (siehe Abbildung 2 und 3). Dieser kann schnell beurteilen, ob ein Produkt zu unserer Plattform passt, und anschließend die Parameter für die nahtlose Integration in unseren Prozess optimieren.
Durch den Einsatz dieses Roboters für HTPD in Verbindung mit JMP für DoE können wir ein Arzneimittelprodukt mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit in einem Bruchteil der Zeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erzeugen.
Dieses Poster konzentriert sich auf die Optimierung des ersten Capture-Chromatographie-Schritts in unserem Plattformprozess für ein AAV-Produkt.
Mithilfe der JMP-Software wurde ein Versuchsplan (DoE) erstellt, um die optimalen Beladungsbedingungen für die Verarbeitung zu ermitteln. Drei Faktoren wurden zur Optimierung ausgewählt: Verweilzeit, Beladungsdichte und pH-Wert der Beladung. Virustiter und Virusaggregation sollten als Zielgrößen gemessen werden.
Nun einige kurze Informationen zur Gestaltung des Versuchsdesigns in JMP. Aus mehreren Gründen wurde ein zentrales zusammengesetztes Design (CCD) gewählt. Erstens benötigt man damit nur eine minimale Anzahl an Faktorkombinationen, um Haupteffekte zu schätzen, und zweitens ermöglicht es die Analyse von Zwei-Faktor-Wechselwirkungen und quadratischen Effekten.
Das CCD verfügt außerdem über eine gute Funktion zur Erkennung von Anpassungsfehlern, die leicht aufzeigt, welche Faktoren das gewählte Ergebnis beeinflussen. Eine grafische Analyse ist über verschiedene in JMP verfügbare Werkzeuge möglich, wie Sie auf dem gesamten Poster sehen können.
Das CCD wurde in JMP erstellt, indem zunächst ein Response-Surface-Design ausgewählt, die Parameternamen für pH-Wert der Beladung, Beladungsdichte und Verweilzeit eingegeben und anschließend die vordefinierten oberen und unteren Bereiche festgelegt wurden. Ziel war die Maximierung des Gehalts an monomeren Viren und der Ausbeute an Viruskapsiden; diese Werte wurden daher im Abschnitt „Responses“ eingegeben.
Die Software ist sehr flexibel, und Sie können dem fertigen Modell jederzeit weitere Reaktionen hinzufügen. Da es sich in diesem Fall um ein herkömmliches CCD-Modell handelte, wurde die Messung einer Fläche ausgewählt. Für den Mittelpunkt wurden drei Messungen durchgeführt. Anschließend konnte das CCD-Modell generiert werden. Insgesamt wurden mithilfe des CCD-Modells 17 verschiedene Versuchsbedingungen mit variierenden niedrigen, mittleren und hohen Parametern generiert. Die Mittelpunkte umfassen alle mittleren Parameter, die die Grundlage des CCD-Modells bilden, während die niedrigen und hohen Parameter als Sonden dienen, um die Wechselwirkungen und gegenseitigen Einflüsse der Faktoren zu untersuchen.
Dadurch entsteht eine dreidimensionale Antwortfläche, die die Wechselwirkungen der Faktoren recht genau vorhersagen kann. Mithilfe von JMP lassen sich dann die optimalen Bedingungen ableiten und in einem nachfolgenden Bestätigungslauf testen.
Unser HTPD-Roboter wurde für die Aufreinigungschromatographie im Kleinstmaßstab eingesetzt, wodurch mehrere Bedingungen gleichzeitig untersucht werden konnten, was im Labormaßstab deutlich länger gedauert hätte. Dank seiner Automatisierung ermöglicht dieses System einen hochpräzisen und reproduzierbaren Prozess.
Nachdem alle Bedingungen auf der Biomek i7-Plattform erfüllt waren, nutzten wir unsere erstklassigen Analysemethoden, um den AAV-Kapsidtiter mittels eines enzymgebundenen Immunadsorptionstests, eines verkürzten Dualisators und einer dynamischen Lichtstreuung unter verschiedenen Winkeln, auch bekannt als MADLS, zu messen.
Der Gehalt an monomeren Viren wurde mittels konventioneller dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. JMP nutzt die Methode nicht nur für die Planung experimenteller Studien, sondern auch für die Auswertung der Ergebnisse.
Nachdem die Analysedaten vorlagen, wurden sie in JMP eingegeben und konnten auf verschiedene Weise visualisiert werden, unter anderem durch Gegendiagramme (siehe Abbildung 4, 4a, 4b und 4c). Mithilfe einer Simulation wurden Zehntausende virtuelle Ergebnisse generiert, die zur Optimierung des Modells beitragen und mit realen experimentellen Daten verglichen werden, um dessen Zuverlässigkeit zu erhöhen. Dies ist in Abbildung 5 dargestellt.
Die Konturdiagramme verdeutlichen den Einfluss einer höheren Beladungsdichte, die den Gehalt an viralen Monomeren erhöht (siehe Abb. 4a, braun dargestellt). Die Analyse der Kapsid-ELISA-Ausbeute (Abb. 4b) ergab jedoch, dass eine niedrigere Beladungsdichte (ebenfalls braun dargestellt) die höchste Kapsidausbeute liefert. Dies steht im Widerspruch zu den MADLS-Daten in Abb. 4c, die den Einfluss einer höheren Beladungsdichte auf den Gehalt an viralen Monomeren bestätigen (siehe braune, rote und orangefarbene Bereiche unten rechts).
Wichtig ist, dass MADLS keine Aggregate misst und somit die DLS-Ergebnisse bestätigt. pH-Wert und Verweilzeit hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Kapsidtiter, die MADLS- oder die DLS-Ergebnisse; daher sind die Konturdiagramme nicht in diesem Poster enthalten.
Nun können wir uns der Interpretation der Ergebnisse zuwenden. Von den drei analysierten Lernbedingungen hatte die Lerndichte den größten Einfluss auf die Kapsid-Wiederherstellung und die monomere Natur des AAV, was durch den steilen Gradienten der Linie auf dem linken Teil des prädiktiven Profilers in Abbildung 6 veranschaulicht wird.
Die im zentralen Diagramm dargestellte Verweilzeit hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die Wiederfindung von monomeren Viren oder Kapsiden mittels ELISA, was durch die nahezu horizontale Linie des Vorhersageprofils verdeutlicht wird.
Der im rechten Diagramm dargestellte pH-Wert der Beladung hatte ebenfalls keinen signifikanten Einfluss auf die Kapsidgewinnung oder das monomere Virus, dessen Linie ebenfalls nahezu horizontal verläuft.
Die vom Versuchsdesign (DoE) vorgeschlagene optimale Bedingung ist eine höhere Beladungsdichte bei kürzerer Verweilzeit und Beladung unter pH-Bedingung A. Dies ist ein ideales Ergebnis des Modells, da bei einer höheren Beladungsdichte weniger Auffangchromatographiemedium benötigt wird, um die gleiche Zielbeladungsdichte zu erreichen.
Eine kürzere Verweilzeit führt auch zu einem schnelleren Prozess, was die Beladungsphase des AAV optimiert.
Das Beladen mit einem pH-Wert A ist ebenfalls ideal, da keine pH-Wert-Anpassung des Beladungsmaterials erforderlich ist, wodurch Zeit bei der Vorbereitung des Beladungsmaterials gespart wird.
Unter Verwendung dieser durch das Versuchsdesign (DoE) ermittelten optimierten Beladungsbedingungen kann anschließend ein Bestätigungslauf durchgeführt werden, um die DoE-Ergebnisse zu verifizieren. Nach der Bestätigung können diese optimalen Bedingungen dann in einem skalierten Versuch eingesetzt werden, der speziell darauf ausgelegt ist, ein hochwertiges, hochreines und verunreinigungsarmes AAV-Produkt zu erzielen.
Dieser Ansatz ermöglichte eine schnelle, ressourcenschonende und kostengünstige Bewertung zur Optimierung unseres Capture-Chromatographie-Schritts für unseren Pharmaron-Plattformprozess.
Die Optimierungsexperimente dauerten insgesamt nur drei Tage. Im Labormaßstab hätte dies viele Wochen in Anspruch genommen, zudem wäre deutlich mehr AAV-Material verbraucht und die Kosten wären bei einer Skalierung wesentlich höher gewesen, da jeweils nur eine Bedingung getestet werden kann.
Die Nutzung der JMP-Software in Verbindung mit unseren HTPD-Funktionen ermöglicht uns eine umfassende Optimierung unseres Plattformprozesses, um den spezifischen Anforderungen von Gentherapieprodukten gerecht zu werden. Dies beschleunigt die Machbarkeits- und Optimierungsphasen erheblich, die oft die zeitaufwändigsten Phasen der Prozessentwicklung darstellen. Letztendlich verkürzt dies die Zeitspanne von der Produktentwicklung bis zur erfolgreichen klinischen Anwendung eines Gentherapieprodukts drastisch.
Zum Schluss möchte ich mich bei Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit bei meiner Posterpräsentation bedanken und hoffe, dass Sie einiges über unsere Arbeit bei Pharmaron und die Bedeutung von JMP in unserem Produktentwicklungsprozess erfahren konnten. Vielen Dank.
