Pharmaron a développé une plateforme de production de thérapies géniques à base de virus adéno-associés (AAV) dotée d'une boîte à outils hautement adaptable permettant de gérer différents produits et sérotypes d'AAV. Cette boîte à outils permet d'évaluer rapidement la compatibilité d'un produit avec notre plateforme grâce à une étude de faisabilité de fabrication et d'ajuster avec précision de nombreux paramètres pour une optimisation ciblée du procédé.
L'un des outils essentiels de l'approche d'optimisation de Pharmaron est la planification d'expériences (DOE). Nous démontrons comment une approche DOE composite centrée permet de maximiser la récupération d'AAV monomérique en identifiant le temps de séjour, la densité de chargement et le pH optimaux pour l'étape de capture initiale du procédé de purification de l'AAV. Les conditions de chargement optimales ont été déterminées par titrage ELISA de capside et diffusion dynamique de la lumière multi-angle (MADLS), et par dosage du pourcentage de monomères par diffusion dynamique de la lumière (DLS). L'analyse DOE a révélé une forte corrélation entre la densité de chargement et la teneur en monomères : une densité de chargement plus élevée induit un rendement plus important en virus monomérique. Le pH et le temps de séjour ont eu des effets négligeables sur la récupération et la monomérisation.
Grâce à sa capacité à analyser de multiples paramètres en un temps record, la méthode DOE a permis à Pharmaron d'identifier rapidement les conditions optimales de capture par affinité. Elle améliore considérablement les performances du procédé et favorise la production d'un virus monomérique de haute pureté.
Bonjour, je m'appelle Damon Ho et je suis chargé de recherche III chez Pharmaron Biologics UK, à Liverpool. Merci de votre attention. Je suis très fier d'avoir réalisé ce travail lors de mon stage étudiant chez Pharmaron Biologics, dans le cadre du programme de l'Université John Moores de Liverpool. Je suis d'autant plus heureux d'annoncer que JMP a joué un rôle déterminant dans l'optimisation de notre étape de chromatographie de capture.
Passons à la première partie de l'affiche. Pour présenter Pharmaron à ceux qui ne nous connaissent pas encore, nous sommes un fournisseur de services de recherche et développement pharmaceutiques de premier plan, présent dans le monde entier. À Liverpool, nous travaillons actuellement sur le développement et la production clinique de thérapies géniques à base de vecteurs viraux, en nous concentrant notamment sur les virus adéno-associés (AAV).
Chez Pharmaron, nous disposons d'une plateforme de processus impressionnante qui peut fabriquer plusieurs sérotypes et produits AAV, comme illustré dans la figure 1.
Ce procédé utilise une filtration en profondeur, suivie d'une chromatographie de capture, puis d'une chromatographie de polissage intermédiaire, suivie d'une chromatographie de polissage, sur nos étapes de formulation, et enfin, une filtration stérile.
Je vais maintenant vous présenter notre robot et l'utilisation de JMP. Nous sommes extrêmement fiers de vous annoncer que nous disposons d'un robot de développement de procédés à haut débit de pointe, le Beckman Biomek i7 (voir figures 2 et 3), capable d'évaluer rapidement l'adéquation d'un produit à notre plateforme et d'optimiser les paramètres pour une intégration parfaite dans notre procédé.
En utilisant ce robot pour la HTPD et JMP pour la planification des expériences, nous pouvons générer un médicament à haut rendement et de haute pureté en un temps considérablement réduit par rapport aux méthodes conventionnelles.
Cette affiche se concentre sur l'optimisation de l'étape initiale de chromatographie de capture dans notre procédé de plateforme pour un produit AAV.
Un plan d'expériences (DoE) a été conçu à l'aide du logiciel JMP afin de déterminer les conditions de chargement optimales pour le traitement. Trois facteurs ont été sélectionnés pour l'optimisation : le temps de séjour, la densité de chargement et le pH de chargement. Le titre viral et l'agrégation virale ont été mesurés comme variables de sortie.
Voici quelques informations rapides sur la conception du plan d'expériences (DoE) dans JMP. Un plan composite centré (CCD) a été choisi pour plusieurs raisons. Premièrement, il permet d'estimer les effets principaux en un nombre minimal de combinaisons de facteurs, et deuxièmement, il permet d'analyser les interactions à deux facteurs et les effets quadratiques.
Le CCD possède également une bonne capacité de détection des défauts d'ajustement, ce qui permet de montrer facilement quels facteurs affectent le résultat choisi, et une analyse graphique est possible grâce à divers outils disponibles dans JMP, comme vous pouvez le constater sur l'affiche.
Le plan d'expériences composite centré (CCD) a été créé dans JMP en sélectionnant d'abord un plan de surface de réponse, puis en saisissant les noms des paramètres (pH de chargement, densité de chargement et temps de séjour) et enfin les plages de valeurs prédéfinies (haute et basse). L'objectif étant de maximiser la teneur en virus monomériques et la récupération de la capside virale, ces paramètres ont été saisis dans la section « Réponses ».
Le logiciel est très flexible et permet d'ajouter des réponses au modèle final. Dans ce cas précis, s'agissant d'un CCD conventionnel, une face a été sélectionnée. Trois mesures ont été effectuées pour le point central. Le CCD était alors prêt à être généré. Au total, 17 conditions expérimentales différentes ont été générées à l'aide du modèle CCD, avec des paramètres bas, moyens et élevés variables. Les points centraux correspondent à l'ensemble des paramètres moyens qui constituent la base du modèle CCD, les paramètres bas et élevés servant de sondes pour tester l'interaction et l'influence réciproque des facteurs.
On obtient ainsi une surface de réponse 3D capable de prédire avec une grande précision les interactions entre les facteurs. Grâce à JMP, il est alors possible de formuler des hypothèses sur les conditions ultimes et de les tester lors d'une expérience de confirmation ultérieure.
Notre robot HTPD a été utilisé pour réaliser la chromatographie de capture à très petite échelle, permettant ainsi de tester simultanément plusieurs conditions, ce qui aurait été beaucoup plus long à l'échelle du laboratoire. Grâce à son automatisation, ce système garantit un processus très précis et reproductible.
Une fois toutes les conditions exécutées sur la plateforme Biomek i7, nous avons utilisé nos outils d'analyse de classe mondiale pour mesurer le titre de capside AAV par un test immuno-enzymatique (ELISA), un dualiseur raccourci et une diffusion dynamique de la lumière multi-angle, également connue sous le nom de MADLS.
La teneur en virus monomériques a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). JMP utilise cette méthode non seulement pour la conception de l'étude expérimentale, mais aussi pour l'analyse des résultats.
Une fois les données analytiques disponibles, elles ont été intégrées à JMP, permettant leur visualisation de différentes manières, notamment par le biais de graphiques de comparaison présentés dans les figures 4, 4a, 4b et 4c. Une simulation a été réalisée afin de générer des dizaines de milliers de résultats virtuels, contribuant ainsi à l'élaboration d'un modèle optimisé et à sa comparaison avec des données expérimentales réelles, permettant d'évaluer la fiabilité du modèle. Ce résultat est illustré dans la figure 5.
Les courbes de niveau mettent en évidence l'impact d'une densité de chargement plus élevée, qui augmente la teneur en monomères viraux (représentée en brun sur la figure 4a). Cependant, l'analyse de la récupération des capsides par ELISA (figure 4b) a montré qu'une densité de chargement plus faible (également représentée en brun) permet d'obtenir le rendement en capsides le plus élevé. Ce résultat a été contredit par les données MADLS (figure 4c), qui ont démontré l'impact d'une densité de chargement plus élevée sur l'augmentation de la teneur en monomères viraux (représentée en brun, rouge et orange dans le coin inférieur droit).
Il est important de noter que la technique MADLS ne mesure pas les agrégats, confirmant ainsi les résultats obtenus par DLS. Le pH et le temps de résidence n'ont pas eu d'impact significatif sur le titre de capside ni sur les résultats MADLS ou DLS ; par conséquent, les graphiques de contours ne sont pas inclus dans cette affiche.
Nous pouvons maintenant passer à l'interprétation des résultats. Parmi les trois conditions d'apprentissage analysées, la densité d'apprentissage a eu l'impact le plus significatif sur la récupération de la capside et la nature monomérique de l'AAV, comme le montre la forte pente de la ligne sur le greffon gauche du profileur prédictif présenté dans la figure 6.
Le temps de résidence indiqué dans le graphique central n'a eu aucun impact notable sur la récupération ELISA du virus monomérique ou de la capside, comme l'indique la ligne quasi horizontale du profileur de prédiction.
Le pH de chargement indiqué dans le graphique de droite n'a pas non plus eu d'impact significatif sur la récupération de la capside ou du virus monomérique, qui présente également une ligne quasi horizontale.
La condition optimale suggérée par le plan d'expériences est une densité de chargement plus élevée, un temps de séjour plus court et un chargement au pH A. Il s'agit d'un résultat idéal du modèle car, avec une densité de chargement plus élevée, on utilise moins de support de chromatographie de capture pour atteindre la même densité de chargement cible.
Un temps de séjour plus court permet également un processus plus rapide, ce qui simplifie l'étape de chargement des AAV.
Le chargement dans des conditions de pH A est également idéal car il ne nécessite pas d'ajustement du pH du matériau de chargement, ce qui permet de gagner du temps lors de la préparation du matériau de chargement.
En utilisant ces conditions de chargement optimisées déterminées par le plan d'expériences (DoE), un essai de confirmation peut être réalisé afin de vérifier les résultats du DoE. Une fois confirmées, ces conditions optimales peuvent être utilisées dans une production à plus grande échelle, spécifiquement conçue pour obtenir un produit AAV de haute qualité, de haute pureté et à faible teneur en impuretés.
Cette approche a permis une évaluation rapide des besoins en ressources et des coûts, afin d'optimiser notre étape de chromatographie de capture pour notre procédé de plateforme Pharmaron.
Au total, les expériences d'optimisation ont été réalisées en seulement trois jours. À l'échelle du laboratoire, il aurait fallu de nombreuses semaines, sans compter la quantité bien plus importante de matériel AAV et les coûts considérablement plus élevés liés à l'augmentation de l'échelle, puisqu'une seule condition peut être testée à la fois.
L'utilisation du logiciel JMP, combinée à nos capacités HTPD, nous permet d'optimiser efficacement notre plateforme de production afin de répondre aux besoins spécifiques de nos produits de thérapie génique. Ceci accélère considérablement les phases d'étude de faisabilité et d'optimisation, souvent les plus chronophages du développement de procédés. Au final, cela réduit drastiquement le délai entre le développement du produit et sa mise à disposition réussie au patient en clinique.
Je tiens à vous remercier d'avoir assisté à ma présentation par affiche et j'espère que vous avez appris des choses intéressantes sur les activités de Pharmaron, ainsi que sur l'importance de JMP dans notre processus de développement de produits. Merci beaucoup.
