본 기사에서는 의약품의 분석법 개발에 있어서의 실험계획법(DOE)을 JMP를 이용하여 실시하는 예를 소개합니다.
최근, 분석법의 개발에 관한 가이드라인인 ICH-Q14의 정비가 진행되고 있어, 「보다 진행된 수법을 활용한 분석법」이 주목받고 있습니다.
분석법의 개발에 있어서 품질을 과학적 근거에 근거해 검토하는 수법은, AQbD(Analytical Quality by Design)라고 불리고, 그 실현 방법의 하나로서, 실험계획법(DOE)의 활용이 제창되고 있습니다.
예를 들어, 다음과 같은 HPLC의 구성에 있어서 최적의 조작 조건을 구하는 것이 분석법 개발의 일례로서 들 수 있습니다.
분석 예: HPLC의 작동 조건 최적화
목적：일본 약국방이 정하는 피크의 완전 분리(분리도 ≧ 1.5)를 실현하는 분석법을 개발한다.
이 목적을 실현하기 위해서, 실험계획법의 사고방식에 근거해 실험을 실시해, 얻어진 데이터로부터 완전 분리를 달성할 수 있는 조작 파라미터와 그 조건을 요구해 갑니다.
실험계획법에서는, 최적화나 모델화의 대상이 되는 특성치를 「 응답 」이라고 부르고, 분석법 개발에서는 분리도나 피크수 등이 해당합니다. 한편, 반응에 영향을 준다고 생각되는 조작 가능한 파라미터는 「 인자 」라고 불려 HPLC에서는 컬럼의 온도나 이동상의 유량 등이 해당합니다.
본 예에서는, "많은 인자로부터 중요한 인자를 좁히기 위한 실험(스크리닝 실험)"과, "스크리닝으로 좁힌 인자를 이용하여 보다 정밀도가 높은 모델(응답 곡면 모델)을 맞추고, 최적 조건을 구하는 실험(최적화 실험)"의 2개의 스텝으로 검토를 실시합니다.
- 스크리닝 실험 : 반응에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 여러 요인들로부터 효과적인 요인을 추출
- 최적화 실험(응답 곡면) : 응답 목표(최대화, 최소화 등)를 만족하는 요인 설정값을 구한다
JMP에서는, 대표적인 계획 작성 방법인 「 커스텀 계획 」을 이용해, 이하의 순서로 분석을 진행해 갑니다. 
1. 스크리닝 실험
목적: 분리도에 영향을 미치는 요인을 스크리닝한다.
위험 평가 결과, 분리 성능에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 5가지 요인(아래 그림 황색으로 표시)을 선정했습니다.
요인에 관한 조건은 다음과 같습니다.
| 요인 |
역할 |
하한 |
상한 |
| pH |
연속 |
7 |
9 |
| 컬럼 온도(℃) |
연속 |
35 |
45 |
| ACN（%） |
연속 |
30 |
50 |
| 유량(mL/분) |
연속 |
1.4 |
1.6 |
| 열 유형 |
카테고리 칼 |
C1, C2, C3, C4 |
pH: 이동상 완충액의 PH,Column Temp: 컬럼 온도,ACN (%) : 이동상의 유기 용매 (아세토 니트릴)의 비율
Flow Rate: 이동상의 유량,Column Type: 컬럼 종류(C1~C4의 4종류)
※본 사례는 이소크라틱 용리(이동상의 조성이 일정)의 예입니다.
계획 만들기
- "사용자 정의 계획"을 시작하고 "응답", "요인"을 설정하고 "모델"을 설정합니다.
- 여기에서는 모델(스크리닝의 대상이 되는 인자)으로서 주효과와 교호작용(“pH*Column Temp”, “pH*ACN”, “pH*Flow Rate”, “Column Temp*ACN”, “Column Temp*Flow Rate”, “ACN*Flow Rate”)을 포함합니다.
- 계획 작성에서 실험 횟수의 기본값(24회)을 선택합니다.
응답 값 입력, 모델 피팅
- 최적의 계획에 따라 24회의 실험이 제시되므로 실험을 수행하고 응답(분리도) 값을 입력합니다.
- 응답 값을 입력한 후 데이터 테이블 왼쪽 상단에 있는 "모델" 스크립트를 실행(녹색 ▷ 버튼을 클릭)하면 사용자 지정 계획에 지정된 모델이 적용됩니다.
모델 피팅, 중요 요인 스크리닝
표시된 보고서에서 '효과 요약'을 확인하고 P 값이 큰 요인을 순차적으로 삭제하는 '오차로 풀링'을 통해 중요 요인을 식별합니다.
이 예에서는 중요한 요인으로 "pH", "ACN", "Column Temp", "pH * Column Temp"이 선택되었습니다.
따라서 후속 최적화 실험에서는 pH, ACN 및 Column Temp을 인자로 사용합니다.
※여기에서는 「오차에의 풀링」을 이용해 중요 인자를 특정했습니다만, 스텝 와이즈법 등의 변수 선택 수법을 이용하는 방법도 있습니다.
2. 최적화 실험(응답 곡면)
이 단계에서는 Resolution(분리도)** 외에도 N of peaks(피크 수)를 응답으로 설정하여 응답 곡면을 만들고 최적화합니다.
고려할 응답과 요인은 다음과 같습니다.
| 응답 |
사양 |
| 해결 |
1.5 이상 |
| N개의 봉우리 |
6이상 |
| 요인 |
역할 |
하한 |
상한 |
| pH |
연속 |
7 |
9 |
| 컬럼 온도(℃) |
연속 |
35 |
45 |
| ACN(%) |
연속 |
30 |
50 |
계획 만들기
- "사용자 정의 계획"을 시작하고 "응답", "요인"을 설정합니다.
- 모델로 [RSM] 버튼으로 응답 곡면 모델을 지정합니다.
- 계획 작성에서 실험 횟수의 기본값(16회)을 선택합니다.
※응답 곡면 모델은, 주효과와 2차 교호작용, 제곱항을 효과에 포함하는 모델입니다.
※실험 횟수 16회로 작성되는 계획은 「중심 복합 계획(CCD)」과 일치합니다.
응답 값 입력, 응답 곡면 모델 적합
- 스크리닝 실험에서와 같이 응답 값을 입력하고 "모델" 스크립트를 실행하여 응답 곡면 모델을 적용합니다.
최적화, 디자인 공간 구축
- 보고서 "예측 프로파일"에서는 예측 수식에서 요인(가로축)과 응답(세로축)의 관계를 시각적으로 확인할 수 있습니다.
- 이 목표 (Resolution ≧ 1.5, N of peaks ≧ 6)를 충족하는 요인 조합을 최적화 및 만족도> 만족도 극대화로 탐색합니다 ( 최적화 ).
- 오른쪽 아래 그림이 최적화했을 때의 설정입니다.pH=8.38, Column Temp=40.98℃, ACN=30%일 때, Resolution의 예측값이 2.45, N of peaks의 예측값이 7.39가 되어, 응답의 사양을 만족하고 있습니다.
JMP의 "등고선 프로파일"을 사용하면 요인 공간의 사양을 충족하는 영역 ( 디자인 공간 )을 시각적으로 확인할 수 있습니다.
아래 그림은 최적화 조건에서 등고선입니다.Column Temp = 40.98℃로 고정하고 pH를 가로축, ACN을 세로축으로 했을 경우, 백색의 등고선 영역이 사양을 채우는 범위입니다.
디자인 스페이스를 구축할 때에는, 최적 조건 부근에서 확인 실험(최적 조건에서의 실험을 실시해, 얻어진 응답치가 사양을 만족하는지 확인)를 실시합니다.확인 실험의 결과, 문제가 없으면, 상기의 등고선도의 우하에 있는 백색의 영역내로부터, 고유 기술 요건도 고려한 구형의 영역을 디자인 스페이스로서 설정하는 것이 검토됩니다.
참고 정보
■신규 유저 사례：오노 약품 공업 주식회사님(분석법 개발에 관한 JMP의 활용예)
오노 약품 공업 주식회사 | JMP
■JMP를 이용한 실험계획법(DOE)의 기본 사항과 실시예(YouTube)
by 마스카와 나오히로(JMP Japan)
마스카와 나오히로 - JMP 사용자 커뮤니티
