Sarah Battenfield, PhD, Hybridweizenzüchterin, Syngenta
Abstrakt:
Viele Weizenzuchtprogramme haben sich auf die Steigerung des Brotweizenertrags konzentriert. Doch wenn man bedenkt, dass der Weizen zur Ernährung der wachsenden Bevölkerung des nächsten Jahrhunderts eingesetzt werden soll, sind Verarbeitungs- und Endverbrauchsqualität entscheidende Komponenten. Die Herausforderungen bei der Verbesserung der Endverbrauchsqualitätsmerkmale bestehen in den hohen Kosten und den zu testenden Saatgutmengen, was eine Selektion in frühen Zuchtpopulationen unmöglich macht. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur Ermittlung von Marker-Merkmals-Assoziationen innerhalb eines Zuchtprogramms mittels einer metagenomweiten Assoziationsstudie (GWAS) unter Verwendung von JMP Genomics. Diese Methode kombiniert GWAS-Analysen von mehrjährigen unausgewogenen Zuchtplantagen auf eine Weise, die Meta-GWAS bei der Entdeckung von Markern für menschliche Krankheiten widerspiegelt. Diese Methode erleichterte die Kartierung von Verarbeitungs- und Endverbrauchsqualitätsphänotypen aus fortgeschrittenen Zuchtlinien (n=4.095) des CIMMYT-Brotweizenzuchtprogramms von 2009 bis 2014. Mittels Meta-GWAS identifizierten wir Marker-Merkmals-Assoziationen, Alleleffekte und Kandidatengene und können anhand der in diesem Prozess generierten Marker selektieren. Schließlich kann dieser Ansatz in der züchtungsgestützten Genomik bei vielen Nutzpflanzen breit angewendet werden, um unser funktionelles Verständnis der Pflanzengenome erheblich zu erweitern.
Einführung:
Meta-Genomweite Assoziationsstudien (Meta-GWAS) werden häufig in der menschlichen Genomanalyse eingesetzt und basieren auf der Allelreplikation über mehrere Studien hinweg, um Aussagekraft zu gewinnen. In der Pflanzenzucht und -forschung sind diese Analysen aufgrund der Möglichkeit, Genotypen räumlich und zeitlich zu replizieren, unüblich. Im Zeitalter von Big Data und angesichts der Tatsache, dass die Kosten für die Phänotypisierung von Merkmalen unerschwinglich sind, stellt diese Methode jedoch eine interessante Alternative dar.
Methodik:
GWAS-Analysen werden in JMP-Genomics seit langem unterstützt. Für die QK-Analyse oder GWAS unter Berücksichtigung von Populationsstruktur und Verwandtschaft stehen leicht verständliche Arbeitsabläufe zur Verfügung.
Abbildung 1: QK Mixed Model Workflow
Ziel der vorliegenden Forschung war die Kartierung von Loci, die Einfluss auf Weizenqualitätsmerkmale haben und in einem großen angewandten Weizenzuchtprogramm gemessen wurden. Strukturkartierungen von Populationen zur Bestimmung der Weizenqualität sind nicht üblich, da diese Tests sehr teuer wären, viele Jahre und Wiederholungen dauern würden und große Mengen Saatgut erfordern würden. Da der Schwerpunkt der Datengenerierung auf der Ertragszüchtung lag und die Weizenqualität teuer und zweitrangig war, wurden die Linien nur einmal pro Jahr über mehrere Jahre hinweg getestet. Dies ließ keine Freiheitsgrade für die Entwicklung eines standardmäßigen QK-Mischmodells. Es standen jedoch umfangreiche Daten zur Verfügung, die auf der Allelreplikation in einem Meta-GWAS über mehrere Jahre hinweg basieren.
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Erntejahr
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Gesamtertragsversuch
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Qualitätsgeprüft und genotypisiert
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2010
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4.956
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250
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2011
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6.685
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995
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2012
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10.196
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850
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2013
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9.436
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886
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2014
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7.672
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1.114
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Gesamt
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38.945
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4.095
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Tabelle 1: Einträge über alle Jahre hinweg verfügbar.
Das Ziel bestand daher darin:
- Verwenden Sie große Mengen von Züchterdaten in GWAS, um QTL zu identifizieren, die sich auf die Verarbeitungs- und Endnutzungsqualität im CIMMYT-Zuchtprogramm auswirken.
- Nutzen Sie mithilfe des Meta-GWAS-Modells große Mengen von Zeilen, die über Jahre hinweg nicht repliziert wurden.
Zunächst wurden für jedes Jahr Q- und K-Matrizen innerhalb der Daten gelöst:
Abbildung 2: Q-Matrix-Populationsstruktur-PCA
Abbildung 3: K-Matrix Cryptic Relationship Heatmap
Als nächstes wurde das QK-Mischmodell innerhalb jedes Jahres unter Anwendung der FDR-Mehrfachtestkorrektur gelöst:
Abbildung 4: QK-Mischmodell
Nun kann eine Meta-GWAS über alle Jahre hinweg angewendet werden, indem eine GWAS-Metaanalyse durchgeführt wird, in die alle (_qkm)-Dateien einfließen, die aus einzelnen QK-Mischmodellen abgeleitet wurden. Wir verwendeten das inverse Varianz-Fixeffektmodell mit der Korrekturoption für FDR-Mehrfachtests. Dies führte zu einer Schätzung und einem Standardfehler für jeden untersuchten Marker, da der Effekt des Markers das gewünschte Ergebnis war.
Abbildung 5: GWAS-Metaanalyse
Dies führt zur Ausgabe signifikanter Meta-QTL für die Weizenverarbeitung und die Qualitätsmerkmale für den Endverbrauch.
Abbildung 6: Manhattan-Plots signifikanter Metamarker-Merkmalsanalysen für mehrere Qualitätsmerkmale
Um genauer zu untersuchen, wollten wir die Wirkung des QTL und nicht einzelner SNPs verstehen. Daher bestand der nächste Schritt darin, die Wirkung signifikanter Haplotypen zu bestimmen. Haplotypen könnten zwar vor der Kartierung bestimmt und als Kartierungseinheit verwendet werden, Weizen verfügt jedoch über ein GROSSES, nicht vollständig referenziertes Genom, und diese Haplotyp-GWAS war zu diesem Zeitpunkt nicht durchführbar.
Daher haben wir die Genotypdatei auf nur die signifikanten Marker reduziert, die sich in ähnlichen Regionen befanden, und die Haplotypen nach Region und Jahr geschätzt.
Abbildung 7: Pfad zur Haplotyp-Schätzung
Abbildung 8: Aufbau der Haplotypanalyse
Öffnen Sie in den Ergebnissen der Haplotyp-Trendregression die Dateien mit den Haplotyp-Häufigkeitsschätzungen (_hfr). Suchen Sie nach klar differenzierten Haplotypen, die 90 % des Materials ausmachen (der Rest könnte auf Genotypisierungsfehler oder sehr seltene Haplotypen zurückzuführen sein). Notieren Sie sich die Haplotypnummer und die Allel-Calls für spätere Verwendung.
Abbildung 9: Fenster mit den Ergebnissen der Haplotypanalyse
Abbildung 10: Benötigte Datei (_hfr), die für die Meta-Haplotyp-Analyse hinzugefügt wird
Starten Sie anschließend die Haplotyp-Trendregression, die eine SAS-Ausgabe liefert. Suchen Sie nach der Haplotypnummer innerhalb des angegebenen Standorts oder Jahres und fügen Sie Schätzung und Standardfehler in die (_hfr)-Datei ein. Speichern Sie die Datei unter neuem Namen für die Metaanalyse der signifikanten Haplotypen.
Abbildung 11: SAS-Ausgabedatei der Haplotyp-Trendregression
Durch die Anwendung einer Metaanalyse der signifikanten Haplotypen in allen Jahren und in allen Phänotypen konnten wir die Auswirkungen dieser QTL auf alle Merkmale erkennen.
Abbildung 12: Pfad zur Haplotyp-Metaanalyse
Somit ist es möglich, Kandidatengene zu postulieren, indem man in der Literatur nach bekannten und benannten QTL sucht, eine BLAST-Suche zwischen Haplotypgrenzen durchführt und Gene untersucht, die wahrscheinlich die Expression des Zielmerkmals beeinflussen.
Schlussfolgerungen
Verwenden von Meta-GWAS in JMP-Genomics:
- Die Methodik zur Durchführung von Meta-GWAS in JMP-Genomics wird unterstützt. Diese wurde gemeinsam mit dem JMP-Genomics-Team entwickelt. Verbesserungen werden online verfügbar sein, um den Prozess zu optimieren.
- Die Abbildung teurer und wirtschaftlich notwendiger Merkmale ist in Zuchtprogrammen ohne strukturierte Populationen möglich
- Dies ermöglicht die zusätzliche Nutzung von Daten, die bereits im Zuchtprogramm generiert wurden
- Meta-GWAS ermöglicht die De-novo- Erkennung und Ableitung von Markern und Haplotypen für QTL, die derzeit im Zuchtprogramm vorhanden sind
- Die ermittelten Effektschätzungen sind für ein mehrjähriges Zuchtprogramm relevant
