DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)CIAO,
Voglio eseguire un DoE per ottimizzare le condizioni di processo all'interno di un bioreattore a perfusione (con lievito). La produttività del sistema che sto utilizzando è essenzialmente 1 e ogni esecuzione richiederebbe 1-2 settimane. A causa di queste limitazioni, stavo pensando di eseguire un'esecuzione e di variare i miei fattori durante l'esecuzione. Posso monitorare le mie risposte (titolo del prodotto e produttività specifica delle cellule) campionando e ottenendo metriche istantanee o persino rese volumetriche giornaliere. Voglio ottimizzare condizioni come ossigeno disciolto (DO), temperatura, pH, che sono piuttosto facili da modificare a metà esecuzione, ma altri fattori come la composizione del mezzo sono più difficili perché il cambiamento non avviene istantaneamente.
Il problema che penso di poter incontrare con questo tipo di progettazione è che un cambiamento nello stato delle cellule da un passaggio potrebbe avere un impatto sui passaggi successivi. Mi chiedevo se qualcuno avesse mai usato JMP per progettare questo tipo di esperimento e avesse qualche suggerimento sul modo migliore per pianificarlo. In alternativa, se qualcuno ha altre idee su come eseguire questo tipo di DoE a bassa produttività in un bioreattore, sono aperto alle nuove idee.
Grazie per l'aiuto!
Progettazione degli esperimentiRe: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao @Ben2 ,
Non ho familiarità con l'impostazione sperimentale del bioreattore a bassa produttività che hai descritto, ma ecco alcune domande, osservazioni e suggerimenti che potrebbero aiutarti:
- Qual è il tuo obiettivo? Comprensione/esplorazione e/o ottimizzazione del sistema? Quanto è accurato il tuo sistema di misurazione? Quanto sono "rumorosi" i tuoi esperimenti?
A seconda dell'enfasi che poni sugli obiettivi (comprensione/ottimizzazione), potresti usare un approccio DoE (per capire quali fattori contribuiscono al miglioramento/risposta) o un approccio di ottimizzazione bayesiana usando la sperimentazione sequenziale guidata dal modello se il tuo obiettivo primario è ottimizzare il tuo sistema. Nota tuttavia che a seconda della dimensionalità del tuo sistema sperimentale (numero di fattori e livelli) e di quanto sono "rumorosi" i tuoi esperimenti, l'ottimizzazione bayesiana potrebbe non essere adatta per sistemi altamente rumorosi e/o sistemi ad alta dimensionalità, poiché il modello potrebbe avere difficoltà a capire le "direzioni" per ottimizzare il tuo sistema.
- Se si intende variare i livelli dei fattori durante l'esperimento e si teme che i cambiamenti nell'ordine possano influenzare i risultati (" una modifica nello stato delle cellule da un passaggio potrebbe influenzare i passaggi successivi "), potrebbero esserci due opzioni disponibili:
- Salvare l'ordine dei passaggi come un nuovo fattore non controllato nella tabella dati che potrebbe essere utilizzato nell'analisi, ma potrebbe non essere ottimale per quanto riguarda la robustezza del design per quanto riguarda l'ordine di trend/cambiamenti temporali. Potresti avere delle correlazioni tra il tuo trend temporale e i tuoi fattori e non essere in grado di distinguere quale dei due è responsabile della/e risposta/i.
- Includere tempo/ordine come covariata (e includere sia gli effetti lineari che quadratici) nel design: è un caso speciale di DoE con covariate ("time-trend robust designs") che puoi trovare in "Optimal Designs of Experiments: A Case Study Approach" (capitolo 9) di Peter GOOS e Bradley JONES. Ulteriori informazioni su queste discussioni:
Covariate in ordine definito nella progettazione personalizzata
Incorporare il ritardo temporale nel DoE
- Inoltre, a seconda della facilità di modifica dei fattori (ad esempio, hai menzionato " ossigeno disciolto (DO), temperatura, pH, che sono piuttosto facili da modificare a metà corsa, ma altri fattori come la composizione del mezzo sono più difficili perché il cambiamento non avviene istantaneamente ."), potresti forse usare una struttura di progettazione Split Plot , che potrebbe consentire di creare un intero grafico/"fattore macro" come la composizione del mezzo su cui puoi fare diverse prove e registrare le risposte. Nota che questa idea potrebbe essere usata in aggiunta alla precedente idea di progettazione robusta del trend temporale, con "fattore macro"/grafici interi in cui fai diversi esperimenti in cui l'ordine di modifica è preso in considerazione come una covariata.
Spero che queste poche domande, osservazioni e suggerimenti ti siano sensati e ti siano utili,
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao @Ben2 ,
Ho esperienza nell'ottimizzazione dei bioreattori: una delle sfide che incontrerai è la variazione dell'agitazione, del controllo del pH e dell'aerazione nei bioreattori a metà corsa, che creerà confusione quando si tratterà di decidere le "migliori" condizioni per l'intero lotto. Cambiare le condizioni a metà strada produrrà diversi fattori di stress sull'attività cellulare e potrebbe causare un impatto più duraturo nel modo in cui procede la fermentazione.
Una cosa da considerare è se è possibile ridurre la scala (ad esempio agitare le beute) per l'ottimizzazione dei media, con l'ipotesi che la composizione ottimale dei media sia la stessa su piccola scala e su scala del bioreattore: questo fornisce l'ampiezza sperimentale e la disponibilità di esperimenti per eseguire un approccio DoE. Quindi è possibile passare al controllo delle sole impostazioni del bioreattore (agitazione, pH, aerazione) in un'impostazione DoE in cui ogni esecuzione è un test di una combinazione di fattori, ad esempio imposterò DO% al 40% a 24 ore, al 50% a 48 ore e così via.
Se avete domande, sarò felice di fornirvi ulteriori commenti in merito.
Grazie,
Ben
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao Victor,
Grazie per la risposta! Per prima cosa rispondo alle tue domande:
1) l'obiettivo non è ottimizzare il sistema in sé, ma ottimizzare le condizioni del sistema per una particolare proteina ricombinante che sto esprimendo.
2) La misurazione del sistema è abbastanza solida per cose come DO, pH e temperatura poiché sono controllate da cicli di feedback, ma cose come la composizione del mezzo cambierebbero nel tempo a seconda di come le cellule consumano i nutrienti (il mezzo viene costantemente alimentato durante tutto il processo). La risposta del prodotto è una misurazione più limitata perché deve essere fisicamente campionata da una persona
Penso che probabilmente userò il tempo come fattore di covariata. Avrebbe senso includere anche altre condizioni di processo che non sto studiando come fattori di covariata? Non sono del tutto sicuro di quanto sarebbe rilevante un'ottimizzazione bayesiana considerando che ho davvero solo 1 esperimento e sto cercando di usare diversi passaggi nell'esperimento (varianti fattori) per ottimizzare (ma puoi dirmi se sbaglio). In termini di progettazione di un grafico diviso, è qualcosa che faccio principalmente nell'analisi una volta completato l'esperimento? E solo per confermare, stai dicendo di guardare qualcosa come i media nel loro insieme rispetto ai singoli componenti che li compongono?
Grazie per le tue domande e i tuoi suggerimenti, sono stati molto utili!
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao Ben,
Grazie per la risposta!
Solo per chiarire, il reattore che sto utilizzando è un reattore a perfusione che ha un'alimentazione costante di media in entrata e un flusso costante di media "esaurita" in uscita (contenente la proteina secreta per l'espressione). Questa diversa strategia di alimentazione tra il reattore e la beuta di agitazione è parte del motivo per cui vorrei esaminarla su scala di bioreattore. Inoltre, la densità cellulare ottenuta nel nostro bioreattore è significativamente più alta di quella ottenibile nelle beute di agitazione.
Sono molto d'accordo con questa affermazione ("Cambiare le condizioni a metà strada produrrà diversi fattori di stress sull'attività cellulare e potrebbe causare un impatto più lungo nel modo in cui procede la fermentazione."), ma non ho la possibilità di eseguire l'ottimizzazione in esperimenti indipendenti. Stavo per provare a consentire una fase di transizione per portare le cellule in uno stato stazionario prima di raccogliere effettivamente i dati per la "corsa" (fase in 1 esperimento), il che penso possa ridurre al minimo parte del carico. Se hai altri suggerimenti su come ridurre al minimo gli effetti delle fasi iniziali sulle fasi successive, sarei tutto orecchie!
Grazie ancora per il tuo feedback, è molto utile!
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao @Ben2 ,
Sì, secondo me avrebbe senso utilizzare altre condizioni di processo, sia come fattori di covariazione sia come fattori non controllati (per consentire l'analisi con questi fattori, anche se non inclusi nella generazione del progetto).
Non conosco l'ottimizzazione bayesiana, potrebbe essere utile considerare la dipendenza temporale/dell'ordine delle modifiche dei fattori (e non solo delle modifiche/dei valori dei fattori) per ottimizzare rapidamente i fattori.
Split-plot è una situazione in cui la randomizzazione è vincolata da condizioni sperimentali (vedi Progetti con restrizioni di randomizzazione ), che si riflettono sia nel progetto che nell'analisi. Non so quanto possa essere rilevante questa impostazione se hai un solo esperimento (e fattori che variano solo in questo esperimento), ma se dovessi considerare diversi esperimenti, potresti creare un progetto split-plot, con l'intero grafico che rappresenta la corsa considerata (con un tipo di lievito specifico o qualsiasi fattore che non potrebbe cambiare durante la corsa) e i fattori/sottotrame "facili da modificare" che sono i fattori di covariata che possono cambiare durante la corsa, con l'ordine/tempo considerato.
Spero che questa risposta abbia un senso,
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Wow, sembra divertente! NON sono un esperto del tuo processo, quindi dovrei discuterne con te per capire davvero la situazione e i vincoli. Ma ecco alcuni dei miei pensieri:
1. Pianifica l'iterazione. Non cercare di assegnare e ottimizzare tutto con 1 esperimento. Pensa a quali conoscenze ti servono per continuare in modo efficiente la tua indagine. Non è molto efficace avere un modello fantastico che ha funzionato ieri.
2. Dedica abbastanza tempo all'identificazione del rumore (fattori che non sarai disposto a controllare in futuro, perché non hai tecnologie, non hai i soldi o consideri il controllo scomodo). Quindi quali strategie utilizzerai per massimizzare lo spazio di inferenza senza sacrificare la precisione del design (ad esempio, blocco, ripetizione, split-plot).
3. Penso che potresti avere l'opportunità di usare gli split-plot (non necessariamente nel modo tradizionale). Ti consiglio vivamente di leggere:
Box, GEP, Stephen Jones (1992), “ Progetti split-plot per la sperimentazione di prodotti robusti ”, Rivista di statistica applicata , Vol. 19, No. 1
Possono essere estremamente efficienti in situazioni di passaggi sequenziali,
4. Progetta più esperimenti (facile da fare in JMP). Per ogni esperimento, confronta e metti a contrasto ciò che ogni esperimento ti darà (ad esempio, quale potenziale conoscenza otterrai (risoluzione del design e del rumore, linearità, ripetibilità)) con le risorse richieste. Prevedi TUTTI i possibili risultati di ogni esperimento e sii pronto a gestirne uno qualsiasi (ad esempio, esegui l'esperimento e le metriche delle prestazioni non cambiano o crei molta variazione nelle metriche delle prestazioni, ma nessuna di queste è assegnabile agli effetti dei fattori, ecc.)
5. Infine, e cosa più importante, indipendentemente dal risultato, nessuno conosce a priori il miglior esperimento! Rifletti su ciò che hai imparato sul processo di sperimentazione e attingi a quelle esperienze per progettare meglio il prossimo esperimento.
Re: DoE quando ogni esecuzione è costosa e richiede molto tempo (ottimizzazione del processo a bassa produttività nei biorreattori a perfusione)Ciao @Ben2 ,
Mi scuso, mi è sfuggito che si trattava di perfusione continua. Sì, è una buona idea lasciarli tornare allo stato stazionario per il lievito e poi ripetere le condizioni dopo ogni "stabilizzazione". Una cosa da considerare è la durata di ogni "esecuzione": eseguiresti ogni iterazione per un periodo di tempo stabilito (ad esempio 72 ore) o per un obiettivo stabilito (ad esempio densità cellulare di X, quantità di prodotto di Y)?
Solo per aggiungere altro alla tua idea, prova a considerare un modo per misurare la longevità/stato di stress delle cellule quando vengono riportate allo stato stazionario, quali test puoi eseguire a ogni stato stazionario per dire "questa è la stessa salute dell'ultima corsa" - potrebbero essere valori OD600, rapporti morti/vivi o test per determinati metaboliti (se sei abbastanza fortunato da avere accesso a qualcosa come un HPLC o un monitor Flex per testare). Da questo puoi quindi decidere se vuoi continuare con questo lotto di cellule o se è meglio scartarle e prendere un nuovo crio/seme per continuare.
L'ottimizzazione bayesiana è sicuramente una buona opzione per l'approccio iterativo, ma per iniziare potresti anche prendere in considerazione un progetto di definizione dell'ambito .
Hai menzionato DO: è un obiettivo da controllare o è meglio dividerlo nella velocità controllata di agitazione e aerazione? Di solito penso a DO come a un prodotto della risposta delle cellule alle condizioni del bioreattore che cambiano piuttosto che a un parametro che controlli (anche se puoi sostenere che i valori DO target per la fase di produzione che controlli per mantenerli al di sopra di un certo livello sono un parametro controllato).
Spero che questo ti aiuti!
Ben
