DoE, wenn jeder Durchlauf kostspielig und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo,
Ich möchte eine DoE durchführen, um die Prozessbedingungen in einem Perfusionsbioreaktor (mit Hefe) zu optimieren. Der Durchsatz des von mir verwendeten Systems beträgt im Wesentlichen 1 und jeder Durchlauf würde 1–2 Wochen dauern. Aufgrund dieser Einschränkungen dachte ich darüber nach, einen Durchlauf durchzuführen und meine Faktoren während des Durchlaufs zu variieren. Ich kann meine Reaktionen (Produkttiter und zellspezifische Produktivität) überwachen, indem ich Proben nehme und sofortige Messwerte oder sogar tägliche volumetrische Erträge erhalte. Ich möchte Bedingungen wie gelösten Sauerstoff (DO), Temperatur und pH-Wert optimieren, die sich während des Durchlaufs ziemlich einfach ändern lassen, aber andere Faktoren wie die Medienzusammensetzung sind schwieriger, da die Änderung nicht sofort erfolgt.
Das Problem, auf das ich bei dieser Art von Design stoßen könnte, ist, dass eine Änderung des Zellzustands in einem Schritt Auswirkungen auf die nachfolgenden Schritte haben könnte. Ich habe mich gefragt, ob jemand schon einmal JMP verwendet hat, um diese Art von Experiment zu entwerfen, und Tipps hat, wie man es am besten plant. Wenn jemand andere Ideen hat, wie man diese Art von DoE mit niedrigem Durchsatz in einem Bioreaktor durchführen kann, bin ich offen für neue Ideen.
Danke für die Hilfe!
VersuchsplanungBetreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo @Ben2 ,
Ich bin mit dem von Ihnen beschriebenen Versuchsaufbau des Niedrigdurchsatz-Bioreaktors nicht vertraut, habe hier aber einige Fragen, Anmerkungen und Vorschläge, die Ihnen helfen könnten:
- Was ist Ihr Ziel? Systemverständnis/-erkundung und/oder -optimierung? Wie genau ist Ihr Messsystem? Wie „rauschbehaftet“ sind Ihre Experimente?
Je nachdem, welchen Schwerpunkt Sie auf die Ziele (Verständnis/Optimierung) legen, können Sie einen DoE-Ansatz (um zu verstehen, welche Faktoren zur Verbesserung/Reaktion beitragen) oder einen Bayesianischen Optimierungsansatz mit modellgesteuerten sequentiellen Experimenten verwenden, wenn Ihr Hauptziel die Optimierung Ihres Systems ist. Beachten Sie jedoch, dass die Bayesianische Optimierung je nach Dimensionalität Ihres experimentellen Systems (Anzahl der Faktoren und Ebenen) und wie „rauschhaft“ Ihre Experimente sind, möglicherweise nicht für stark rauschhafte und/oder hochdimensionale Systeme geeignet ist, da das Modell möglicherweise Schwierigkeiten hat, die „Richtungen“ zur Optimierung Ihres Systems herauszufinden.
- Wenn Sie die Faktorstufen während des Experiments variieren möchten und befürchten, dass sich die Reihenfolge der Änderungen auf die Ergebnisse auswirken könnte („ eine Änderung des Zellzustands in einem Schritt kann sich auf die nachfolgenden Schritte auswirken “), stehen Ihnen möglicherweise zwei Optionen zur Verfügung:
- Das Speichern der Reihenfolge der Schritte als neuer unkontrollierter Faktor in der Datentabelle könnte in der Analyse verwendet werden, ist aber möglicherweise nicht optimal hinsichtlich der Robustheit des Designs in Bezug auf Zeittrend/Änderungsreihenfolge. Es könnten Korrelationen zwischen Ihrem Zeittrend und Ihren Faktoren bestehen und Sie könnten nicht unterscheiden können, welcher der beiden für die Antwort(en) verantwortlich ist.
- Nehmen Sie Zeit/Reihenfolge als Kovariate in das Design auf (und berücksichtigen Sie sowohl lineare als auch quadratische Effekte): Dies ist ein Sonderfall von DoE mit Kovariaten („zeittrendrobuste Designs“), den Sie in „Optimal Designs of Experiments: A Case Study Approach“ (Kapitel 9) von Peter GOOS und Bradley JONES finden. Weitere Informationen zu diesen Diskussionen:
Kovariaten in definierter Reihenfolge im benutzerdefinierten Design
Berücksichtigen Sie die Zeitverzögerung im DoE
- Auch abhängig von der Änderbarkeit der Faktoren (Sie erwähnen beispielsweise „ gelösten Sauerstoff (DO), Temperatur, pH-Wert, die sich während des Laufs ziemlich leicht ändern lassen, aber andere Faktoren wie die Medienzusammensetzung sind schwieriger, weil die Änderung nicht sofort erfolgt .“) könnten Sie möglicherweise eine Split-Plot-Design- Struktur verwenden, die es ermöglicht, ein ganzes Diagramm/einen „Makrofaktor“ wie die Medienzusammensetzung zu erstellen, an dem Sie mehrere Versuche durchführen und die Antworten aufzeichnen können. Beachten Sie, dass diese Idee zusätzlich zur vorherigen Idee des zeittrendrobusten Designs mit „Makrofaktor“/ganzen Diagrammen verwendet werden könnte, in denen Sie mehrere Experimente durchführen, bei denen die Änderungsreihenfolge als Kovariate berücksichtigt wird.
Ich hoffe, dass diese wenigen Fragen, Anmerkungen und Vorschläge für Sie Sinn ergeben und Ihnen helfen werden,
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo @Ben2 ,
Ich habe Erfahrung mit der Optimierung von Bioreaktoren. Eine der Herausforderungen, auf die Sie stoßen werden, ist die Variation von Rühren, pH-Kontrolle und Belüftung in den Bioreaktoren während des Betriebs. Dies wird Verwirrung stiften, wenn es darum geht, die „besten“ Bedingungen für die gesamte Charge festzulegen. Eine Änderung der Bedingungen während des Betriebs führt zu unterschiedlichen Stressfaktoren für die Zellaktivität und kann den Verlauf der Fermentation längerfristig beeinträchtigen.
Zu berücksichtigen ist, ob Sie für die Medienoptimierung eine Verkleinerung (z. B. auf Schüttelkolben) vornehmen können, wobei davon ausgegangen wird, dass die optimale Medienzusammensetzung im kleinen Maßstab und im Bioreaktormaßstab gleich ist. Dies gibt Ihnen die experimentelle Breite und Verfügbarkeit von Experimenten, um einen DoE-Ansatz durchzuführen. Dann können Sie dazu übergehen, in einer DoE-Umgebung nur die Bioreaktoreinstellungen (Rühren, pH-Wert, Belüftung) zu steuern, wobei jeder Durchlauf eine Kombination von Faktoren testet. Ich stelle den DO% also nach 24 Stunden auf 40 %, nach 48 Stunden auf 50 % usw. ein.
Gerne kommentiere ich mehr dazu, wenn Sie Fragen haben.
Danke,
Ben
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo Victor,
Vielen Dank für Ihre Antwort! Zunächst zur Beantwortung Ihrer Fragen:
1) Das Ziel besteht nicht darin, das System selbst zu optimieren, sondern die Bedingungen des Systems für ein bestimmtes rekombinantes Protein zu optimieren, das ich exprimiere.
2) Die Messung des Systems ist für Dinge wie DO, pH und Temperatur ziemlich robust, da sie durch Rückkopplungsschleifen gesteuert werden, aber Dinge wie die Medienzusammensetzung würden sich im Laufe der Zeit ändern, je nachdem, wie die Zellen Nährstoffe verbrauchen (das Medium wird ständig zugeführt). Die Produktreaktion ist eine eingeschränktere Messung, da sie von einer Person physisch beprobt werden muss.
Ich denke, ich werde wahrscheinlich die Zeit als Kovariatenfaktor verwenden. Wäre es sinnvoll, auch andere Prozessbedingungen, die ich nicht untersuche, als Kovariatenfaktoren einzubeziehen? Ich bin mir nicht ganz sicher, wie relevant eine Bayes-Optimierung wäre, wenn man bedenkt, dass ich wirklich nur ein Experiment habe und versuche, verschiedene Schritte im Experiment (unterschiedliche Faktoren) zur Optimierung zu verwenden (aber Sie können mir sagen, ob ich falsch liege). Ist ein Split-Plot-Design etwas, was ich hauptsächlich in der Analyse mache, wenn das Experiment abgeschlossen ist? Und nur zur Bestätigung: Meinen Sie, man soll so etwas wie Medien als Ganzes betrachten und nicht die einzelnen Komponenten, aus denen sie bestehen?
Vielen Dank für Ihre Fragen und Vorschläge, das war sehr hilfreich!
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo Ben,
Vielen Dank für Ihre Antwort!
Nur zur Klarstellung: Der Reaktor, den ich betreibe, ist ein Perfusionsreaktor, der eine konstante Zufuhr von Medium hat und einen konstanten Strom von „verbrauchtem“ Medium (das das sezernierte Protein zur Expression enthält) ausgibt. Diese unterschiedliche Zufuhrstrategie zwischen Reaktor und Schüttelkolben ist einer der Gründe, warum ich ihn im Bioreaktormaßstab betrachten möchte. Außerdem ist die in unserem Bioreaktor erreichte Zelldichte deutlich höher als das, was in Schüttelkolben erreichbar ist.
Ich stimme dieser Aussage sehr zu („Eine Änderung der Bedingungen während des Prozesses führt zu unterschiedlichen Stressfaktoren für die Zellaktivität und kann den Verlauf der Fermentation längerfristig beeinträchtigen.“), habe aber nicht die Möglichkeit, die Optimierung in unabhängigen Experimenten durchzuführen. Ich wollte versuchen, einen Übergangsschritt zuzulassen, um die Zellen in einen stabilen Zustand zu bringen, bevor ich tatsächlich Daten für den „Lauf“ (Schritt in 1 Experiment) sammle, was meiner Meinung nach einen Teil der Belastung minimieren kann. Wenn Sie andere Vorschläge haben, wie die Auswirkungen der frühen Schritte auf die späteren Schritte minimiert werden können, bin ich ganz Ohr!
Nochmals vielen Dank für Ihr Feedback, es ist sehr hilfreich!
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo @Ben2 ,
Ja, meiner Meinung nach wäre es sinnvoll, andere Prozessbedingungen zu verwenden, entweder als Kovariatenfaktoren oder als unkontrollierte Faktoren (um die Analyse mit diesen Faktoren zu ermöglichen, auch wenn sie nicht in die Designgenerierung einbezogen werden).
Ich kenne mich mit Bayesscher Optimierung nicht aus, es könnte hilfreich sein, wenn Sie die Reihenfolge/Zeitabhängigkeit der Faktoränderungen (und nicht nur die Faktoränderungen/-werte) berücksichtigen könnten, um die Faktoren schnell zu optimieren.
Split-Plot ist eine Situation, in der die Randomisierung durch experimentelle Bedingungen eingeschränkt wird (siehe Designs mit Randomisierungsbeschränkungen ), die sich sowohl im Design als auch in der Analyse widerspiegeln. Ich weiß nicht, wie relevant dieser Aufbau sein kann, wenn Sie nur ein Experiment haben (und Faktoren, die nur in diesem Experiment variieren), aber wenn Sie mehrere Experimente berücksichtigen würden, könnten Sie ein Split-Plot-Design erstellen, wobei das gesamte Diagramm der betrachtete Lauf ist (mit einem bestimmten Hefetyp oder einem beliebigen Faktor, der sich während des Laufs nicht ändern kann) und die „leicht zu ändernden“ Faktoren/Subplots die Kovariatenfaktoren sind, die sich während des Laufs ändern können, wobei die Reihenfolge/Zeit berücksichtigt wird.
Hoffe, diese Antwort macht einen Sinn,
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Wow, das klingt nach Spaß! Ich bin KEIN KMU für Ihren Prozess, also müsste ich mit Ihnen diskutieren, um die Situation und Einschränkungen wirklich zu verstehen. Aber hier sind einige meiner Gedanken:
1. Planen Sie Iterationen ein. Versuchen Sie nicht, mit einem Experiment alles zuzuweisen und zu optimieren. Überlegen Sie, welches Wissen Sie benötigen, um Ihre Untersuchung effizient fortzusetzen. Es ist nicht sehr effektiv, ein großartiges Modell zu haben, das gestern noch funktioniert hat.
2. Verbringen Sie ausreichend Zeit mit der Identifizierung von Rauschen (Faktoren, die Sie in Zukunft nicht mehr kontrollieren möchten, entweder weil Sie nicht über die nötigen Technologien oder das nötige Geld verfügen oder weil Sie deren Kontrolle als unbequem erachten). Welche Strategien werden Sie dann verwenden, um den Inferenzraum zu maximieren, ohne die Designpräzision zu beeinträchtigen (z. B. Blockierung, Wiederholung, Split-Plots).
3. Ich denke, Sie haben möglicherweise die Möglichkeit, Split-Plots zu verwenden (nicht unbedingt auf herkömmliche Weise). Ich empfehle Ihnen dringend, Folgendes zu lesen:
Box, GEP, Stephen Jones (1992), „ Split-Plot-Designs für robuste Produktexperimente “, Zeitschrift für angewandte Statistik , Vol. 19, Nr. 1
Diese können in Situationen mit aufeinanderfolgenden Schritten äußerst effizient sein,
4. Entwerfen Sie mehrere Experimente (einfach in JMP). Vergleichen Sie für jedes Experiment, was Ihnen jedes Experiment bringt (z. B. welche potenziellen Erkenntnisse Sie gewinnen (Design- und Rauschauflösung, Linearität, Wiederholbarkeit)) und stellen Sie es den erforderlichen Ressourcen gegenüber. Sagen Sie ALLE möglichen Ergebnisse jedes Experiments voraus und seien Sie darauf vorbereitet, mit jedem davon umzugehen (z. B. Sie führen das Experiment durch und die Leistungsmetriken ändern sich nicht oder Sie erzeugen eine große Variation in den Leistungsmetriken, aber keine davon ist den Faktoreffekten zuzuordnen usw.).
5. Und zu guter Letzt, und das ist am wichtigsten: Unabhängig vom Ergebnis weiß niemand im Voraus, welches Experiment das beste ist! Denken Sie darüber nach, was Sie über den Prozess des Experimentierens gelernt haben, und nutzen Sie diese Erfahrungen, um das nächste Experiment besser zu gestalten.
Betreff: DoE, wenn jeder Durchlauf teuer und zeitaufwändig ist (Optimierung von Prozessen mit geringem Durchsatz in Perfusionsbioreaktoren)Hallo @Ben2 ,
Entschuldigen Sie, ich habe übersehen, dass es sich um eine kontinuierliche Perfusion handelte. Ja, es ist eine gute Idee, sie in den stationären Zustand für die Hefe zurückkehren zu lassen und dann nach jeder „Beruhigung“ Ihre Bedingungen laufen zu lassen. Eine zu berücksichtigende Sache ist die Dauer jedes „Laufs“: Würden Sie jede Iteration für einen festgelegten Zeitraum (z. B. 72 Stunden) oder ein festgelegtes Ziel (z. B. Zelldichte von X, Produktmenge von Y) laufen lassen?
Um Ihre Idee noch zu ergänzen: Versuchen Sie, eine Möglichkeit zu finden, die Langlebigkeit/den Stresszustand der Zellen zu messen, wenn sie wieder in den Steady State gebracht werden. Welche Tests können Sie in jedem Steady State durchführen, um zu sagen: „Dies ist der gleiche Gesundheitszustand wie beim letzten Durchlauf“ – das könnten OD600-Werte, Tot-/Lebend-Verhältnisse oder Tests auf bestimmte Metaboliten sein (wenn Sie das Glück haben, Zugang zu so etwas wie einem HPLC- oder Flex-Monitor zum Testen zu haben). Auf dieser Grundlage können Sie dann entscheiden, ob Sie mit dieser Zellcharge fortfahren möchten oder ob es besser ist, sie zu verschrotten und eine neue Kryo-/Samenprobe zu nehmen, um weiterzumachen.
Die Bayes’sche Optimierung ist auf jeden Fall eine gute Option für den iterativen Ansatz, Sie könnten für den Einstieg aber auch so etwas wie ein Scoping-Design in Betracht ziehen.
Sie haben DO erwähnt – ist das ein zu kontrollierendes Ziel oder ist es besser, das in die kontrollierte Rühr- und Belüftungsrate aufzuteilen? Normalerweise stelle ich mir DO eher als ein Produkt der Zellreaktion auf sich ändernde Bioreaktorbedingungen vor und nicht als einen Parameter, den Sie kontrollieren (obwohl man argumentieren kann, dass Ziel-DO-Werte für die Produktionsphase, die Sie kontrollieren, um sie über einem bestimmten Niveau zu halten, ein kontrollierter Parameter sind).
Hoffe, das hilft!
Ben
