DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut,
Je cherche à réaliser un DoE pour optimiser les conditions de processus à l'intérieur d'un bioréacteur à perfusion (avec de la levure). Le débit du système que j'utilise est essentiellement de 1 et chaque exécution prendrait 1 à 2 semaines. En raison de ces contraintes, j'envisageais d'effectuer une exécution et de faire varier mes facteurs au cours de l'exécution. Je peux surveiller mes réponses (titre du produit et productivité spécifique des cellules) en échantillonnant et en obtenant des mesures instantanées ou même des rendements volumétriques quotidiens. Je cherche à optimiser les conditions comme l'oxygène dissous (DO), la température, le pH, qui sont assez faciles à modifier en cours d'exécution, mais d'autres facteurs comme la composition du milieu sont plus difficiles car le changement ne se produit pas instantanément.
Le problème que je pense rencontrer avec ce type de conception serait qu'un changement dans l'état des cellules à une étape pourrait avoir un impact sur les étapes suivantes. Je me demandais si quelqu'un avait déjà utilisé JMP pour concevoir ce type d'expérience et avait des conseils sur la meilleure façon de procéder. Sinon, si quelqu'un a d'autres idées sur la façon de réaliser ce type de DoE à faible débit dans un bioréacteur, je suis ouvert à de nouvelles idées.
Merci pour l'aide !
Plan d'expériencesRé: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut @Ben2 ,
Je ne connais pas le cadre expérimental du bioréacteur à faible débit que vous avez décrit, mais voici quelques questions, remarques et suggestions qui pourraient vous aider :
- Quel est votre objectif ? Compréhension/exploration et/ou optimisation du système ? Quelle est la précision de votre système de mesure ? Quel est le niveau de bruit de vos expériences ?
En fonction de l'importance que vous accordez aux objectifs (compréhension/optimisation), vous pouvez utiliser une approche DoE (pour comprendre quels facteurs contribuent à l'amélioration/réponse) ou une approche d'optimisation bayésienne utilisant une expérimentation séquentielle pilotée par modèle si votre objectif principal est d'optimiser votre système. Notez cependant qu'en fonction de la dimensionnalité de votre système expérimental (nombre de facteurs et de niveaux) et du degré de « bruit » de vos expériences, l'optimisation bayésienne peut ne pas être adaptée aux systèmes très bruyants et/ou aux systèmes à haute dimension, car le modèle peut avoir du mal à déterminer les « directions » pour optimiser votre système.
- Si vous avez l'intention de faire varier les niveaux des facteurs au cours de l'expérience et que vous craignez que les changements d'ordre puissent affecter les résultats (« un changement dans l'état des cellules d'une étape pourrait avoir un impact sur les étapes suivantes »), deux options peuvent être disponibles :
- Enregistrer l'ordre des étapes en tant que nouveau facteur non contrôlé dans la table de données qui pourrait être utilisé dans l'analyse, mais cela peut ne pas être optimal en ce qui concerne la robustesse de la conception concernant la tendance temporelle/l'ordre des changements. Vous pourriez avoir des corrélations entre votre tendance temporelle et vos facteurs, et ne pas être en mesure de différencier lequel des deux est responsable de la ou des réponses.
- Inclure le temps/ordre comme covariable (et inclure les effets linéaires et quadratiques) dans le plan : Il s'agit d'un cas particulier de DoE avec covariables (« plans robustes à tendance temporelle ») que vous pouvez trouver dans « Optimal Designs of Experiments : A Case Study Approach » (chapitre 9) de Peter GOOS et Bradley JONES. Plus d'informations sur ces discussions :
Covariables dans un ordre défini dans une conception personnalisée
Intégrer le décalage temporel dans le DoE
- En fonction également de la facilité de changement des facteurs (par exemple, vous mentionnez « l'oxygène dissous (OD), la température, le pH, qui sont assez faciles à modifier en cours d'analyse, mais d'autres facteurs comme la composition du milieu sont plus difficiles car le changement ne se produit pas instantanément »), vous pourriez peut-être utiliser une structure de conception de parcelles divisées , qui pourrait permettre de créer une parcelle entière/un « facteur macro » comme la composition du milieu sur lequel vous pouvez faire plusieurs essais et enregistrer les réponses. Notez que cette idée pourrait être utilisée en complément de l'idée précédente de conception robuste de tendance temporelle, avec des « facteurs macro »/parcelles entières dans lesquelles vous faites plusieurs expériences où l'ordre de changement est pris en compte comme covariable.
J'espère que ces quelques questions, remarques et suggestions auront du sens et vous aideront,
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut @Ben2 ,
J'ai de l'expérience dans l'optimisation des bioréacteurs. L'un des défis que vous allez rencontrer est de faire varier l'agitation, le contrôle du pH et l'aération dans les bioréacteurs en cours de cycle, ce qui va créer une confusion lorsqu'il s'agira de décider des « meilleures » conditions pour l'ensemble du lot. Changer les conditions en cours de cycle produira des facteurs de stress différents sur l'activité cellulaire et peut avoir un impact à long terme sur la manière dont la fermentation se déroule.
Il faut également prendre en compte la possibilité de réduire l'échelle (c'est-à-dire d'agiter les flacons) pour l'optimisation du milieu, en supposant que la composition optimale du milieu est la même à petite échelle et à l'échelle du bioréacteur. Cela vous donne l'étendue expérimentale et la disponibilité des expériences nécessaires pour réaliser une approche DoE. Vous pouvez ensuite passer au contrôle des seuls paramètres du bioréacteur (agitation, pH, aération) dans un paramètre DoE où chaque exécution consiste à tester une combinaison de facteurs, c'est-à-dire que je définirai DO% à 40 % à 24 h, 50 % à 48 h, etc.
Je serais ravi de commenter davantage ce sujet si vous avez des questions.
Merci,
Ben
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut Victor,
Merci pour votre réponse ! tout d'abord pour répondre à vos questions :
1) l’objectif n’est pas d’optimiser le système lui-même mais d’optimiser les conditions du système pour une protéine recombinante particulière que j’exprime.
2) La mesure du système est assez robuste pour des éléments tels que l'OD, le pH et la température, car ils sont contrôlés par des boucles de rétroaction, mais des éléments tels que la composition du milieu changeraient au fil du temps en fonction de la façon dont les cellules consomment les nutriments (le milieu est constamment alimenté). La réponse du produit est une mesure plus limitée car elle doit être échantillonnée physiquement par une personne
Je pense que j'utiliserai probablement le temps comme facteur covariable. Serait-il judicieux d'inclure également d'autres conditions de processus que je n'étudie pas comme facteurs covariables ? Je ne suis pas tout à fait sûr de la pertinence d'une optimisation bayésienne étant donné que je n'ai en réalité qu'une seule expérience et que j'essaie d'utiliser différentes étapes de l'expérience (facteurs variables) pour optimiser (mais vous pouvez me dire si je me trompe). En termes de conception de parcelles divisées, est-ce quelque chose que je fais principalement dans l'analyse une fois l'expérience terminée ? Et juste pour confirmer, dites-vous qu'il faut considérer quelque chose comme les médias dans leur ensemble plutôt que les composants individuels qui les composent ?
Merci pour vos questions et suggestions, cela m'a été très utile !
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut Ben,
Merci pour votre réponse !
Juste pour clarifier, le réacteur que j'utilise est un réacteur à perfusion qui reçoit un flux constant de milieu entrant et un flux constant de milieu « usagé » sortant (contenant la protéine sécrétée pour l'expression). Cette différence de stratégie d'alimentation entre le réacteur et le flacon agité est en partie la raison pour laquelle je voudrais l'examiner à l'échelle du bioréacteur. De plus, la densité cellulaire obtenue dans notre bioréacteur est nettement supérieure à celle qui est réalisable dans les flacons agités.
Je suis tout à fait d'accord avec cette affirmation (« Changer les conditions à mi-chemin produira des facteurs de stress différents sur l'activité cellulaire et peut entraîner un impact plus long sur la manière dont la fermentation se déroule. »), mais je n'ai pas la possibilité d'effectuer l'optimisation dans des expériences indépendantes. J'allais essayer d'autoriser une étape de transition pour amener les cellules dans un état stable avant de collecter réellement les données pour la « course » (étape dans 1 expérience) qui, je pense, peut minimiser une partie du fardeau. Si vous avez d'autres suggestions sur la façon de minimiser les effets des premières étapes sur les étapes ultérieures, je serais tout ouïe !
Merci encore pour votre retour c'est très utile !
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut @Ben2 ,
Oui, à mon avis, il serait judicieux d'utiliser d'autres conditions de processus, soit comme facteurs covariables, soit comme facteurs non contrôlés (pour permettre l'analyse avec ces facteurs, même s'ils ne sont pas inclus dans la génération de la conception).
Je ne connais pas l'optimisation bayésienne, il pourrait être utile que vous puissiez prendre en compte la dépendance de l'ordre/du temps des changements de facteurs (et pas seulement les changements/valeurs des facteurs) pour optimiser rapidement les facteurs.
Le split-plot est une situation dans laquelle la randomisation est limitée par des conditions expérimentales (voir Plans avec restrictions de randomisation ), qui se reflètent à la fois dans le plan et dans l'analyse. Je ne sais pas à quel point cette configuration peut être pertinente si vous n'avez qu'une seule expérience (et des facteurs qui varient uniquement dans cette expérience), mais si vous deviez envisager plusieurs expériences, vous pourriez construire un plan split-plot, avec la parcelle entière comme exécution considérée (avec un type de levure spécifique ou tout facteur qui ne pourrait pas changer pendant l'exécution), et les facteurs/sous-parcelles « faciles à changer » étant les facteurs covariables qui peuvent changer pendant l'exécution, avec l'ordre/le temps pris en compte.
J'espère que cette réponse a du sens,
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Wow, ça a l'air amusant ! Je ne suis PAS un expert en la matière, je devrais donc en discuter avec vous pour vraiment comprendre la situation et les contraintes. Mais voici quelques-unes de mes réflexions :
1. Prévoyez des itérations. N'essayez pas d'attribuer et d'optimiser tout avec une seule expérience. Réfléchissez aux connaissances dont vous avez besoin pour poursuivre efficacement votre enquête. Il n'est pas très efficace d'avoir un excellent modèle qui a fonctionné hier.
2. Passez suffisamment de temps à identifier le bruit (facteurs que vous ne serez pas disposé à contrôler à l'avenir, soit parce que vous ne disposez pas des technologies, soit parce que vous n'avez pas les moyens, soit parce que vous considérez que leur contrôle n'est pas pratique). Ensuite, quelles stratégies utiliserez-vous pour maximiser l'espace d'inférence sans sacrifier la précision de la conception (par exemple, blocage, répétition, parcelles divisées).
3. Je pense que vous pourriez avoir l'occasion d'utiliser des parcelles divisées (pas nécessairement de manière traditionnelle). Je vous recommande vivement de lire :
Box, GEP, Stephen Jones (1992), « Plans en parcelles divisées pour une expérimentation de produits robuste », Journal de statistique appliquée , vol. 19, n° 1
Ceux-ci peuvent être extrêmement efficaces dans des situations d’étapes séquentielles,
4. Concevez plusieurs expériences (facile à faire dans JMP). Pour chaque expérience, comparez et contrastez ce que chaque expérience vous apportera (par exemple, quelles connaissances potentielles vous apporterez (conception et résolution du bruit, linéarité, répétabilité)) avec les ressources requises. Prévoyez TOUS les résultats possibles de chaque expérience et soyez prêt à gérer n'importe lequel d'entre eux (par exemple, vous exécutez l'expérience et les mesures de performance ne changent pas ou vous créez beaucoup de variations dans les mesures de performance, mais aucune de ces variations n'est attribuable aux effets des facteurs, etc.)
5. Enfin, et c'est le plus important, quel que soit le résultat, personne ne connaît à priori la meilleure expérience ! Réfléchissez à ce que vous avez appris sur le processus d'expérimentation et tirez parti de ces expériences pour mieux concevoir la prochaine expérience.
Ré: DoE lorsque chaque exécution est coûteuse et prend du temps (optimisation des processus à faible débit dans les bioréacteurs à perfusion)Salut @Ben2 ,
Mes excuses, j'ai oublié qu'il s'agissait d'une perfusion continue - oui, c'est une bonne idée de les laisser revenir à l'état stable pour la levure, puis d'exécuter vos conditions après chaque « stabilisation » - une chose à considérer est la durée de chaque « exécution » : exécuteriez-vous chaque itération pendant une période de temps définie (c'est-à-dire 72 h) ou un objectif défini (c'est-à-dire une densité cellulaire de X, une quantité de produit de Y) ?
Juste pour compléter votre idée, essayez d'envisager un moyen de mesurer la longévité/l'état de stress des cellules lorsqu'elles sont ramenées à l'état stable, quels tests pouvez-vous effectuer à chaque état stable pour dire « c'est la même santé que la dernière fois » - cela pourrait être des valeurs OD600, des ratios morts/vivants ou des tests pour certains métabolites (si vous avez la chance d'avoir accès à quelque chose comme un moniteur HPLC ou Flex pour tester). À partir de là, vous pouvez alors décider si vous voulez continuer avec ce lot de cellules, ou s'il est préférable de les jeter et de prendre une nouvelle cryo/graine pour continuer.
L’optimisation bayésienne est certainement une bonne option pour l’approche itérative, mais vous pouvez également envisager quelque chose comme une conception de portée pour vous aider à démarrer.
Vous avez mentionné l'OD - est-ce un objectif à contrôler ou est-il préférable de le diviser en taux contrôlés d'agitation et d'aération ? Je considère généralement l'OD comme un produit de la réponse des cellules aux changements des conditions du bioréacteur plutôt qu'un paramètre que vous contrôlez (bien que vous puissiez affirmer que les valeurs cibles d'OD pour la phase de production que vous contrôlez pour rester au-dessus d'un certain niveau constituent un paramètre contrôlé).
J'espère que cela aide !
Ben
