細胞和基因治療領域對穩健且可擴展的慢病毒載體生產製程的需求，推動了先進技術的應用。本次演講將深入探討一種創新的製程開發方法，重點介紹基於品質源自於設計 (QbD) 的策略，並著重闡述 JMP 軟體的強大功能。
為嚴格遵守製程性能驗證的監管要求，我們的方法論無縫融合了傳統與現代原理，並在製程驗證生命週期的第一階段製程設計中將JMP作為關鍵工具。利用JMP進行實驗設計（DOE）有助於全面表徵慢病毒載體生產工藝，從而精確識別關鍵工藝參數（CPP）並建立可接受範圍（PAR）。
透過利用軟體的統計分析和視覺化功能，我們確保決策以數據為驅動，從而增強對流程的理解和控制。本次演講重點闡述了JMP在推動QbD原則應用以滿足生物製程不斷變化的需求方面所發揮的關鍵作用。
歡迎聆聽我的演講。我叫約翰-克里斯托夫·德特曼，今天我想向大家介紹我們利用實驗設計加速慢病毒載體生產流程開發的方法。這套方法目前已成功應用於我們位於蓋瑟斯堡的製程開發部門的一個客戶專案中，並且是與托馬斯·利特爾諮詢公司合作開發的。
在今天的報告中，我將在現有資料分析策略的基礎上，引入一些新的視角，這些視角在我看來非常有幫助。報告將分為兩部分。第一部分，我將對主題進行總體介紹；之後，我將簡要示範如何使用 JMP 來評估實驗設計 (DOE)。
但在正式開始之前，我想先簡單概述一下我們的核心競爭力。 Miltenyi Bioindustry 是一家專注於細胞和基因治療的合約研發生產機構 (CDMO)，同時也是 Miltenyi Biotec 集團的成員。我們不僅將自身專業知識應用於 CAR-T 細胞產品，更在符合 GMP 標準的慢病毒載體和細胞產品的生產方面積累了豐富的經驗。
我們還提供廣泛的慢病毒載體生產平台，此外，我們還可以…我們的產品開發團隊支援進一步的製程開發優化或特定表徵研究，這確實有助於商業化。
我們還提供標準分析平台，這些平台還可以進一步開發，以建立其他檢測方法；我們還可以支援將技術和檢測方法轉移到客戶的內部細胞生產設施；我們還可以提供監管專家的指導。
我們的總部位於貝爾吉施格拉德巴赫，擁有慢病毒載體製程開發和細胞處理設施。我們在蓋瑟斯堡、聖荷西和上海也設有細胞工廠。我們在德國的主要符合GMP規範的載體生產基地位於泰特羅。我們在蓋瑟斯堡也擁有大型載體生產設施，慢病毒載體製程開發總部也設在這裡。
在載體生產方面，我們提供基於第三代技術的系統，這意味著我們遵循最高的安全標準。我們的製程無需血清，採用懸浮液生產，可進行規模化生產，並可在美國或泰羅進行。作為一家全球領先的符合GMP規範的載體生產商，我們擁有豐富的經驗，並已成功利用我們的平台工藝生產了數百批符合GMP標準的載體。
這些投影片大致概述了產品生命週期，如果您想將您的產品（例如您的細胞和基因療法產品）推向商業化，就應該遵循這個流程。基於這張圖表，我想向您展示我們需要更深入探討的產品生命週期的哪個階段。
首先，您需要收集有關產品和待開發流程的知識，目的是編制一份能夠充分反映產品品質的品質屬性清單。之後，將分別進行製程開發和製程表徵，最終產生控制策略和設計空間。
接下來將進行過程效能確認，也稱為過程驗證。然而，這一步驟並非最終的確認步驟，而是對該確認狀態進行持續驗證的起點，也稱為持續過程驗證。
當然，我們無法在此流程圖中詳述所有內容，但今天我想重點討論設計空間的生成，以及我們使用哪些方法來生成設計空間。我們還將討論如何定義製程的關鍵參數，即那些其變化會影響關鍵品質屬性，因此需要進行監控和控制的參數。此外，我們還將討論如何定義製程參數的已驗證可接受範圍，即製程參數的特徵範圍，在該範圍內操作，同時保持其他參數不變，即可生產出符合相關品質要求的材料。
但在深入探討之前，我想補充一些關於設計空間的內容。左側給出了一個示意圖，其中白色區域代表符合規格的區域，陰影區域代表不符合規格的區域。據我所知，設計空間並非製程驗證的強制性要求。然而，相關機構強烈建議建立設計空間。
ICH Q8 中將品質保證概念定義為輸入變數的多維組合和交互作用，旨在確保產品品質。它透過系統化的方法建立，包括優化關鍵物料屬性和製程參數，並運用實驗設計等工具。此外，設計空間還能確保製程在既定參數範圍內運行，進而持續滿足品質標準和產品規格。
它還能在保證產品品質的前提下，實現靈活性和製程控制，因為它能夠真正識別潛在的故障模式和運作極限。這意味著，在設計階段，我們最終能夠定義具體的參數範圍，即經過驗證的可接受範圍。
但是，我們如何建造設計空間呢？首先，我們會進行低層次的風險評估。當然，在進行風險評估之前，還需要完成幾個步驟，例如產品和流程的範圍界定。不過，這些內容不在今天的討論範圍。
低階風險評估涉及對潛在影響較大的製程參數進行基於風險的估計。我們將首先列出相關的製程參數，並將它們與相應的響應關聯起來。之後，評估將基於製程參數的變化可能對反應產生的影響程度。
例如，如果假設某個製程參數的影響非常大，或者我們對潛在的影響一無所知，那麼我們就會相應地定義一個高風險評分。但是，如果我們已經知道該製程參數沒有影響，或對此有很高的把握，那麼我們就可以定義或標註一個低風險評分。這有助於我們識別潛在的非影響性製程參數，從而將其從實驗設計（DOE）研究中排除。
同樣的方法也適用於更高階的項，例如雙因素交互作用或二次項。同樣，科學原理和先驗知識可以幫助確定哪些高階項應該納入研究，哪些不應該納入。
現在，在兩種評估中，對主要效應的評估以及對交互作用的評估最終使我們能夠非常清晰地定義 DOE 研究設計，因為簡單來說，你可以說，對於你想研究的每個模型項，都需要進行一次額外的實驗運行，透過這種方法，就有可能創建一個真正符合你特定要求的特定設計。
為了產生我們的DOE研究，我們使用了JMP的客製化DOE平台。設計好DOE研究後，研究人員就可以進入實驗室進行所有實驗，收集所有數據，並利用這些數據定義我們的統計模型。統計模型描述了輸入變數、影響因素和反應之間的關係。我們可以利用此模型來定義關鍵製程參數（CPP），因為我們認為僅憑風險評估不足以偵測和控制CPP。 CPP的偵測和控制必須基於對各因素如何直接影響反應的測量。顯然，DOE是最佳選擇，因為它能夠有效地分離每個因素及其交互作用對關鍵反應的影響。
為了確定關鍵製程參數 (CPP)，一方面，我們需要對各因素進行尺度估計，以最終獲得其效應量；另一方面，我們還需要確定容差範圍，即上限規格限和下限規格限之間的區域。最後，我們確定那些在實驗設計 (DOE) 研究中使反應平均值偏移超過容差 20% 的因素，並將這些因素視為關鍵製程參數。我再次強調，在實驗設計 (DOE) 研究中使反應平均值偏移超過容差 20% 的因素被視為關鍵製程參數。
在確定了單元操作的關鍵製程參數 (CPP) 之後，接下來將利用設計空間來確定製程的特定參數範圍。由於設計空間具有很強的動態性，並且會隨著各個參數的設定而變化，因此我們採用蒙特卡羅模擬來模擬批次間的差異，並探索設計空間的動態特性。
本次模擬將包含三個關鍵的變異來源。一方面，是模型本身、特徵反應或產品帶來的變異，以及我們研究的每個因素所帶來的變異；另一方面，我們也會考慮模型未涵蓋的殘差變異，也稱為均方根誤差。例如，這可能源自於分析方法本身的變異。結合這些信息，JMP 可以產生或模擬數千個實驗，從而幫助您評估和估計製程流程的能力。
例如，在這個例子中，我們看到缺陷率或不合格率超過 33%，這太高了，因此我們顯然需要對製程限製或參數限制進行一些調整。
為了確定我們的因子範圍，我們使用了顧問提供的腳本，該腳本與設計空間分析器非常相似。該腳本有助於可視化模擬數據以及過程中可能發生的故障率。圖中紅色的點代表模擬實驗運行的結果（這些結果不符合規範），綠色的點代表我們的檢驗運行結果。
我非常喜歡這張圖表，因為它能夠真正評估各個因素對我們反應的影響程度。例如，對於因素 D，我們可以看到，與反應 A 相關的是，尤其是在因素範圍的高端，檢驗運行的比例也更高。透過手動調整這些限值，我們可以定義更有意義、更合理、更能實現穩健生產的製程參數範圍。之前，我們大約有 33% 的點不合格，現在低於 1%，這完全滿足了我們的要求。這些我們手動定義的限值，現在被用作我們經過驗證的可接受的製程參數範圍。
我們也會根據歷史資料、設備和個人能力，並考慮已建立的、經過驗證的可接受範圍，來定義我們的正常操作範圍，這意味著這些 NOR 限制通常應該比 PAR 更嚴格。
現在輪到我做示範了。接下來我將切換到JMP軟體，開始我的示範。今天我想給大家一個例子，這個例子也來自我們的一個特性研究。在這個實驗設計（DOE）中，我們設定了五種不同的反應變數。我們也研究了六個不同的因素，並根據初步的風險評估，最終決定研究所有主效應，同時也研究一些雙因素交互作用以及一些二次項，最終完成了大約16次實驗的DOE研究。
為了評估我們的DOE研究，我們通常使用JMP的擬合模型平台。在進行具體的模型評估之前，我們總是會先進行資料品質檢查。這意味著我們會查看模型的殘差，看看殘差中是否存在特定的模式，這些模式可能表示存在未知的活性效應。但理想情況下，殘差應該圍繞零線隨機分佈。圖中的藍線表示殘差呈常態分佈，這與我們的情況相符。
為了篩選異常值，我們使用外部學生化殘差。建議使用 Bonferroni 限度，因為它提供了一種更保守的方法，從而降低了錯誤地檢測到偏離趨勢點（異常值）的風險。
以下是一些關於處理異常值（例如偏離趨勢點）的補充說明，尤其是在監管環境下工作並向FDA等機構報告時。即使您偵測到異常值（即該資料點可能超出Bonferroni校正限值），也不表示您應該立即將其從資料集中排除。始終建議您為排除異常值提供科學依據，例如，流程中存在未記錄的處理錯誤，或分析方法有缺陷。
如果無法做到這一點，您還可以考慮進行模型比較，即將包含異常值和不包含異常值的模型進行比較，並解釋為什麼不包含異常值的模型更能代表您的流程。但僅憑統計方法排除資料點是不建議的。
資料品質檢查完成後，我們將進行模型迴歸。因此，我們採用逐步後退迴歸法，這意味著我們將從模型中移除不顯著的項。我們遵循效應層級原則，也就是說，只有當主效應不包含在更高階的項中（例如二次項或交互項）時，才允許移除它們。
例如，這裡用這個小符號標記出來。這顯示或告訴我們，這個主效果也是交互作用的一部分，因此，除非這個交互作用也被排除，否則我們不能排除這個主效果。所以，我們可以排除這個交互作用。我們也可以排除這個主效應，因為它不是高階項的一部分。
是的，我們從模型中移除項的閾值是 p 值 0.1，在非常接近此閾值的情況下，我們還會考慮模型的均方根誤差，這意味著當我們移除該項並且 RMSE 下降時，這種排除是合理的，因為我們想要減少未知變異，而未知變異由均方根誤差表示。
然而，當我們移除該項後，RMSE 會增加（現在的情況就是這樣），我們不會排除這個數據點，因為它顯然有助於解釋模型變異，或者說，是的，我們實驗中的模型變異。
現在我們已經有了最終模型，接下來需要保存預測公式以及標準誤差的預測公式，後者對於後續定義可接受範圍至關重要。但在進行這些步驟之前，我們需要先定義關鍵流程參數。因此，我們需要確保已開啟縮放估計表（目前已開啟），然後使用顧問提供的插件腳本來識別關鍵流程參數。
具體操作如下。首先，我們需要選擇 FIT 模型報告，開啟縮放估計表；然後，我們需要定義目前正在研究的回應的規格限值。通常情況下，或者理想情況下，您應該已經預先定義了規格限值。但是，例如，當您研究流程中的某個單元操作時，該中間產品的規格限值可能尚未確定。在這種情況下，我們會嘗試使用縮放數據，然後使用最終產品規格合格批次的最小值和最大值。
如果上述方法也不可用，我們將採用預設方法來定義規格限，即規格限的下限使用 DOE 製程平均值的 80%，規格限的上限使用製程平均值的 150%。但幸運的是，我們目前已經設定了規格限，下限為 150，上限為 350。
接下來我們可以繼續。下一步是確定關鍵製程參數的閾值。之前我說過，當平均偏差達到公差的20%時，我們就將製程參數判定為關鍵參數。當然，您也可以根據自身需求調整閾值，無論是增加或減少，都隨您選擇，但我們這裡暫且沿用20%這個閾值。
最後，我們點擊「運行」。腳本隨後會執行CPB計算，該計算使用縮放後的估計值或係數（也稱為半效應），並將其乘以特定的乘數。對於主效應，我們應用乘數2。交互作用也遵循同樣的規則，而對於二次效應，我們則使用乘數1。
這樣，就可以計算出總效應，然後將該總效應與公差範圍（即上下規格限之間的區域）聯繫起來，如果總效應超過該公差範圍的 20%，我們就將該項聲明為關鍵製程參數，這對於我們模型中的前三項來說是正確的。
在定義了關鍵過程參數之後，當然，我們需要對模型中的所有回應進行相同的操作。接下來，我們將使用效能分析器來確定這些製程參數的可接受範圍。我已經預先填充了一些數據，但我會簡要解釋一下我的做法。我從性能分析器的選單中開啟了模擬器選項，然後添加了相應的均方根誤差 (RMSE) 值，也就是響應的隨機雜訊。
此外，我還定義了一個三角分佈。首先，針對各個因子進行三角分佈的擬合，其峰值位於規模化過程的設定點，上下兩端則代表DOE研究中的極值點。
這樣我們就可以輕鬆地在這裡模擬我們的流程，看看我們的缺陷率有多高？正如我們所看到的，缺陷率相當高，約為33%，顯然需要改進。
過去，我們使用顧問提供的「失效邊緣」腳本來定義我們已驗證的可接受範圍。目前，Lentigen 工廠和我們在 Gaithersburg 的製程開發基地也仍在使用 JMP 16，因為他們仍在使用 JMP 16。但是，自 JMP 17 起，我們新增了「設計空間分析器」功能，今天我也想向大家展示這個工具。
我將打開設計空間分析器，我最喜歡的是我們可以直接在線查看整個過程的檢查部分。每個回應也都有這個功能，所以我們可以查看每個回應的單獨檢查部分。現在我們可以手動調整因子範圍，也可以自動調整，我現在就來示範一下。
您可以看到檢驗比例在增加，係數範圍正在縮小，我們的最終目標是使檢驗比例至少達到 99%，而現在已經實現了。您可能會得出這樣的結論：「哇，這太嚴格了。天哪，這對我們的生產團隊來說不切實際。」 當然，您也可以根據自身需求調整這些限制。
例如，這裡我們有很大的靈活性，我們可以稍微收緊這個範圍，而且，正如我們所見，這裡甚至給了我更大的靈活性。這非常好。您可以繼續操作，直到您對參數範圍和檢驗部分最終滿意為止。這些限制我們之後定義，或透過此程序定義。當然，您可以將其縮小到更相關的十進制位數，即此處相應的因子範圍，但這些最終是經過驗證的流程可接受範圍。
然後我們也可以嘗試分析器的各個中點，以及各個限值，然後我們使用三西格瑪限值的正常選項，然後我們可以再次驗證流程的檢查部分，當然，結果再次高於 99%，這正是我們的目標，非常好。
最後，與生產部門核實這些限制當然也非常非常重要和必要，因為這些限制當然必須在日常生產中切實可行，這最終會與一些生產部門進行討論。
我希望我已經向您展示了我們已建立的一套非常有效的利用設計空間定義PAR和CPP的方法。我們最初討論了基於風險的方法，以便真正為您的DOE研究量身定制設計，這完全基於您的特定需求。我們也討論如何定義關鍵製程參數，同時考慮其對關鍵品質屬性（CQA）的實際影響。此外，我們還討論瞭如何為您的製程定義經過驗證的可接受範圍，以及如何使用設計空間分析器來完成這項工作。
正如我所說，我們也把這種理念運用到我們自己的產品中，而且非常高興的是，我們的一位客戶去年也運用這種方法成功通過了生物製品許可申請（BLA）。最後，感謝各位的關注。
