细胞和基因治疗领域对稳健且可扩展的慢病毒载体生产工艺的需求，推动了先进技术的应用。本次演讲将深入探讨一种创新的工艺开发方法，重点介绍基于质量源于设计 (QbD) 的策略，并着重阐述 JMP 软件的强大功能。
为严格遵守工艺性能验证的监管要求，我们的方法论无缝融合了传统与现代原理，并在工艺验证生命周期的第一阶段工艺设计中将JMP作为关键工具。利用JMP进行实验设计（DOE）有助于全面表征慢病毒载体生产工艺，从而精确识别关键工艺参数（CPP）并建立可接受范围（PAR）。
通过利用软件的统计分析和可视化功能，我们确保决策以数据为驱动，从而增强对流程的理解和控制。本次演讲重点阐述了JMP在推进QbD原则应用以满足生物工艺不断变化的需求方面所发挥的关键作用。
欢迎聆听我的演讲。我叫约翰-克里斯托夫·德特曼，今天我想向大家介绍我们利用实验设计加速慢病毒载体生产工艺开发的方法。这套方法目前已成功应用于我们位于盖瑟斯堡的工艺开发部门的一个客户项目中，并且是与托马斯·利特尔咨询公司合作开发的。
在今天的报告中，我将在现有数据分析策略的基础上，引入一些新的视角，这些视角在我看来非常有帮助。报告将分为两部分。第一部分，我将对主题进行总体介绍；之后，我将简要演示如何使用 JMP 来评估实验设计 (DOE)。
但在正式开始之前，我想先简要概述一下我们的核心竞争力。Miltenyi Bioindustry 是一家专注于细胞和基因治疗的合同研发生产机构 (CDMO)，同时也是 Miltenyi Biotec 集团的成员。我们不仅将自身专业知识应用于 CAR-T 细胞产品，更在符合 GMP 标准的慢病毒载体和细胞产品的生产方面积累了丰富的经验。
我们还提供广泛的慢病毒载体生产平台，此外，我们还可以……我们的产品开发团队支持进一步的工艺开发优化或特定表征研究，这确实有助于商业化。
我们还提供标准分析平台，这些平台还可以进一步开发，以建立其他检测方法；我们还可以支持将技术和检测方法转移到客户的内部细胞生产设施；我们还可以提供监管专家的指导。
我们的总部位于贝尔吉施格拉德巴赫，拥有慢病毒载体工艺开发和细胞处理设施。我们在盖瑟斯堡、圣何塞和上海也设有细胞工厂。我们在德国的主要符合GMP规范的载体生产基地位于泰特罗。我们在盖瑟斯堡也拥有大型载体生产设施，慢病毒载体工艺开发总部也设在这里。
在载体生产方面，我们提供基于第三代技术的系统，这意味着我们遵循最高的安全标准。我们的工艺无需血清，采用悬浮液生产，可进行规模化生产，并可在美国或泰特罗进行。作为一家全球领先的符合GMP规范的载体生产商，我们拥有丰富的经验，已成功利用我们的平台工艺生产了数百批符合GMP标准的载体。
这些幻灯片大致概述了产品生命周期，如果您想将您的产品（例如您的细胞和基因治疗产品）推向商业化，就应该遵循这个流程。基于这张图表，我想向您展示我们需要更深入地探讨的产品生命周期的哪个阶段。
首先，您需要收集有关产品和待开发工艺的知识，目的是编制一份能够充分反映产品质量的质量属性清单。之后，将分别进行工艺开发和工艺表征，最终生成控制策略和设计空间。
接下来将进行过程性能确认，也称为过程验证。然而，这一步骤并非最终的确认步骤，而是对该确认状态进行持续验证的起点，也称为持续过程验证。
当然，我们无法在此流程图中讨论所有内容，但我今天想重点讨论设计空间的生成，以及我们使用哪些方法来生成设计空间。我们还将讨论如何定义工艺的关键参数，即那些其变化会影响关键质量属性，因此需要进行监控和控制的参数。此外，我们还将讨论如何定义工艺参数的已验证可接受范围，即工艺参数的特征范围，在该范围内操作，同时保持其他参数不变，将能够生产出符合相关质量要求的材料。
但在深入探讨之前，我想补充一些关于设计空间的内容。左侧给出了一个示意图，其中白色区域代表符合规格的区域，阴影区域代表不符合规格的区域。据我所知，设计空间并非工艺验证的强制性要求。然而，相关机构强烈建议建立设计空间。
ICH Q8 中将质量保证概念定义为输入变量的多维组合和相互作用，旨在确保产品质量。它通过系统化的方法建立，包括优化关键物料属性和工艺参数，并运用实验设计等工具。此外，设计空间还能确保工艺在既定参数范围内运行，从而持续满足质量标准和产品规格。
它还能在保证产品质量的前提下，实现灵活性和过程控制，因为它能够真正识别潜在的故障模式和运行极限。这意味着，在设计阶段，我们最终能够定义具体的参数范围，即经过验证的可接受范围。
但是，我们如何构建设计空间呢？首先，我们会进行低层次的风险评估。当然，在进行风险评估之前，还需要完成几个步骤，例如产品和流程的范围界定。不过，这些内容不在今天的讨论范围之内。
低级别风险评估涉及对潜在影响较大的工艺参数进行基于风险的估计。我们将首先列出相关的工艺参数，并将它们与相应的响应关联起来。之后，评估将基于工艺参数的变化可能对响应产生的影响程度。
例如，如果假设某个工艺参数的影响非常大，或者我们对潜在的影响一无所知，那么我们就会相应地定义一个高风险评分。但是，如果我们已经知道该工艺参数没有影响，或者对此有很高的把握，那么我们就可以定义或标注一个低风险评分。这有助于我们识别潜在的非影响性工艺参数，从而将其从实验设计（DOE）研究中排除。
同样的方法也适用于更高阶的项，例如双因素交互作用或二次项。同样，科学原理和先验知识可以帮助确定哪些高阶项应该纳入研究，哪些不应该纳入。
现在，在两种评估中，对主要效应的评估以及对交互作用的评估最终使我们能够非常清晰地定义 DOE 研究设计，因为简单来说，你可以说，对于你想研究的每个模型项，都需要进行一次额外的实验运行，通过这种方法，就有可能创建一个真正符合你特定要求的特定设计。
为了生成我们的DOE研究，我们使用了JMP的定制DOE平台。设计好DOE研究后，研究人员就可以进入实验室进行所有实验，收集所有数据，并利用这些数据定义我们的统计模型。统计模型描述了输入变量、影响因素和响应之间的关系。我们可以利用该模型来定义关键工艺参数（CPP），因为我们认为仅凭风险评估不足以检测和控制CPP。CPP的检测和控制必须基于对各因素如何直接影响响应的测量。显然，DOE是最佳选择，因为它能够有效地分离每个因素及其相互作用对关键响应的影响。
为了确定关键工艺参数 (CPP)，一方面，我们需要对各因素进行尺度估计，以最终获得其效应量；另一方面，我们还需要确定容差范围，即上限规格限和下限规格限之间的区域。最后，我们确定那些在实验设计 (DOE) 研究中使响应均值偏移超过容差 20% 的因素，并将这些因素视为关键工艺参数。我再次强调，在实验设计 (DOE) 研究中使响应均值偏移超过容差 20% 的因素被视为关键工艺参数。
在确定了单元操作的关键工艺参数 (CPP) 之后，接下来将利用设计空间来确定工艺的具体参数范围。由于设计空间具有很强的动态性，并且会随着各个参数的设置而变化，因此我们采用蒙特卡罗模拟来模拟批次间的差异，并探索设计空间的动态特性。
本次模拟将包含三个关键的变异来源。一方面，是模型本身、特征响应或产品带来的变异，以及我们研究的每个因素带来的变异；另一方面，我们还会考虑模型未涵盖的残差变异，也称为均方根误差。例如，这可能源于分析方法本身的变异。结合这些信息，JMP 可以生成或模拟数千个实验，从而帮助您评估和估计工艺流程的能力。
例如，在这个例子中，我们看到缺陷率或不合格率超过 33%，这太高了，因此我们显然需要对工艺限制或参数限制进行一些调整。
为了确定我们的因子范围，我们使用了顾问提供的脚本，该脚本与设计空间分析器非常相似。该脚本有助于可视化模拟数据以及过程中可能发生的故障率。图中红色的点代表模拟实验运行的结果（这些结果不符合规范），绿色的点代表我们的检验运行结果。
我非常喜欢这张图表，因为它能够真正评估各个因素对我们响应的影响程度。例如，对于因素 D，我们可以看到，与响应 A 相关的是，尤其是在因素范围的高端，检验运行的比例也更高。通过手动调整这些限值，我们能够定义更有意义、更合理、更高效的工艺参数范围，从而实现更稳健的生产。之前，我们大约有 33% 的不合格点，现在低于 1%，这完全满足了我们的要求。这些我们手动定义的限值，现在被用作我们经过验证的可接受的工艺参数范围。
我们还会根据历史数据、设备和个人能力，并考虑已建立的、经过验证的可接受范围，来定义我们的正常操作范围，这意味着这些 NOR 限制通常应该比 PAR 更严格。
现在轮到我做演示了。接下来我将切换到JMP软件，开始我的演示。今天我想给大家展示一个例子，这个例子也来自我们的一项特性研究。在这个实验设计（DOE）中，我们设置了五种不同的响应变量。我们还研究了六个不同的因素，并根据初步的风险评估，最终决定研究所有主效应，同时也研究一些双因素交互作用以及一些二次项，最终完成了大约16次实验的DOE研究。
为了评估我们的DOE研究，我们通常使用JMP的拟合模型平台。在进行具体的模型评估之前，我们总是会先进行数据质量检查。这意味着我们会查看模型的残差，看看残差中是否存在特定的模式，这些模式可能表明存在未知的活性效应。但理想情况下，残差应该围绕零线随机分布。图中的蓝线表示残差呈正态分布，这与我们的情况相符。
为了筛选异常值，我们使用外部学生化残差。建议使用 Bonferroni 限度，因为它提供了一种更保守的方法，从而降低了错误地检测到偏离趋势点（异常值）的风险。
以下是一些关于处理异常值（例如偏离趋势点）的补充说明，尤其是在监管环境下工作并向FDA等机构报告时。即使您检测到异常值（即该数据点可能超出Bonferroni校正限值），也不意味着您应该立即将其从数据集中排除。始终建议您为排除异常值提供科学依据，例如，流程中存在未记录的处理错误，或者分析方法存在缺陷。
如果无法做到这一点，您还可以考虑进行模型比较，即将包含异常值和不包含异常值的模型进行比较，并解释为什么不包含异常值的模型更能代表您的流程。但仅凭统计方法排除数据点是不推荐的。
数据质量检查完成后，我们将进行模型回归。因此，我们采用逐步后退回归法，这意味着我们将从模型中移除不显著的项。我们遵循效应层级原则，也就是说，只有当主效应不包含在更高阶的项中（例如二次项或交互项）时，才允许移除它们。
例如，这里用这个小符号标记出来。这表明或告诉我们，这个主效应也是交互作用的一部分，因此，除非这个交互作用也被排除，否则我们不能排除这个主效应。所以，我们可以排除这个交互作用。我们也可以排除这个主效应，因为它不是高阶项的一部分。
是的，我们从模型中移除项的阈值是 p 值 0.1，在非常接近此阈值的情况下，我们还会考虑模型的均方根误差，这意味着当我们移除该项并且 RMSE 下降时，这种排除是合理的，因为我们想要减少未知变异，而未知变异由均方根误差表示。
然而，当我们移除该项后，RMSE 会增加（现在的情况就是这样），我们不会排除这个数据点，因为它显然有助于解释模型变异，或者说，是的，我们实验中的模型变异。
现在我们已经有了最终模型，接下来需要保存预测公式以及标准误差的预测公式，后者对于后续定义可接受范围至关重要。但在进行这些步骤之前，我们需要先定义关键过程参数。因此，我们需要确保已打开缩放估计表（目前已打开），然后使用顾问提供的插件脚本来识别关键过程参数。
具体操作如下。首先，我们需要选择 FIT 模型报告，打开缩放估计表；然后，我们需要定义当前正在研究的响应的规格限值。通常情况下，理想情况下，您应该已经预先定义了规格限值。但是，例如，当您研究流程中的某个单元操作时，该中间产品的规格限值可能尚未确定。在这种情况下，我们会尝试使用缩放数据，然后使用最终产品规格合格批次的最小值和最大值。
如果上述方法也不可用，我们将采用默认方法来定义规格限，即规格限的下限使用 DOE 过程均值的 80%，规格限的上限使用过程均值的 150%。但幸运的是，我们目前已经设定了规格限，下限为 150，上限为 350。
接下来我们可以继续。下一步是确定关键工艺参数的阈值。之前我说过，当平均偏差达到公差的20%时，我们就将工艺参数判定为关键参数。当然，您也可以根据自身需求调整阈值，无论是增加还是减少，都随您选择，但我们这里暂且沿用20%这个阈值。
最后，我们点击“运行”。脚本随后会执行CPB计算，该计算使用缩放后的估计值或系数（也称为半效应），并将其乘以一个特定的乘数。对于主效应，我们应用乘数2。交互作用也遵循同样的规则，而对于二次效应，我们则使用乘数1。
这样，就可以计算出总效应，然后将该总效应与公差范围（即上下规格限之间的区域）联系起来，如果总效应超过该公差范围的 20%，我们就将该项声明为关键工艺参数，这对于我们模型中的前三项来说是正确的。
在定义了关键过程参数之后，当然，我们需要对模型中的所有响应进行同样的操作。接下来，我们将使用性能分析器来确定这些过程参数的可接受范围。我已经预先填充了一些数据，但我会简要解释一下我的做法。我从性能分析器的菜单中打开了模拟器选项，然后添加了相应的均方根误差 (RMSE) 值，也就是响应的随机噪声。
此外，我还定义了一个三角分布。首先，针对各个因子进行三角分布的拟合，其峰值位于规模化过程的设定点，上下两端则代表DOE研究中的极值点。
这样我们就可以轻松地在这里模拟我们的流程，看看我们的缺陷率有多高？正如我们所看到的，缺陷率相当高，约为33%，显然需要改进。
过去，我们使用顾问提供的“失效边缘”脚本来定义我们已验证的可接受范围。目前，Lentigen 工厂和我们在 Gaithersburg 的工艺开发基地也仍在使用 JMP 16，因为他们仍然在使用 JMP 16。但是，自 JMP 17 起，我们新增了“设计空间分析器”功能，今天我也想向大家展示这个工具。
我将打开设计空间分析器，我最喜欢的是我们可以直接在线查看整个过程的检查部分。每个响应也都有这个功能，所以我们可以查看每个响应的单独检查部分。现在我们可以手动调整因子范围，也可以自动调整，我现在就来演示一下。
您可以看到检验比例在增加，系数范围在缩小，我们的最终目标是使检验比例至少达到 99%，而现在已经实现了。您可能会得出这样的结论：“哇，这太严格了。天哪，这对我们的生产团队来说不切实际。” 当然，您也可以根据自身需求调整这些限制。
例如，这里我们有很大的灵活性，我们可以稍微收紧这个范围，而且，正如我们所见，这里甚至给了我更大的灵活性。这非常好。您可以继续操作，直到您对参数范围和检验部分最终满意为止。这些限制我们之后定义，或者通过此程序定义。当然，您可以将其缩小到更相关的十进制位数，即此处相应的因子范围，但这些最终是经过验证的流程可接受范围。
然后我们还可以尝试分析器的各个中点，以及各个限值，然后我们使用三西格玛限值的正常选项，然后我们可以再次验证流程的检查部分，当然，结果再次高于 99%，这正是我们的目标，非常好。
最后，与生产部门核实这些限制当然也非常非常重要和必要，因为这些限制当然必须在日常生产中切实可行，这一点最终会与一些生产部门进行讨论。
我希望我已经向您展示了我们已建立的一套非常有效的利用设计空间定义PAR和CPP的方法。我们最初讨论了基于风险的方法，以便真正为您的DOE研究量身定制设计，这完全基于您的具体需求。我们还讨论了如何定义关键工艺参数，同时考虑其对关键质量属性（CQA）的实际影响。此外，我们还讨论了如何为您的工艺定义经过验证的可接受范围，以及如何使用设计空间分析器来完成这项工作。
正如我所说，我们也把这种理念运用到我们自己的产品中，而且非常高兴的是，我们的一位客户去年也运用这种方法成功通过了生物制品许可申请（BLA）。最后，感谢各位的关注。
