相対力価アッセイは、バイオ医薬品のライフサイクル全体を通じて医薬品の生物学的活性を評価する上で極めて重要です。変動性の管理、アッセイ条件の最適化、そして一貫した性能の確保は不可欠ですが、同時に困難を伴います。
JMPは、データ可視化、統計分析、モデリングツール（ロジスティック回帰、最適なアッセイ条件を確立するための応答曲面法など）、混合効果モデル（中間精度および関連する複製戦略の推定用）を統合することで、堅牢なアッセイ開発、手順検証、そして継続的なパフォーマンスモニタリングを可能にします。JMPの自動化機能とスクリプト機能は、反復的なデータ分析をさらに効率化し、方法／オペレーターのパフォーマンス評価を容易にし、規制環境におけるバイオアッセイの継続的な手順性能検証（OPPV）を実現します。
私のプレゼンテーションのタイトルは「CMCにおける相対力価資産のライフサイクルにおけるJMPの活用」です。私はByondis社で働いています。オランダ東部のナイメーヘンに拠点を置く企業で、従業員は約300～350名です。主に難治性のがんを対象とした標的医薬品の開発を行っています。製造している製品は、抗体医薬品、コンジュゲート抗体、モノクローナル抗体です。
モノクローナル抗体はY字型の複雑な高分子タンパク質です。組換え細胞培養発現システムから産生され、これらの細胞は目的の産物を産生するために必要な情報を含むように遺伝子操作されています。これは抗体薬物複合体の模式図であり、ここでもY字型の複雑な高分子構造が見られます。リンカーを介して結合された薬剤は、化学構造です。
これはバイオテクノロジー製品のライフサイクルの概要です。研究、開発、そして願わくば商業化という流れがあります。私たちの研究チームは、いわゆる臨床候補化合物の開発に責任を負っています。臨床候補化合物とは、前臨床試験で十分な有効性と安全性を示した有望な化合物です。私たちは、この化合物を臨床試験に進めるのに十分だと考えています。
開発部門はCMC（Chemistry Manufacturing and Control：化学製造管理）と呼んでいます。ここでは製造プロセスを開発します。この製造プロセスによって安全で、できれば人体に有効な医薬品を生み出し、安定した品質を維持したいと考えています。
このプロセスの開発は、主に上流処理部門と下流処理部門の2つのグループによって担われています。USPは、バイオリアクター内でのエンジン自体の培養条件の最適化に注力し、生産プロセスのスケールアップも担当しています。DSPは、細胞培養物からの生物学的製品の精製と分離を担当し、最終製品が純粋で濃縮されており、汚染物質を含まないことを保証します。
それぞれのプロセスを開発するために、これらのグループは、データに基づき、科学的に健全で、リスクに基づいた情報に基づいた意思決定を行う必要があります。必要な情報の大部分は、分析開発グループから提供されます。私のグループは分析開発グループに属しており、力価アッセイグループ、つまり機能アッセイを開発するグループと呼ばれています。
効力試験は、標的の生物学的基質との相互作用によって製品が誘発する生物学的活性を定量化します。臨床現場における生物学的活性を模倣することが望まれます。
これは、力価測定法、あるいは分析法全般のライフサイクルです。当社では、分析法の設計・開発において、意図された目的への適合性を実証し、その実証された適合性が分析法のライフサイクル全体を通じて維持されることを検証・管理しています。
力価アッセイの設計と開発の前提として、以下の点を考慮する必要があります。分析方法、あるいは一般的な分析方法は、本質的にはプロセスです。分析プロセスは、入力（この場合はサンプル）を生データ（出力）に変換します。力価アッセイの生データは、薬物または製品の濃度を上昇させながら生物系に負荷をかけた結果の測定値の集合で構成されます。この結果、生物活性は上昇し、最終的にはプラトーに達します。
次に、生データにロジスティック回帰分析を行い、モデルを当てはめることで用量反応関係を算出します。これらの用量反応関係にはパラメータ情報が含まれており、サンプルを介した用量反応曲線を、ここで赤で示した参照標準曲線と比較することができます。次に、水平方向のシフトを計算し、相対的な効力の推定値を得ることができます。この推定値は、パーセンテージまたは比率で表します。最終的に、この相対的な効力値、または特定の数の相対的な効力値の幾何平均から情報が得られます。
前文をまとめると、バイオアッセイ（生物力価アッセイ、生物学的アッセイなど、様々な名称で呼ばれる）は、概念的にはプロセスを表しています。そのため、JMPは、プロセス開発、トラブルシューティング、そして管理のための汎用ツールを数多く適用できます。また、これらのアッセイは、化学的手法を用いた試験よりも大きな変動を示すことが多い点も覚えておく必要があります。
設計と開発に取り掛かります。生物学的試験の要件がある場合、まず潜在的に重要な変数を特定し、選択することから始めます。そのために、私たちは知識ベースとなる先行知識を活用し、科学的根拠と常識に基づき、実用上の制約を考慮し、初期実験を実施します。これらの考慮事項について考えを整理するために、例えばJMPの機能である石川ダイアグラムを使うことができます。
次に、設計空間（分析用語ではMODR、メソッド操作可能設計領域）の設定を開始します。実験計画法を用いて最適な設定を見つけ、正確かつ精密な相対力価の結果をもたらす曲線を作成します。
これは、標的細胞とエフェクター細胞、あるいは標的細胞とエフェクター細胞の数を変化させた多変量実験計画の結果です。目視では、赤い曲線は必ずしも要件を満たしていないため、黒い曲線のいずれかを選択する必要があります。どの用量反応曲線が最適かを客観的に判断するには、統計解析に頼る必要があります。
これらの応答曲面モデル設計に慣れれば、等高線図、予測プロファイラー、応答曲面プロットを理解できるでしょう。予測プロファイラーは、関心のある因子、水準範囲、関心のある応答、最も重要な因子を赤で表示し、望ましい結果を示します。この場合、この応答は可能な限り低く、この応答は目標値通り、この応答は可能な限り高くしたいと考えます。
データにモデルを当てはめるために、4パラメータロジスティック回帰を使用します。これはJMPでも実行できますが、GMP認証済みの専用ソフトウェアを使用しています。JMPでは、傾きパラメータとEC50またはIC50と呼ぶものに異なる用語が使用されていることに注意してください。JMPでは、成長率と変曲点という用語を使用します。成長率は傾きパラメータ、変曲点はEC50です。JMPは、その他の関連統計もすべて提供します。例えば、平行性検定のF-Probや、もちろん相対的な効力値などです。JMPは、これらを参照標準物質に対する相対値として消去法として提供します。
次に、性能適格性評価または検証が行われます。ここでは、意図された目的への適合性を実証します。ここでは、相対精度と中間精度という2つの主要な検証性能特性に焦点を当てます。
バリデーションとは、手順が意図された目的に適していることを実証する行為です。USP<1220>では、意図された目的への適合性を確認するすべての活動はバリデーションの範疇に含まれると規定されているため、私は適格性評価とバリデーションを同じ意味で使用しています。
これはバリデーション設計の例です。実は、この設計は米国慈善事業（United States Philanthropy）の生物検定用試験（1033）です。オペレーターは2名です。異なる96ウェルプレートを用いて、複数回、あるいは複数日にわたって、50%から200%までの公称効力範囲を測定します。また、USPでは異なる培地ロットが添加されるため、これも考慮すべき要素となります。
これは、このバリデーション設計から得られた相対力価測定値をグラフで表したものです。実験内測定値は異なるため、異なるプレートに同じサンプル、または異なるプレートに同じ公称濃度で測定されています。実験間測定値も異なるため、これらは異なる実験です。これらはすべて公称相対力価ごとの値です。また、2人の異なる測定者がいるため、青と赤の値は異なる測定者を表しています。これらのデータから、正確度と精度を推定できます。
JMPでは、制限付き最尤推定を用いた混合効果モデルを用いて、実験内および実験間の分散成分を推定できます。これらの分散成分の合計は、中間精度と呼ばれます。これにより、最適化された複製戦略を確立できます。これについては、後のスライドで詳しく説明します。
混合効果モデルを用いることで、他の検証研究因子の分散成分も推定できます。今回のケースでは、媒介変数の結び目も変動していました。JMPではこれをパレート図にプロットできるため、この因子が分散に最も寄与していることをすぐに特定できます。
分散成分調整を用いて、同じサンプルを異なるランで、あるいは同じラン内で異なる場所で繰り返し測定することで、中間精度を下げることができます。このグラフは、この戦略を用いた場合に中間精度がどのように低下するかを示しています。同じラン内で異なるプレートでの繰り返し測定回数を増やすとIPも低下しますが、その影響はそれほど顕著ではありません。ここでは異なるランを示しています。これにより中間精度が低下します。同じラン内で異なるプレートを見ると、中間精度も低下していることがわかります。
これは、この方法で変異を減らすことには限界があることも示しています。約15%から5%を少し超える程度まで減らしていきます。ある時点で、これはもはや実現不可能になります。黒色は繰り返し回数を示しています。変異を15%から5%に減らすには15回の繰り返しが必要ですが、これはもはや実質的に実現不可能です。
2つ目の重要な検証パラメータは相対精度です。ここでは、相対力価測定値が平均してサンプルの公称力価と一致することを期待します。ここで計算するのは、これらの平均値からの偏差です。回帰分析の結果は単位直線に近づくと予想されます。つまり、切片は0、傾きは1です。
回帰分析では、名目効力が高い場合、過大評価されている可能性が視覚的に確認できます。JMPでは回帰式も提供されており、切片が実際に0に近似しているか、傾きが実際に1に近似しているかを確認できます。
これは同じデータをプロットする別の方法です。高い名目効力において、おそらく過大評価、あるいはある程度の過大評価になっていることが確認できます。このプロットでは、同じデータに予測区間も含まれており、個々の測定値が外れ値になる可能性を評価することができます。
さらに、このプロットは、名目効力の対数ごとの分散推定値を提供します。これらの推定値は互いに一致し、平均すると全体の中間精度を表すはずです。混合効果モデルでは分散を一定にする必要があるため、これらの推定値は互いに一致するはずです。
最後に、バリデーションパラメータは、点線で示した事前定義された許容限界値と比較されます。この場合、公称効力の最高値である200%でもバリデーションに合格しません。これは、先ほど見た目視検査から既に予想できたことです。
また、オペレーターのパフォーマンス評価やオペレーターのトレーニングプロセスの一環として、検証と適格性評価を実施しています。適格性評価と検証は繰り返し実施しています。これを円滑に進めるため、データ分析を支援するスクリプトを作成しました。
次は性能適格性評価です。メソッドの性能に関連するバリデーション目標の受入れ基準をどのように設定するのでしょうか？ 一つのアプローチとして、仕様外となる確率を用いることがあります。このグラフは、与えられた能力を持つメソッドにおいて、製造プロセスが目標通りの場合、つまり参照標準の100%である場合、この時点では得られないはずのOS測定値の確率が非常に低いことを示しています。これが私たちが求めているものです。プロセス平均値が変化し、目標から外れると、仕様外の結果を得る確率が高まりますが、これはまさに私たちが求めているものです。
この等高線図には、選択した仕様に関してOS結果を得る確率が表示されています。ここでは、工程が目標通りの場合、OS結果は70～143%です。白い領域は、仕様外となる確率が5%未満の測定値を表しています。これは、工程が目標通りの場合、選択した仕様に関して望ましくない、誤った、仕様外の結果となる確率が低いことを意味します。
より厳格な仕様により、この領域は大幅に縮小されます。黒い線は、方法の能力を表しています。これは、方法の測定バイアスと方法の中間精度を組み合わせたものです。ここでは、バイアスが12%、中間精度が8%という数値が示されています。
この仕様では、この手法は適していません。黒い線は白い領域の外側で交差しています。このそれほど厳密ではない仕様では、この手法は適しています。黒い線は白い領域内で交差しています。このプロットは、事前定義された許容基準に照らし合わせて検証パラメータを設定するのではなく、この領域に収まる最終的な事後相対バイアスと中間精度の組み合わせを柔軟に選択できることを示しています。予測プロファイラーは基本的に同じ情報を提供します。JMPによって、異なる方法でデータを評価できるようになっているだけです。
最後に、手順のパフォーマンス検証を継続的に実施し、方法のライフサイクル全体を通じて、意図された目的への適合性が維持されていることを検証および制御します。
OPPVは現在進行中の作業で、このダッシュボードレイアウトを作成するためのスクリプトを作成しました。列切り替えの左側には、処理管理と許容限界との比較に使用する用量反応関連パラメータをいくつか追加しました。つまり、赤色で表示される管理限界は許容限界内に収まるはずですが、この場合は青色で表示される上限値です。
CUSUMチャートは、コントロールサンプルが目標値から逸脱し始めているかどうかを早期に特定するのに役立ちます。今回のケースでは、目標値は100%です。これは、意図された目的への適合性の低下の可能性を調査するきっかけとなります。
時間の制約によりここでは触れませんでしたが、最後に一言付け加えておきたいのは、バイオアッセイのライフサイクルに関連するその他の関連作業、たとえばバイオアッセイの世界で複雑かつホットな話題となっている参照標準のブリッジングや、多因子手法では非常に複雑になる可能性がある根本原因の調査などに JMP を使用しているということです。
最後に、私のグループの Dennie、Geert、Jake、Karlijn、Lisette、Pim、Rob、Sanne に感謝したいと思います。彼らはすべての作業を行い、JMP を使用してこれらの優れたデータを生成する人々です。
