Relative Wirkstärkebestimmungen sind entscheidend für die Bewertung der biologischen Aktivität von Arzneimitteln während ihres gesamten Lebenszyklus. Die Kontrolle der Variabilität, die Optimierung der Testbedingungen und die Sicherstellung einer konsistenten Leistung sind unerlässlich, aber anspruchsvoll.
Diese Präsentation erläutert, wie JMP die Entwicklung, Validierung und Überwachung von relativen Wirkstärkebestimmungen in der CMC (Chemie, Herstellung und Kontrollen) unterstützt.
Durch die Integration von Datenvisualisierung, statistischer Analyse, Modellierungswerkzeugen (wie logistischer Regression und Response-Surface-Methodik zur Festlegung optimaler Testbedingungen) und Mixed-Effects-Modellen (zur Schätzung der Zwischenpräzision und relevanter Replikationsstrategien) ermöglicht JMP eine robuste Testentwicklung, Verfahrensvalidierung und kontinuierliche Leistungsüberwachung. Die Automatisierungs- und Skripting-Funktionen von JMP optimieren zudem wiederkehrende Datenanalysen, erleichtern die Bewertung der Methoden- und Bedienerleistung sowie die kontinuierliche Überprüfung der Verfahrensleistung (OPPV) von Bioassays in einem regulierten Umfeld.
Der Titel meines Vortrags lautet: „Die Anwendung von JMP im Lebenszyklus eines Wirkstoffs mit relativ hoher Wirkstärke für CMC“. Ich arbeite bei Byondis, einem Unternehmen mit Sitz in Nijmegen im Osten der Niederlande. Wir beschäftigen etwa 300–350 Mitarbeiter. Wir entwickeln zielgerichtete Medikamente, vorwiegend für schwer behandelbare Krebsarten. Zu unseren Produkten gehören Antikörper-Wirkstoffe, Konjugate und monoklonale Antikörper.
Monoklonale Antikörper sind Y-förmige, komplexe makromolekulare Proteine. Sie werden in rekombinanten Zellkultursystemen hergestellt, wobei die Zellen gentechnisch so verändert werden, dass sie die notwendige Information für die Produktion des gewünschten Produkts enthalten. Die Abbildung zeigt ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit der ebenfalls Y-förmigen, komplexen makromolekularen Struktur. Der Wirkstoff ist über einen Linker, eine chemische Einheit, gebunden.
Dies ist ein allgemeiner Überblick über den Lebenszyklus eines Biotech-Produkts. Wir haben Forschung, Entwicklung und idealerweise auch Vermarktung. Unsere Forschungskollegen entwickeln einen sogenannten klinischen Kandidaten – eine vielversprechende Substanz, die in präklinischen Tests ausreichende Wirksamkeit und Sicherheit gezeigt hat. Wir halten dies für ausreichend, um sie in klinische Studien zu überführen.
Der Entwicklungsteil wird als CMC (Chemical Manufacturing and Control) bezeichnet. Hier entwickeln wir unseren Produktionsprozess. Wir wollen, dass dieser Produktionsprozess zu einem sicheren und idealerweise auch für Menschen wirksamen Medikament führt, und wir streben eine gleichbleibende Qualität an.
Zwei Gruppen sind hauptsächlich für die Entwicklung dieses Prozesses verantwortlich: die Abteilung für Upstream-Prozessierung (USP) und die Abteilung für Downstream-Prozessierung (DSP). Die USP optimiert die Wachstumsbedingungen des Motors in Bioreaktoren und ist für die Skalierung des Produktionsprozesses zuständig. Die DSP übernimmt die Reinigung und Isolierung des biologischen Produkts aus der Zellkultur und stellt sicher, dass das Endprodukt rein, konzentriert und frei von Verunreinigungen ist.
Um ihre jeweiligen Prozesse weiterzuentwickeln, müssen diese Gruppen fundierte, datengestützte, wissenschaftlich fundierte und risikobasierte Entscheidungen treffen. Ein Großteil der benötigten Informationen wird von der Gruppe für analytische Entwicklung bereitgestellt. Meine Gruppe ist Teil dieser Gruppe und trägt den Namen „Potenzbestimmungsgruppe“ oder „Gruppe für die Entwicklung funktioneller Assays“.
Potenzbestimmungen quantifizieren die biologische Aktivität, die durch das Produkt bei der Interaktion mit dem Zielsubstrat induziert wird. Idealerweise sollte diese Aktivität der biologischen Aktivität in der klinischen Situation entsprechen.
Dies ist der Lebenszyklus eines Wirkstoffbestimmungstests oder, wenn Sie so wollen, einer beliebigen Analysemethode. Wir entwickeln und konzipieren die Methode, weisen ihre Eignung für den vorgesehenen Zweck nach und stellen sicher, dass diese nachgewiesene Eignung während des gesamten Lebenszyklus der Methode erhalten bleibt.
Bevor wir mit der Konzeption und Entwicklung des Wirkstoffbestimmungstests beginnen, müssen wir Folgendes berücksichtigen: Analytische Methoden sind im Wesentlichen Prozesse. Dabei wird der Input – in diesem Fall die Probe – in Rohdaten, den Output, umgewandelt. Rohdaten für Wirkstoffbestimmungstests bestehen aus einer Reihe von Messungen, die sich aus der Belastung eines biologischen Systems mit steigenden Konzentrationen Ihres Wirkstoffs oder Produkts ergeben. Dies führt zu einer Zunahme der biologischen Aktivität, die schließlich ein Plateau erreicht.
Anschließend führen wir eine logistische Regression der Rohdaten durch, um ein Modell anzupassen, woraus sich Dosis-Wirkungs-Beziehungen ergeben. Diese Dosis-Wirkungs-Beziehungen enthalten Parameterinformationen, die es uns ermöglichen, die durch die Probe vermittelte Dosis-Wirkungs-Kurve mit einer Referenzkurve (rot dargestellt) zu vergleichen. Wir berechnen dann eine horizontale Verschiebung, die uns eine relative Wirkstärkeschätzung liefert, die wir entweder als Prozentsatz oder als Verhältnis angeben. Schließlich liefert uns dieser relative Wirkstärkewert oder das geometrische Mittel einer bestimmten Anzahl relativer Wirkstärkewerte weitere Informationen.
Um die Einleitung noch einmal zusammenzufassen: Bioassays, die unter verschiedenen Bezeichnungen wie Biopotenz-Assays oder biologischen Assays bekannt sind, stellen konzeptionell einen Prozess dar. Daher kann eine Vielzahl generischer Werkzeuge zur Prozessentwicklung, Fehlerbehebung und -steuerung mit JMP angewendet werden. Zudem ist zu beachten, dass diese Assays typischerweise eine höhere Variabilität aufweisen als chemisch basierte Tests.
Nun geht es an die Konzeption und Entwicklung. Wenn ein Bioassay benötigt wird, beginnen wir mit der Identifizierung und Auswahl der potenziell kritischen Variablen. Hierfür nutzen wir unser Vorwissen, unsere Wissensbasis, wissenschaftliche Erkenntnisse und gesunden Menschenverstand. Wir berücksichtigen praktische Einschränkungen und führen erste Experimente durch. Um all diese Überlegungen zu strukturieren, können Sie beispielsweise ein Ishikawa-Diagramm verwenden. Diese Funktion bietet JMP.
Anschließend legen wir unseren Designraum fest, der analytisch als MODR (methodisch operierbarer Designbereich) bezeichnet wird. Mithilfe von Versuchsplanung ermitteln wir die optimalen Einstellungen, um Kurven zu generieren, die uns genaue und präzise Ergebnisse zur relativen Wirkstärke liefern.
Dies ist das Ergebnis eines multivariaten Versuchsdesigns, bei dem wir die Ziel- und Effektorzellen bzw. deren Anzahl variiert haben. Eine visuelle Inspektion legt nahe, dass die roten Kurven unsere Anforderungen nicht unbedingt erfüllen, daher müssen wir eine der schwarzen Kurven auswählen. Um eine objektive Entscheidung darüber zu treffen, welche Dosis-Wirkungs-Kurve die beste ist, müssen wir uns auf eine statistische Analyse stützen.
Wenn Sie mit diesen Response-Surface-Modellen vertraut sind, erkennen Sie die Konturpläne, das Vorhersageprofil und die Response-Surface-Darstellung. Das Vorhersageprofil zeigt die relevanten Faktoren, den Wertebereich, die Zielgrößen, die wichtigsten Faktoren (rot hervorgehoben) und die gewünschten Ergebnisse. In diesem Fall soll die eine Zielgröße so niedrig wie möglich, die andere im Zielbereich und die dritte so hoch wie möglich sein.
Um ein Modell an unsere Daten anzupassen, verwenden wir eine logistische Regression mit vier Parametern. Dies ist in JMP möglich, wir nutzen jedoch spezielle, GMP-validierte Software. Beachten Sie, dass JMP unterschiedliche Bezeichnungen für den Steigungsparameter und die EC50 bzw. IC50 verwendet. JMP spricht von Wachstumsrate und Wendepunkt. Die Wachstumsrate wird für den Steigungsparameter und der Wendepunkt für die EC50 verwendet. JMP liefert uns außerdem alle weiteren relevanten statistischen Werte, beispielsweise den F-Wert für einen Parallelitätstest und natürlich unsere relativen Wirkstärkewerte, die JMP relativ zu einem Referenzstandard als Erasure-Wert angibt.
Im nächsten Schritt folgt die Leistungsqualifizierung bzw. -validierung, bei der wir die Eignung für den vorgesehenen Zweck nachweisen. Ich werde mich auf zwei wesentliche Leistungsmerkmale der Validierung konzentrieren: die relative Genauigkeit und die Zwischenpräzision.
Validierung ist der Nachweis, dass ein Verfahren für den vorgesehenen Zweck geeignet ist. Ich verwende die Begriffe Qualifizierung und Validierung synonym, da USP<1220> besagt, dass alle Aktivitäten, die die Eignung für den vorgesehenen Zweck bestätigen, unter den Begriff Validierung fallen.
Dies ist ein Beispiel für ein Validierungsdesign. Dieses Design stammt von der United States Philanthropy (USP) unter der Nummer 1033 für Bioassays. Wir haben zwei Mitarbeiter. Wir messen verschiedene nominale Wirkstärken zwischen 50 % und 200 % über mehrere Durchläufe oder Tage auf unterschiedlichen 96-Well-Platten im selben Durchlauf. Zusätzlich verwendet die USP verschiedene Medienchargen, was ebenfalls berücksichtigt werden muss.
Dies ist eine grafische Darstellung der relativen Wirkstärkemessungen, die sich aus diesem Validierungsdesign ergeben. Wir haben verschiedene Messungen innerhalb eines Laufs durchgeführt, d. h. dieselbe Probe auf verschiedenen Platten oder dieselbe nominelle Konzentration auf verschiedenen Platten. Wir haben verschiedene Messungen zwischen den Läufen durchgeführt, d. h. die verschiedenen Läufe. Dies sind alle Messungen pro nomineller relativer Wirkstärke. Da wir zwei verschiedene Bediener hatten, kennzeichnen die blauen und roten Markierungen die jeweiligen Bediener. Aus diesen Daten können wir Genauigkeit und Präzision abschätzen.
JMP ermöglicht uns die Berechnung und Anwendung eines Mixed-Effects-Modells mit eingeschränkter Maximum-Likelihood-Schätzung, um die Varianzkomponenten innerhalb und zwischen den Läufen zu schätzen. Die Summe dieser Varianzkomponenten bezeichnen wir als Zwischenpräzision. Dies erlaubt uns, eine optimierte Replikationsstrategie zu entwickeln, worauf wir in einer späteren Folie genauer eingehen werden.
Mithilfe eines Mixed-Effects-Modells können wir auch Varianzkomponenten für weitere Faktoren der Validierungsstudie schätzen. In diesem Fall wurden die mittleren Knoten ebenfalls variiert. JMP ermöglicht die Darstellung in einem Pareto-Diagramm, wodurch wir sofort erkennen können, dass dieser Faktor den größten Beitrag zur Varianz leistet.
Wir können die Varianzkomponentenkorrektur nutzen, um die Zwischenpräzision zu reduzieren, indem wir die Messung derselben Probe entweder in verschiedenen Läufen und/oder an verschiedenen Stellen innerhalb desselben Laufs wiederholen. Die Grafik zeigt, wie sich die Zwischenpräzision durch diese Strategie verringert. Eine Erhöhung der Anzahl wiederholter Messungen auf verschiedenen Platten innerhalb desselben Laufs reduziert die Zwischenpräzision ebenfalls, jedoch weniger stark. Hier sehen wir die verschiedenen Läufe. Dies reduziert unsere Zwischenpräzision. Betrachtet man die verschiedenen Platten innerhalb desselben Laufs, so ist auch hier eine Reduzierung der Zwischenpräzision erkennbar.
Dies zeigt uns auch, dass die Reduzierung der Varianten auf diese Weise begrenzt ist. Wir gehen von etwa 15 % auf etwas über 5 %. Ab einem gewissen Punkt ist dies einfach nicht mehr praktikabel. Schwarz markiert ist die Anzahl der Wiederholungen. Wir benötigen 15 Wiederholungen, um unsere Varianten von 15 % auf 5 % zu reduzieren, was praktisch nicht mehr durchführbar ist.
Der zweite wichtige Validierungsparameter ist die relative Genauigkeit. Hierbei erwarten wir relative Wirkstärkemessungen, die im Durchschnitt mit der nominalen Wirkstärke der Proben übereinstimmen. Wir berechnen die Abweichung von diesen Mittelwerten. Wir erwarten, dass die Ergebnisse nach der Regression nahe an der Einheitsgeraden liegen, d. h. mit einem Achsenabschnitt von null und einer Steigung von eins.
Visuell lässt sich erkennen, dass die Regression bei höherer nominaler Wirkstärke eine Überschätzung nahelegt. JMP stellt uns außerdem eine Regressionsgleichung zur Verfügung, mit der wir überprüfen können, ob unser Achsenabschnitt tatsächlich nahe null und unsere Steigung tatsächlich nahe eins liegt.
Dies ist eine weitere Möglichkeit, dieselben Daten grafisch darzustellen. Sie bestätigt, dass wir wahrscheinlich bei den hohen nominalen Wirkstärken eine Überschätzung oder zumindest eine gewisse Überschätzung haben. Auch diese Darstellung der gleichen Daten enthält Vorhersageintervalle, die es uns ermöglichen, einzelne Messwerte hinsichtlich potenzieller Ausreißer zu beurteilen.
Darüber hinaus liefert uns diese Grafik Varianzschätzungen pro logarithmischer nominaler Wirkstärke, die miteinander übereinstimmen sollten und im Durchschnitt die gesamte Zwischenpräzision repräsentieren. Diese Übereinstimmung ist notwendig, da wir für das Mixed-Effects-Modell eine konstante Varianz anstreben.
Abschließend werden die Validierungsparameter anhand vordefinierter Akzeptanzgrenzen (gestrichelte Linie) geprüft. In diesem Fall würde die höchste nominelle Wirkstärke von 200 % die Validierung nicht bestehen. Dies war bereits aufgrund der visuellen Inspektion zu erwarten.
Wir führen Validierungen und Qualifizierungen durch, um die Leistung von Bedienern zu bewerten oder sie im Rahmen ihrer Ausbildung zu schulen. Diese Qualifizierungs- und Validierungsübungen werden wiederholt durchgeführt. Zur Unterstützung dieser Schritte haben wir Skripte entwickelt, die uns bei der Datenanalyse helfen.
Als Nächstes folgt die Leistungsqualifizierung. Wie legen wir Validierungskriterien für die Leistungsfähigkeit unserer Methoden fest? Ein Ansatzpunkt ist die Wahrscheinlichkeit, außerhalb der Spezifikation zu liegen. Die Grafik zeigt für eine Methode mit gegebener Leistungsfähigkeit, dass die Wahrscheinlichkeit einer Messung außerhalb der Spezifikation – die zu diesem Zeitpunkt nicht auftreten sollte – sehr gering ist, wenn der Fertigungsprozess im Sollbereich liegt (idealerweise 100 % des Referenzstandards). Genau das wollen wir erreichen. Ändert sich der Prozessmittelwert, weicht er vom Sollwert ab, steigt die Wahrscheinlichkeit für ein Ergebnis außerhalb der Spezifikation – und genau das ist erwünscht.
Dieses Konturdiagramm zeigt die Wahrscheinlichkeiten für ein Ergebnis außerhalb der Spezifikation (OS) in Abhängigkeit von der gewählten Spezifikation. Im Beispiel liegt diese Wahrscheinlichkeit zwischen 70 % und 143 %, wenn der Prozess im Sollbereich liegt. Der weiße Bereich repräsentiert eine Messung mit einer Wahrscheinlichkeit von unter 5 %, außerhalb der Spezifikation zu liegen. Dies bedeutet eine geringe Wahrscheinlichkeit für ein unerwünschtes, falsches Ergebnis außerhalb der Spezifikation für die gewählte Spezifikation, wenn der Prozess im Sollbereich liegt.
Eine strengere Spezifikation verringert diesen Bereich deutlich. Die schwarzen Linien stellen die Leistungsfähigkeit des Verfahrens dar, die sich aus der Messabweichung und der Zwischenpräzision des Verfahrens ergibt. Hier haben wir die numerischen Werte 12 für die Abweichung und 8 % für die Zwischenpräzision.
Für diese Spezifikation ist diese Methode nicht geeignet. Die schwarzen Linien verlaufen außerhalb des weißen Bereichs. Für diese weniger strenge Spezifikation ist die Methode geeignet. Die schwarzen Linien verlaufen innerhalb des weißen Bereichs. Diese Grafik bietet uns Flexibilität bei der Auswahl der optimalen Kombinationen von relativer Abweichung und Zwischengenauigkeit im Nachhinein, die in diesen Bereich fallen, anstatt Validierungsparameter anhand vordefinierter Akzeptanzkriterien zu prüfen. Der Vorhersage-Profiler liefert uns im Wesentlichen dieselben Informationen. JMP ermöglicht uns lediglich eine andere Art der Datenanalyse.
Schließlich verfügen wir über eine kontinuierliche Überprüfung der Verfahrensleistung, bei der wir überprüfen und kontrollieren, ob die nachgewiesene Eignung für den vorgesehenen Zweck während des gesamten Lebenszyklus der Methode erhalten bleibt.
OPPV ist ein fortlaufendes Projekt, für das wir Skripte entwickelt haben, die zu diesem Dashboard-Layout führen. Links im Spaltenauswahlfeld haben wir verschiedene Dosis-Wirkungs-Parameter hinzugefügt, die wir kontrollieren und mit den Akzeptanzgrenzen vergleichen. Das heißt, unsere Kontrollgrenzen (rot) sollten innerhalb unserer Akzeptanzgrenzen liegen, die in diesem Fall die obere Grenze (blau) darstellen.
CUSUM-Diagramme helfen uns, frühzeitig zu erkennen, ob unsere Kontrollstichprobe beginnt, sich von ihrem Zielwert zu entfernen. In unserem Fall liegt dieser bei 100 %. Dies ist ein Anlass, einen möglichen Verlust der Eignung für den vorgesehenen Zweck zu untersuchen.
Was ich aus Zeitgründen nicht besprechen konnte, aber abschließend erwähnen möchte, ist, dass wir JMP auch für andere relevante Übungen im Zusammenhang mit dem Bioassay-Lebenszyklus verwenden, wie z. B. die Referenzstandardüberbrückung, die ein komplexes und aktuelles Thema in der Bioassay-Welt ist, und die Ursachenforschung, die bei diesen multifaktoriellen Methoden recht komplex sein kann.
Abschließend möchte ich meiner Gruppe, Dennie, Geert, Jake, Karlijn, Lisette, Pim, Rob und Sanne, meinen Dank aussprechen, denn sie sind es, die die ganze Arbeit leisten und mit JMP arbeiten, um diese tollen Daten zu generieren.
