大家好，我是Marco Kunzelmann，在勃林格殷格翰擔任首席統計師。我們與JMP的Chris Gotwalt在結合DOE數據和色譜數據方面開展了卓有成效的合作。雖然這項工作仍在進行中，但我們認為該專案已經發展到可以向大家展示當前成果的階段。請注意，演示中的許多步驟目前仍需手動完成，但這些步驟將在未來的JMP版本中自動化。
這個計畫的動機在於，提高效率和降低成本當然是工業界的基本目標。此外，近年來，監管機構和相關指南也越來越重視多元設計空間表徵和研究。例如，ICH Q8 和最近發布的 ICH Q14 就是很好的例子。實現這些監管機構要求的一種成熟方法是實驗設計，簡稱 DOE。
隨著ICH Q14（於2024年6月發布）的生效，透過實驗設計（DOE）進行統計建模已成為分析方法開發的一種途徑。然而，色譜圖通常非常複雜，因此，希望結合分析方法開發的人員通常會從色譜圖中提取特徵，並將其建模為UE輸入參數的函數。
這是什麼意思呢？特徵提取是指從色譜圖中提取訊息，例如峰高、峰保留時間，甚至是分析分辨率（它描述了兩個或三個峰彼此分離的程度）。特徵提取的問題在於它是一項繁瑣的工作，因為首先需要軟體進行峰值檢測。然後通常需要進行峰值積分，最後還需要將所有這些資訊從分析軟體匯出到 JMP，才能在 JMP 中使用常規的 DOE 方法進行建模。
此外，對於提取的每個特徵，都需要建立一個模型。在我之前的例子中，我們看到了九個不同的峰，光是描述峰的保留時間就需要九個模型。然後，描述分辨率、峰值高度等等也需要九個模型。你可以想像，當你想要優化所有這些單獨的模型時，最終結果的可解釋性會非常差，因為你只能獲得保留時間、峰高、分辨率等信息，而無法獲得完整的色譜圖。你永遠看不到完整的色譜圖。
這基本上就是我們在這個專案中想要實現的目標。我們的想法是，在JMP的功能資料瀏覽器中立即進行峰值檢測。然後，我們希望在JMP中對整個色譜圖進行數值參數化。對包含所有峰的完整色譜圖應用直接建模。最後，當然，我們也想利用JMP的互動式功能。這意味著我們希望在分析器中立即獲得一個互動式色譜圖，使用者可以真正地進行操作，並觀察不同的DOE因子設定如何影響色譜圖本身。
我和克里斯認為，透過展示過去一年我們處理過的兩個不同的資料集範例，可以更好地說明我們的工作流程。我們先來看第一個例子，氣相層析數據。氣相層析（簡稱GC）是一種廣泛應用的分析方法。簡單來說，就是將樣品蒸發，然後在氣相中，流動相與固定在毛細管上的固定相相互作用。分析樣品中每個組分的交互作用效應都不同。基於此，我們可以將這些不同的組件彼此分離，並最終透過偵測器進行偵測。
在這個例子中，我們使用了不同的氣相層析儀，稱為超快速氣相層析儀（hyperfast GC），其分離原理與普通氣相層析儀相同。然而，主要區別在於其升溫速率大幅提高，因此我們可以在1分鐘甚至更短的時間內完成色譜分析。這對本專案來說當然非常有利，因為我們可以輕鬆運行多種不同的實驗設定而不會浪費太多時間。
我們這次的DOE實驗是基於四個不同的DOE因素。這意味著我們有起始溫度、終止溫度、保溫時間和溫度變化時間。我想，除了數據表格之外，我還以溫度曲線圖的形式在右側展示這些資訊。這是我們設定的初始溫度。我們改變了初始溫度，並設定了不同的保溫時間。
透過改變Δt值，我們可以採用不同的加熱速率，並結合不同的終止溫度（即T₂）。由於我們可以輕鬆地在這台超高速氣相層析儀上進行大量實驗，因此我們決定採用全因子設計，進行81次實驗和7次中心點運行，以便充分獲取該系統的所有資訊。
因此，我們能源部（DOE）正在研究四個能源部因素對色譜圖中九個不同峰值的影響。下圖展示了一個氣相色譜圖範例，其中以原始數據的形式呈現了九個不同的峰值。您可以想像，最後我們得到了所有88個能源部實驗的色譜圖。
接下來基本上要交給克里斯了，他會更詳細地向你們展示他是如何從色譜圖中提取信息，最終生成合成色譜圖的。克里斯，請開始。
謝謝，Marco。這是分析器中合成或預測色譜圖的最終視覺化呈現，以及四個DOE因子。合成色譜位於左側，背景為黃色。我們需要建模的共有九個特定目標峰。
我將要展示的方法能夠創建一個易於理解的可視化介面，並帶有分析器控制功能，因此操作人員可以調整 DOE 因子設置，從而獲得最佳色譜圖。在本例中，最佳色譜圖指的是峰分離度最高或解析度最高的色譜圖。使用者可以從設計空間中心的設定（其中幾個峰值聚集在一起）逐步調整到本研究中我們所能找到的最佳分離度設定。
為此，我們克服了許多挑戰。首先，我們需要移除無關的溶劑峰和盲測基線。然後，我們利用 JMP Pro 18 功能資料瀏覽器中的峰值建模功能來識別和標記峰值。我們提取所有色譜圖中每個峰的峰高、半峰寬和洗脫時間。接著，我們使用 Genreg 對這些資料進行建模，並將所得的預測公式組合成一個整體的合成色譜圖公式。
去年我們剛開始做這件事的時候，需要大量的人工操作。 Ryan Parker 和 Clay Barker 在 JMP Pro 18 中做了大量工作來簡化流程。正如您將在我的演示中看到的那樣，雖然步驟仍然很多，但整個流程已經從需要幾天的人工操作縮短到大約一個小時，我們致力於在未來的 JMP Pro 版本中進一步簡化流程。
我們首先以常規方式進入FDE。之前需要用到的一個步驟是使用tabulate函數計算每個批次的原始起始時間和終止時間。這是為了對資料進行去對齊，並縮放盲測模型，以便將其從每個色譜圖中減去。這裡我們看到的是原始色譜圖。我們需要去除圖中占主導地位的溶劑峰。為此，我們使用Align Maximum函數。
現在我們可以找到溶劑峰之後、目標峰之前的對齊時間。我們使用十字線工具進行定位，發現所有溶劑峰與目標峰之間的時間間隔為 0.26 秒。我們過濾掉 0.26 秒之前的所有觀測值。現在資料中只剩下目標峰，我們將把這些峰保存為一個新的資料集，以便我們清楚知道正在處理哪些資料。
現在，我們進行了不含任何產品的基線盲測。我們需要從數據中去除這個訊號，因為它會污染我們的模型並導致結果偏差。這裡，我用p樣條擬合了盲測資料並保存了匯總結果。然後，我將該公式複製到去除溶劑峰的數據中。接著，我手動將色譜圖與盲測公式對齊，並在創建強度到盲測公式的列時，減去了盲測的偏差，使其恢復到絕對時間尺度。
現在我們已經得到了所需格式的色譜圖數據，可以回到 FDE 模組。我們將使用 JMP Pro 18 中新增的峰值查找功能。首先，我們運行自動峰值檢測。此功能會在資料中找到大量峰值，並給出每個候選峰值的範圍和中心位置。我們可以點擊「摘要」標籤查看最重要的峰值指標。
這裡可以看到AUC值、解析度、峰高和其他衍生峰的總指標。我們注意到一個問題，因為許多色譜圖的匯總資料中峰值的數量超過九個，但我們知道實際上每個光譜只有九個峰值。
因此，我們回到峰值尋找使用者介面，檢查峰值超過九個的光譜。經過一番搜索，我們發現所有高度小於 500 的所謂峰值都只是數據中的一些偶然誤差。這裡突出顯示了一個這樣的虛假峰值範例。我們可以使用「自動峰值移除」工具去除這些峰值，只需點擊該工具，並將有效峰值高度的下限設為 500 即可。
去除低於 500 的峰值後，我們現在可以獲得清晰準確的峰值匯總統計信息，用於構建合成色度 RAM 模型。我們將這些總結資訊儲存到一個新表中，然後使用廣義迴歸對所有擷取的指標來擬合對數常態二次響應曲面模型。之所以使用對數常態分佈，是因為所有指標都是嚴格正值。
實際上，我們需要像其他建模練習一樣，評估模型以確保其擬合良好。這裡我將略過這一步，但一旦我們滿意，就可以按住 Ctrl 鍵並儲存預測公式，一次儲存所有回應的預測公式。現在我們有了使用 DOE 因子預測色譜圖每個特徵的模型，我使用公式列建立了一個預測公式，該公式結合了每個峰的位置、半峰高、峰寬和峰高的各個 DOE 模型，從而計算合成色譜圖。
為了驗證我們的模型，我們查看了合成色譜（紅色）和實際色譜圖（藍色）的疊加圖。總體而言，我們發現該模型並不完美，但它似乎能夠較好地捕捉實際光譜中的主要特徵。接下來，我們只需使用分析器來尋找能夠提高峰值整體分辨率的因子設置，從設計中心開始，逐步優化設置，最終找到一種能夠盡可能完美地分離所有峰值的生產過程組分的分析方法。
現在我們有了一個簡單易懂的視覺化圖表，它展示瞭如何設定流程，並且便於與從事分析方法開發的人員溝通。接下來我會把圖表交還給馬可。
非常感謝Chris。 Chris向我們展示如何將矽膠色譜與GC資料結合使用。我們已經將這種方法應用到了另一個例子中，即毛細管凝膠電泳（CGE）。簡而言之，CGE只是另一種分析儀器。然而，它的分離技術略有不同，這也導致了不同的峰形，我們稍後會詳細討論。發展CGE方法的主要動機是我們需要將兩個不同的峰分離開來。坦白說，這裡指的是峰1和峰2。
您可以看到，這相當具有挑戰性，因為峰 1 與峰 2 相比非常小，而且這兩個峰的重疊程度也很大。我們再次嘗試找到最佳設置，以將這兩個成分彼此分開。這次我們有五個不同的 UE 因子，主要分為三個不同的水平，而最終濃度則分為四個不同的水平進行研究。
通常情況下，如果要研究所有組合，則全因子設計需要 324 次實驗。當然，這正是我們最終採用 I 最優設計的主要原因。透過這種方式，我們僅用 64 次實驗就節省了約 80% 的實驗次數。此設計不僅能夠解析主效應、雙因子交互作用和二次效應，還能解析 3、4 和 5 個因子的交互作用，以及二次效應與主效應的組合。
我們為什麼要這樣做呢？嗯，在 GC 的例子中，我們實際上已經研究出許多分析 DOE 因素是相互作用的，我們想更仔細地研究這一點，並更好地了解最終模型必須有多複雜才能獲得良好的精度和準確度。
通常情況下，正如我們之前所述，您可以對整個色譜進行建模，從而首先提取各個特徵。然而，在這種情況下，這種方法完全行不通，因為兩個峰值重疊得非常嚴重，分析軟體無法計算這兩個組分的分析解析度。這也是我們需要找到另一種方法來用數學方式描述色譜的另一個原因。
我們在這裡做了什麼？正如克里斯已經概述的那樣，我們當然可以用數學函數來描述峰值。峰高、保留時間、峰寬等等。對稱峰可以用左邊的這個公式來描述。
不幸的是，在CGE中，情況要複雜得多，因為CGE總是導致不對稱峰值。您也可以在這裡看到，第二個組分，也就是第二個峰，實際上根本不對稱。我們需要找另一個公式來描述這個峰的不對稱性。
我們在文獻中找到了這個簡潔的公式。參數 a 用來描述峰的不對稱性。您可以清楚地看到，在左側和右側，即使 a 值為 0，峰值仍然是不對稱的。 a 值越大，峰的不對稱性越強。其他參數基本上就是峰的保留時間、峰高等等。這與之前的基本原理相同，只是看起來稍微複雜一些。
現在我們要如何將這個公式匯入到 JMP 中呢？我們所做的就是在 JMP 中建立了一個新的公式列。若要建立公式列，只需依序點擊“列”、“公式”，即可進入公式編輯器。在公式編輯器左下角找到“參數”，點擊“新參數”，然後新增所有需要的參數即可。
這樣做之後，你就可以像我們在綠色矩形框內那樣建立兩個峰值公式了。第一個公式用來描述峰1的對稱性，第二個公式則更為複雜，因為它描述了峰的非對稱部分。你還可以看到我們在這裡輸入的所有參數：第二個峰值的 h1、w1、t1、m2、d2、a2 和 H2。接下來，我們需要找到所有這些參數的正確值。
首先，將分析儀器的所有原始資料導入JMP軟體。這裡，我們有一列用於記錄遷移時間，另一列用於記錄強度。我們用第三列（稱為「運行」）分隔所有單獨的電泳圖，該列即為DOE運行編號。
之後，您可以進入“分析”>“非線性”平台中的“專用建模”。在這裡，我們只需輸入 Y 反應值、強度值，以及預測公式（當然，我們使用新建的公式列），然後按列對所有內容進行分類，即我在這裡顯示的「運行」列，其中包含了所有單獨的 DOE 實驗。
之後，點擊“確定”，就會看到類似我們這裡看到的視圖。這裡展示的是第二個DOE實驗，我稍微放大了一下，只顯示26到28分鐘的數據。這些點實際上是真實的原始數據。實線是參數化函數，參數估計值如下所示。可以看到，初始值當然不是最優值。
下一步我們需要執行 JMP 來找到所有這些參數的正確估計值，以便盡可能地擬合原始資料。這是一個迭代過程。每次迭代，我們都會更接近最優結果。我嘗試用這張小圖和四五次迭代來說明這一點。當然，實際上我們需要進行 250 次迭代，並且需要對所有 64 個實驗重複這個過程。
對優化器是否真正找到了所有參數的良好估計值進行目視檢查至關重要。而這之所以可行，是因為我們需要找到合適的初始值。否則，我們會陷入局部最優解，或者演算法優化器根本無法收斂，這當然是個問題。為了找到合適的初始值，最好事先為演算法設定一些上下限，並且先分析色譜圖，以便對峰高、保留時間等參數進行大致的估計。目前，這確實是一個繁瑣且耗時的步驟，但 JMP 19 將實現自動化。
雖然這已經是一項繁重的工作，但我們的挑戰變得更加艱鉅，因為這64個實驗中有9個實驗達到了臨界失效點。這意味著對於某些實驗設計因素組合，我們兩個峰值的遷移時間異常長。由於方法會在記錄60分鐘後自動停止，因此我們未能獲得這9個實驗中關於這些峰值的任何數據。現在我們有兩個選擇：要麼將這些實驗視為徹底丟失，要麼使用JMP中已實現的技術，至少利用這些峰的部分資訊。
這種方法稱為資料刪失。例如，我們知道峰值的遷移時間至少在 60 分鐘後出現，而相關領域的專家至少可以確定峰值應該在 60 到 62 分鐘之間，因此我們可以利用這些資訊。同樣的方法也適用於其他峰值參數，例如峰高、峰寬等等。
我們如何在 JMP 中使用這些資訊？只需建立一個新列，分別命名為 lower 和 upper，用於存放所有參數。在本例中，我使用了最簡單的參數 M2，即第二個峰值的保留時間或遷移時間。這裡我們有 M2_lower 和 M2_upper。
對於所有獲得數據的實驗，我們可以直接將上下組分的保留時間設為相同值。第二次、第三次等實驗均如此。但對於所有未獲得遷移時間的峰值（即那些接近失效的實驗），我們使用該峰值的預期遷移時間的下限（例如實驗 1 的 60 分鐘）和上限（例如 62 分鐘）。其他峰值參數（例如 a2、d2 等）的處理方法相同。
下一步非常簡單。進入「擬合模型」平台，選擇「廣義迴歸」。輸入 M2_lower 和 M2_upper，當然，也要輸入所有 DOE 因子、因子組合、交互效應等等。點擊“運行”，JMP 會自動識別您使用了區間刪失數據，並詢問您是否同意。點擊“是”即可。這樣，您就可以利用所有資料的上限和下限資訊。這實際上比直接刪除資料要好得多，因為我們掌握了一些關於缺失資料的信息，並將其用於建模。
我們對所有其他參數（例如峰高 a2、非對稱參數 a2）都採用相同的方法，對第一個峰也採取相同的方法。接下來，在模型擬合和模型選擇之後（這裡我使用了廣義最小二乘法平台中的剪枝前向選擇方法），使用「儲存預測公式」按鈕儲存每個參數對應的列。
下一步其實很簡單。對每個參數（h1、t1、w1 等）重複這個過程。現在，我們只需將參數替換為對應的預測公式，即可重新建立色譜公式。
如果你還記得，我們一開始用的是針對峰值 1 和峰值 2 的複雜公式，現在我們要用預測公式取代掉這些參數。現在 h1 不再出現在預測公式中，而是出現在公式列中。取而代之的是 h1_upper 預測公式，這個過程會針對所有其他參數重複進行。由於這樣做會得到一個非常非常長的公式，所以在我的螢幕上顯示不全，但你可以想像最終的完整公式會是什麼樣子。
這就是結果。現在我們希望在 JMP Profiler 中以互動方式查看結果。下一步，您只需轉到“圖形分析器”，找到強度公式（也就是我們之前看到的重組公式）。點擊“展開中間公式”，輸入強度公式和 Y 軸預測公式，然後點擊“確定”。
我想在 JMP 中簡要地示範一下結果的樣子。這裡是 JMP 分析平台，您現在可以看到左側的緩衝液 pH 值、DOE 因子、緩衝液 SDS 濃度、DOE 因子，以及我們實際研究的所有 DOE 因子。
有趣的部分在右側，也就是電泳圖，橫座標是遷移時間，縱座標是強度。我已經稍微放大了一些，所以這裡只顯示了35-47分鐘的圖表。但這樣也能更好地觀察這兩個峰值現在分離得多麼好。現在我可以直接調整分析器和DOE因子，觀察色譜本身的變化。當然，改變最終濃度會導致峰值高度變化。
但是，透過改變分離電壓，這兩個峰的遷移時間也會改變。我可以改變毛細管溫度和SDS緩衝液來重複這個過程。有時仔細觀察，會發現兩個峰之間的分離度有所提高；而有時，就像這裡一樣，分離度卻大大降低，因為此時實際上已經無法分離了。但是，降低緩衝液的pH值可以顯著改善這兩個組分的分離度。
這是其中一部分。現在我們已經將 JMP 中的交互作用功能與合成色譜結合了。但我還想更進一步。讓我放大一下這裡選定設定下的電泳圖，並調整一下預測和信賴區間公式。我所做的就是用峰 1 和峰 2 的公式取代了置信區間和預測區間公式。現在，信賴區間公式只顯示峰 1 的成分。
我們把範圍稍微擴大一些。預測區間公式現在只顯示了第二個峰值分量。現在的情況很有意思。我們看到這兩個峰值甚至相互重疊。我們仍然可以看到各個峰值的位置，以及它們彼此之間的分離程度。
現在我可以更準確地定位到位於第二個峰值下方的第一個峰值分量。這當然有助於我了解分離效果如何，以及最終哪些設定是最佳的。
建模之後，務必將真實原始資料與模型預測結果進行對比，我在這裡用預測值與實測值對比圖的形式展示了這一點。紅色曲線代表真實數據，藍色曲線代表模型預測結果。我在這裡選取了幾個實驗，旨在向您展示模型的性能表現。
請不要感到困惑。我將從 Run 2 開始講解，因為 Run 1 是我們遇到的實驗臨界點，導致我們實際上沒有任何包含峰成分的數據，也無法與模型預測進行比較。這裡意義不大。但是，從 Run 2 到 Run 11 的所有其他實驗中，我們可以看到模型的表現相當不錯。有時保留時間會略有變化，但峰高通常擬合得很好。此外，峰寬也相當不錯。
在這裡，我們的基準模型存在一些小問題，但克里斯和他的團隊正在努力解決這個問題，並嘗試透過改進基線建模技術來提升模型效能。總的來說，如果我們觀察模型的表現，我認為它在真實數據和模型預測之間取得了非常好的吻合度。
在CGE範例中，我們最後要做的當然是找到最佳的DOE因子設置，以便盡可能地分離峰值。通常的做法是，您可以簡單地計算兩個峰值組分的分析解析度。只需將第二個峰的保留時間（在本例中為遷移時間）減去第一個峰的保留時間，然後除以第一個峰和第二個峰的半峰寬（即半峰高）。
我們已經建立了所有參數的模型，這些模型都是基於我們的DOE因子所建構的。我們只需要將這些資訊整合起來，就能創造一個所謂的輔助模型，其中解析度是我們所研究的DOE因子的函數。現在，我們可以看到色譜圖旁邊右上角的內容。在其上方第二行，我們可以看到解析度是DOE因子的函數。
現在我們只需利用 JMP 的功能，它允許我們優化設定。這意味著我只需告訴他將解析度優化到最大值，並設定一個邊界條件：領域專家不希望遷移時間超過 50 分鐘。因此，我們將 M2 預測公式（我們本來就有）的上限設為 50 分鐘。然後我們運行演算法來優化所有參數，並得到結果。這就是我們在這裡看到的。透過這些 DOE 因子設置，我們可以很好地分離這兩個峰值分量，從而解決 CGE 方法開發的問題。
這是一項了不起的成就。總而言之，所有重要的事實是，我們現在在 JMP 中實現了峰值檢測，並且未來我們還將直接在 JMP 中自動完成色譜圖的數值參數化最佳化。目前這仍然需要手動操作，如果您願意，可以自行完成，但目前來說這項工作仍然很繁瑣，不過這種情況將在 JMP 19 中得到改變。
我們現在擁有一個很棒的功能，可以直接對包含所有峰值的完整色譜進行建模，並將結果直接視覺化到 JMP 中。根據我的經驗，這對領域專家理解 DOE 的工作原理、如何優化方法非常有幫助。這項前沿技術真正彌合了統計學家與實驗室人員和分析化學家之間的鴻溝。
好了，我的演講就到此結束了，很高興各位聆聽了我的演講。非常感謝。
