Ciao a tutti. Mi chiamo Marco Kunzelmann e lavoro come statistico principale presso Boehringer Ingelheim. Stiamo collaborando attivamente con Chris Gotwalt di JMP su un argomento in cui vogliamo combinare i DOE da un lato con i dati cromatografici dall'altro. Sebbene si tratti ancora di un lavoro in corso, pensiamo che il progetto abbia già raggiunto una fase in cui possiamo mostrarvi i risultati attuali. Tenete presente che molti passaggi presenti nella presentazione vengono ancora eseguiti manualmente, ma saranno automatizzati nelle future versioni di JMP.
La motivazione alla base di questo progetto è che, naturalmente, l'aumento dell'efficienza e la riduzione dei costi sono obiettivi fondamentali nel settore. Inoltre, negli ultimi anni, autorità e linee guida normative stanno spingendo sempre più avanti il tema della caratterizzazione e dell'indagine dello spazio di progettazione multivariato. Solo per citare un paio di esempi, ecco l'ICH Q8 e l'ICH Q14, recentemente pubblicato. Un modo consolidato per soddisfare questi requisiti delle autorità è la progettazione di esperimenti, o in breve, DOE.
Al più tardi con l'entrata in vigore dell'ICH Q14, pubblicato a giugno 2024, la modellazione statistica tramite DOE ha trovato spazio anche nello sviluppo analitico. Tuttavia, i cromatogrammi sono solitamente molto complessi e, in genere, chi desidera integrare lo sviluppo di metodi analitici estrae le caratteristiche dai cromatogrammi e le modella in funzione dei parametri di input dell'UE.
Cosa intendo con questo? Beh, l'estrazione delle caratteristiche è costituita da informazioni provenienti dal cromatogramma, come l'altezza del picco o il tempo di ritenzione del picco o persino la risoluzione analitica, che descrive quanto bene due o tre picchi siano separati l'uno dall'altro. Il problema con l'estrazione delle caratteristiche è che è un lavoro noioso perché in primo luogo è necessario un software per il rilevamento dei picchi. Poi, di solito, è necessaria l'integrazione dei picchi, e poi è necessario esportare tutte queste informazioni dal software analitico verso JMP, dove è possibile eseguire in seguito la parte di modellazione con il consueto metodo DOE.
Oltre a ciò, è necessario un modello per ciascuna di queste caratteristiche che viene estratto. Nel mio esempio precedente, in cui abbiamo visto nove picchi diversi, abbiamo bisogno di nove modelli solo per descrivere il tempo di ritenzione del picco. Servono poi nove modelli per descrivere la risoluzione, l'altezza del picco e così via. Potete immaginare che quando si vogliono ottimizzare tutti questi singoli modelli, l'interpretabilità alla fine sia davvero difficile perché si ottengono solo informazioni su tempi di ritenzione, altezza del picco, risoluzione e così via, ma non si ottiene mai un quadro completo. Non si vede mai il cromatogramma completo.
Questo è fondamentalmente l'obiettivo che volevamo raggiungere con questo progetto. La nostra idea era di avere un rilevamento dei picchi immediato in JMP, all'interno dell'esploratore dei dati funzionali. Poi volevamo avere una parametrizzazione numerica del cromatogramma completo, anche questa, ovviamente, all'interno di JMP. Una modellazione diretta avrebbe dovuto essere applicata al cromatogramma completo, inclusi tutti i picchi. Infine, e naturalmente, volevamo sfruttare la capacità interattiva di JMP. Ciò significava che volevamo avere un cromatogramma interattivo immediato nel profiler, dove fosse possibile lavorare e vedere come le diverse impostazioni del fattore DOE influenzassero il cromatogramma stesso.
Chris e io abbiamo pensato di illustrare al meglio il nostro processo mostrandovi due diversi esempi di set di dati con cui abbiamo lavorato nell'ultimo anno. Iniziamo con il primo esempio, con dati gascromatografici. I dati gascromatografici, e in breve la GC, sono un metodo analitico ampiamente utilizzato. In parole povere, si evapora il campione e, nella fase gassosa, si verifica un'interazione tra la fase gassosa mobile e la fase stazionaria, che si trova sul capillare stesso. Questi effetti di interazione sono diversi per ciascuno dei componenti del campione analitico. In base a ciò, è possibile separare questi diversi componenti l'uno dall'altro e rilevarli infine tramite un rivelatore.
In questo esempio, abbiamo utilizzato uno strumento GC diverso, chiamato GC iperveloce, e il principio di separazione è lo stesso del GC tradizionale. Tuttavia, la differenza principale è che la velocità di riscaldamento è notevolmente aumentata e, grazie a ciò, abbiamo potuto creare cromatogrammi con un tempo completo di 1 minuto e inferiore. Questo è, ovviamente, molto vantaggioso per questo progetto, perché abbiamo potuto facilmente eseguire numerose impostazioni diverse senza perdere molto tempo.
Il nostro esperimento DOE si basava su quattro diversi fattori DOE. Ciò significa che avevamo una temperatura iniziale, una temperatura finale, il tempo di mantenimento e il tempo delta. Ho pensato di non mostrare questo tipo di informazioni solo nella tabella dei dati, ma di mostrarvele anche in un modulo per il profilo di temperatura qui a destra. Questa era la temperatura iniziale che avevamo. Abbiamo variato questa temperatura iniziale e l'abbiamo mantenuta su diversi tempi di mantenimento.
L'applicazione di diversi delta-t ci ha permesso di applicare diverse velocità di riscaldamento in combinazione anche con diverse temperature finali, ovvero la T₂. Dato che potevamo facilmente eseguire molti esperimenti su questo GC iperveloce, abbiamo deciso di utilizzare un disegno fattoriale completo con 81 esperimenti e sette analisi dei punti centrali per ottenere davvero tutte le informazioni possibili da quel sistema.
Per questo motivo, abbiamo studiato qui al DOE l'impatto dei quattro fattori DOE su nove picchi diversi nel cromatogramma. Qui in basso, vediamo un esempio del cromatogramma GC, in cui vediamo i nove diversi picchi individuali sotto forma di dati grezzi. Potete immaginare che alla fine otteniamo questo cromatogramma per tutti gli 88 esperimenti DOE.
Questa è fondamentalmente la parte in cui passo la parola a Chris, che vi mostrerà più nel dettaglio come ha estratto le informazioni dai cromatogrammi per creare i cromatogrammi sintetici finali. Per favore, Chris.
Grazie, Marco. Ecco la rappresentazione visiva definitiva del cromatogramma sintetico o predetto in un profiler, insieme ai quattro fattori DOE. Il cromatogramma sintetico è sulla sinistra, su sfondo giallo. Ci sono nove picchi di interesse specifici che dovevamo modellare.
L'approccio che illustrerò crea una visualizzazione di facile comprensione con controlli di profilazione, in modo che il professionista possa impostare il fattore DOE che fornisce il cromatogramma migliore. In questo caso, quello con i picchi meglio separati o altamente risolti. Si può passare da questa impostazione al centro dello spazio di progettazione, che presenta diversi picchi raggruppati insieme, a queste impostazioni, che hanno ottenuto la migliore separazione che siamo riusciti a trovare in questo studio.
Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo dovuto superare diverse sfide. Innanzitutto, abbiamo dovuto rimuovere il picco del solvente non interessante e la corsa di base cieca. Da lì, abbiamo utilizzato le funzionalità di modellazione dei picchi nell'esploratore dei dati funzionali di JMP Pro 18 per identificare ed etichettare i picchi. Abbiamo estratto le altezze dei picchi, le larghezze a mezza altezza e i tempi di eluizione per ciascuno dei picchi di tutti i cromatogrammi. Quindi li abbiamo modellati utilizzando Genreg e abbiamo assemblato le formule di predizione risultanti in una formula complessiva del cromatogramma sintetico.
Quando abbiamo iniziato a farlo l'anno scorso, richiedeva molto lavoro manuale. Ryan Parker e Clay Barker hanno lavorato duramente per semplificare il processo in JMP Pro 18. Come vedrete nella mia demo, ci sono ancora molti passaggi da fare, ma il processo è passato da diversi giorni di lavoro manuale a circa un'ora, e ci impegniamo a semplificarlo ulteriormente nelle prossime versioni di JMP Pro.
Iniziamo con l'analisi FDE nel modo consueto. Un passaggio preliminare necessario era l'utilizzo di Tabulate per calcolare i tempi di inizio e fine originali per ogni lotto. Questo è necessario per disallineare i dati e ridimensionare il modello per l'analisi cieca, in modo da poterlo sottrarre da ciascun cromatogramma. Qui vediamo i cromatogrammi grezzi. Vogliamo rimuovere il picco del solvente che domina l'immagine. Per farlo, utilizziamo Align Maximum.
Ora possiamo trovare il tempo allineato successivo al picco del solvente, ma precedente al primo picco di interesse. Lo facciamo utilizzando lo strumento mirino e scopriamo che 0,26 è il tempo tra tutti i picchi del solvente e il primo picco di interesse. Filtriamo tutte le osservazioni prima di 0,26. Ora abbiamo solo i picchi di interesse nei dati e li salveremo come nuovo dataset in modo da sapere con cosa stiamo lavorando.
Ora, c'era una corsa cieca di base che era stata eseguita senza alcun prodotto. Vogliamo rimuovere questo segnale dai dati poiché contamina il nostro modello e altera i nostri risultati. Qui ho adattato solo la corsa cieca con una p-spline e ho salvato i riepiloghi. Poi ho copiato la formula nei dati rimuovendo il picco del solvente. Ho quindi allineato manualmente i cromatogrammi con la formula della corsa cieca e ho sottratto il run-off cieco quando ho creato la colonna dell'intensità alla formula cieca, che era tornata nella scala temporale assoluta.
Ora che i dati del cromatogramma sono nella forma desiderata, possiamo tornare a FDE. Utilizzeremo la nuova funzionalità di individuazione dei picchi di JMP Pro 18. La prima cosa che facciamo è eseguire il rilevamento automatico dei picchi. Questo, ovviamente, individua molti picchi nei dati e fornisce intervalli e posizioni centrali per ogni picco candidato trovato. Possiamo fare clic sulla scheda Riepiloghi per visualizzare le metriche di picco derivate più importanti.
Qui potete vedere le AUC, le risoluzioni, le altezze dei picchi e altre misure di riepilogo dei picchi derivate. Notiamo un problema perché molti cromatogrammi presentano più di nove picchi nei riepiloghi, ma sappiamo che in realtà ci sono solo nove picchi per spettro.
Torniamo quindi all'interfaccia utente di ricerca dei picchi, dove analizziamo gli spettri con più di nove picchi. Facendo una piccola ricerca, scopriamo che tutti i presunti picchi con altezze inferiori a 500 sono dovuti solo a piccole anomalie nei dati. Un esempio di uno di questi picchi spuri è evidenziato qui. Possiamo utilizzare lo strumento di rimozione automatica dei picchi per eliminare questi picchi cliccandoci sopra e inserendo 500 come limite inferiore per quella che considereremo un'altezza di picco valida.
Dopo aver rimosso i picchi inferiori a 500, abbiamo ora un'estrazione pulita e corretta delle statistiche di riepilogo dei picchi, necessarie per creare il nostro modello RAM cromatico sintetico. Salviamo questi riepiloghi in una nuova tabella, quindi eseguiamo la regressione generalizzata e adattiamo i modelli di superficie di risposta quadratica log-normale a tutte le metriche estratte. Utilizziamo il log-normale perché tutte le metriche sono strettamente positive.
In pratica, dobbiamo valutare i nostri modelli per assicurarci che si adattino bene, proprio come qualsiasi altro esercizio di modellazione. Salterò questo passaggio, ma una volta soddisfatti, possiamo tenere premuto il tasto Ctrl e salvare l'opzione "Save the prediction forms" per salvare le formule di previsione per tutte le risposte in un colpo solo. Ora abbiamo modelli che utilizzano i fattori DOE per prevedere ogni caratteristica dei cromatogrammi, e ho utilizzato una colonna di formule per assemblare una formula di previsione che calcola il cromatogramma sintetico con una colonna di formule che combina i singoli modelli DOE per la posizione, la mezza altezza, la larghezza e l'altezza di ogni picco.
Per verificare il nostro modello, osserviamo i grafici sovrapposti dei cromatogrammi sintetici, disegnati in rosso, e dei cromatogrammi reali, disegnati in blu. Nel complesso, vediamo che il modello non è perfetto, ma sembra catturare abbastanza bene le caratteristiche principali degli spettri reali. Da qui, utilizziamo semplicemente il profiler per trovare impostazioni di fattore che migliorino la risoluzione complessiva dei picchi, partendo dal centro del disegno fino alle impostazioni che ci forniscono un metodo analitico che separerà i componenti del processo di produzione nel modo migliore possibile per tutti i picchi.
Ora abbiamo una visualizzazione semplice e intuitiva che mostra come impostare il processo in modo che sia facile da comunicare a chi lavora nello sviluppo di metodi analitici. Lascio la parola a Marco.
Grazie mille, Chris. Chris ci ha mostrato come i cromatogrammi in silice funzionano con i dati GC. Abbiamo già applicato questa metodologia a un altro esempio, sotto forma di elettroforesi capillare su gel. La CGE, in breve, è solo un altro strumento analitico. Tuttavia, la tecnica di separazione è leggermente diversa, il che porta anche a diverse forme dei picchi, ma ne parleremo tra un attimo. La motivazione principale alla base dello sviluppo del metodo CGE era la necessità di separare due picchi diversi l'uno dall'altro. Francamente, qui il Picco 1 dal Picco 2.
Come potete vedere, questo è piuttosto impegnativo perché il Picco 1 è molto piccolo rispetto al Picco 2, e questi due picchi si sovrappongono notevolmente. Cerchiamo di trovare nuovamente le impostazioni ottimali per separare queste due componenti l'una dall'altra. Questa volta abbiamo avuto cinque diversi fattori UE con principalmente tre livelli diversi, ad eccezione della concentrazione finale. Questo è stato studiato su quattro livelli diversi.
Di solito, se si volessero studiare tutte le combinazioni, sarebbero necessari 324 esperimenti in un disegno fattoriale completo, e questo è, ovviamente, il motivo principale per cui alla fine abbiamo utilizzato un disegno I-ottimale, e in questo modo abbiamo potuto risparmiare circa l'80% degli esperimenti, creando un disegno di soli 64 esperimenti. Questo disegno era in grado non solo di risolvere gli effetti principali, l'interazione a 2 fattori e gli effetti quadratici, ma potevamo anche risolvere gli effetti di interazione a 3, 4 e 5 fattori, e anche gli effetti quadratici in combinazione con gli effetti principali in combinazione con essi esattamente.
Perché lo abbiamo fatto? Beh, nell'esempio del GC, abbiamo effettivamente studiato come molti fattori analitici del DOE interagiscano tra loro, e volevamo indagare più a fondo e comprendere meglio quanto complessi debbano essere i modelli per avere una buona precisione e accuratezza, ovviamente.
Di solito, come abbiamo già accennato, si potrebbe modellare anche il cromatogramma completo in modo da estrarne fin dall'inizio le caratteristiche. Tuttavia, in questa situazione, ciò non era affatto possibile, perché, a causa dell'estrema sovrapposizione dei due picchi, il software analitico non era più in grado di calcolare la risoluzione analitica per queste due componenti. Questo è un altro motivo per cui abbiamo dovuto trovare un altro modo per descrivere matematicamente il cromatogramma.
Cosa abbiamo fatto qui? Beh, come ha già spiegato Chris, possiamo descrivere, ovviamente, un picco sotto forma di funzione matematica. L'altezza del picco, il tempo di ritenzione, l'ampiezza del picco e così via. Il picco simmetrico può essere descritto sotto forma di questa formula qui a sinistra.
Nella CGE, purtroppo, le cose sono più complesse perché la CGE porta sempre a picchi asimmetrici. Anche qui si nota che la seconda componente, il secondo picco, non è affatto simmetrico. Dobbiamo trovare un'altra formula che possa descrivere l'asimmetria di questo picco.
Ciò che abbiamo trovato in letteratura è questa bella formula. Il parametro a è il parametro che ci permette di descrivere l'asimmetria del picco. Lo si può vedere molto bene qui a sinistra e a destra, dove si vede che un valore pari a 0 porta comunque a un picco asimmetrico. Più alto è il valore di a, più asimmetrico è anche il picco. Gli altri parametri qui non sono altro che il tempo di ritenzione del picco, l'altezza del picco e così via. Questo è sostanzialmente lo stesso di prima. Sembra solo un po' più complesso.
Come possiamo trasferire questa formula in JMP? Quello che abbiamo fatto è stato creare una nuova colonna formula in JMP. Per farlo, basta andare su Colonne, Formula e poi nell'Editor di formule. Andare su Parametri in basso a sinistra, cliccare su Nuovo parametro e aggiungere tutti i parametri necessari.
In questo modo, è possibile creare le due formule di picco come abbiamo fatto qui all'interno dei rettangoli verdi. Abbiamo la formula per il Picco 1, dove ipotizziamo un picco simmetrico, e abbiamo la formula più complessa per il secondo picco, dove vogliamo anche descrivere la parte asimmetrica del picco. Potete anche vedere tutti i parametri che abbiamo inserito qui: h1, w1, t1 e m2, d2, a2 e H2 per il secondo picco. Quello che dobbiamo fare ora, nel passaggio successivo, è trovare i valori corretti per tutti questi parametri.
Per farlo, prima di tutto, inizia a caricare tutti i dati grezzi dal tuo strumento analitico in JMP. Qui abbiamo una colonna per il tempo di migrazione e un'altra per l'intensità. Separiamo tutti i singoli elettroferogrammi con una terza colonna, chiamata semplicemente Run, che rappresenta il numero di esecuzione DOE.
Successivamente, si può andare su Analizza, Modellazione Specializzata nella piattaforma Non Lineare. Quello che facciamo è semplicemente inserire la risposta Y, l'intensità e, per la formula predittiva, utilizzare la nostra colonna formula appena creata, ovviamente, e separare tutto per colonna, che è la colonna Esegui che ho mostrato qui e include tutti i singoli esperimenti DOE.
Successivamente, cliccate su OK e vi ritroverete con una vista come quella che vediamo qui. Qui abbiamo il secondo esperimento del DOE, e ho ingrandito leggermente l'immagine in modo da vedere semplicemente i dati da 26 a 28 minuti. I punti sono in realtà i dati reali, grezzi. La linea continua è la funzione parametrica con le stime dei parametri mostrate qui sotto. Come potete vedere, i valori iniziali non sono, ovviamente, quelli ottimali.
Ciò che dobbiamo fare nel passaggio successivo è eseguire JMP per trovare le stime corrette per tutti questi singoli parametri, al fine di adattare al meglio i dati grezzi. Questo è un passaggio iterativo. Ogni volta che eseguiamo un'iterazione, ci avviciniamo sempre di più ai risultati ottimali. Cerco di illustrarlo qui in questo piccolo diagramma e con solo quattro o cinque iterazioni. In realtà, ovviamente, abbiamo 250 iterazioni e dobbiamo ripetere questo processo per tutti i 64 esperimenti.
È estremamente importante verificare visivamente se l'ottimizzatore ha effettivamente trovato stime valide per tutti i parametri. Che ciò sia possibile è necessario trovare buoni valori iniziali. Altrimenti, ci imbattiamo in un ottimo locale o l'ottimizzatore dell'algoritmo non converge affatto, il che rappresenta ovviamente un problema. Per trovare buoni valori iniziali, ha senso fornire all'algoritmo già dei limiti inferiori e superiori e anche analizzare i cromatogrammi in primo luogo per ottenere buone stime sull'altezza del picco, il tempo di ritenzione e così via, almeno approssimativamente. Al momento, questo è un passaggio davvero noioso e richiede molto lavoro, ma sarà automatizzato in JMP 19.
Sebbene questo fosse già un lavoro notevole, la nostra sfida è diventata ancora più grande perché nove di questi 64 esperimenti hanno portato a un limite di errore. Ciò significa che il tempo di migrazione dei nostri due picchi è stato inaspettatamente lungo per alcune combinazioni di fattori DOE. Poiché il metodo si interrompe automaticamente dopo 60 minuti dalla registrazione, non abbiamo ricevuto alcun dato su questi picchi in nove degli esperimenti. Ora abbiamo due opzioni. O consideriamo questi esperimenti semplicemente persi, oppure utilizziamo una tecnica già implementata in JMP per utilizzare almeno alcune delle informazioni provenienti da questo picco.
La metodologia si chiama censura dei dati. Poiché sappiamo, ad esempio, per quanto riguarda il tempo di migrazione dei picchi, che questi si verificano almeno dopo 60 minuti e gli esperti in materia potrebbero chiedere almeno dire che dovrebbero essere compresi tra 60 e 62 minuti, possiamo utilizzare questa informazione, e la stessa cosa possiamo fare anche per gli altri parametri dei picchi, come l'altezza, la larghezza e così via.
Come abbiamo utilizzato queste informazioni in JMP? È sufficiente creare una nuova colonna, denominata "lower" e "upper" per tutti i parametri. In questo esempio, ho utilizzato il parametro più semplice, M2, ovvero il tempo di ritenzione o di migrazione per il secondo picco. Qui abbiamo M2_lower e M2_upper.
Per tutti gli esperimenti in cui riceviamo dati, possiamo semplicemente inserire lo stesso tempo di ritenzione per la componente inferiore e superiore. Questo vale per la seconda, la terza esecuzione e così via. Ma per tutti i picchi in cui non abbiamo ricevuto alcun tempo di migrazione, queste esecuzioni al limite del fallimento, utilizziamo il tempo di migrazione previsto più basso per quel picco, quindi per l'Esperimento 1, 60 minuti, e il tempo di migrazione previsto più alto, che è 62. Procediamo con gli altri parametri di picco come a2, d2 e così via allo stesso modo.
Il passaggio successivo è piuttosto semplice. Si accede alla piattaforma Fit Model, alla Regressione Generalizzata. Si inseriscono M2_lower e M2_upper e, naturalmente, tutti i fattori DOE e le combinazioni di fattori, gli effetti di interazione e così via. Basta cliccare su Esegui, e JMP riconosce automaticamente che sono stati utilizzati dati con censura a intervalli e chiede se sono corretti o meno. Basta cliccare su Sì. In questo modo, è possibile utilizzare le informazioni con il limite superiore e inferiore per tutti i dati. Questo è in realtà molto meglio della semplice rimozione dei dati, perché abbiamo alcune informazioni sui dati persi e le utilizziamo qui per la modellazione.
Procediamo allo stesso modo per tutti gli altri parametri, come a2 (altezza del picco), a2 (parametro asimmetrico), e lo stesso vale per il primo picco. Ora, nel passaggio successivo, dopo l'adattamento e la selezione del modello (qui ho utilizzato il metodo Pruned Forward Selection nella piattaforma Generalized Least Square), si salva la colonna per ciascuno dei singoli parametri con la Save Prediction Formula.
Il passaggio successivo è in realtà piuttosto semplice. Si ripete questo processo per ogni parametro: h1, t1, w1, ecc. Ora ricomponiamo la formula del cromatogramma semplicemente sostituendo i parametri con le corrispondenti formule di predizione.
Se ricordate, all'inizio avevamo questa formula complessa per il Picco 1 e per il Picco 2, e ora stiamo sostituendo i singoli parametri con le formule di previsione. Ora h1 non è più presente nella formula di previsione, bensì nella colonna della formula. Al suo posto, abbiamo h1_upper Prediction Formula, e questo processo viene ripetuto per tutti gli altri parametri. Dato che in questo modo otteniamo una formula lunghissima, non sembra adatta al mio schermo, ma potete immaginare come continuerà per la formula completa alla fine.
Questo è il risultato. Ora vogliamo visualizzarlo in modo interattivo nel JMP Profiler. Il passaggio successivo è semplicemente andare al Graph Profiler e prendere la formula di Intensità, che ora è la formula riassemblata che abbiamo visto qui. Fare clic su "Espandi formule intermedie", inserire qui la formula di intensità, la formula di previsione Y e premere semplicemente "OK".
Vorrei mostrarvi una breve dimostrazione di come appare il risultato in JMP. Qui abbiamo la piattaforma di profili JMP e, a sinistra, potete vedere il pH del tampone, il fattore DOE, la SDS del tampone, il fattore DOE, tutti i fattori DOE che abbiamo effettivamente analizzato.
La parte interessante è qui a destra, l'elettroferogramma, dove sull'asse x abbiamo il tempo di migrazione e sull'asse y l'intensità. Ho già ingrandito un po', e questo è principalmente il motivo per cui abbiamo qui una vista di soli 35-47 minuti. Ma è molto meglio vedere anche quanto bene questi due picchi siano separati l'uno dall'altro. Ora ho la possibilità di modificare direttamente il profiler, i fattori DOE e vedere cosa succede sul cromatogramma stesso. Modificando la concentrazione finale, l'altezza del picco cambia, ovviamente.
Ma modificando la tensione di separazione, cambia anche il tempo di migrazione di questi due picchi. Posso ripetere questo processo con la temperatura del capillare e anche con il tampone SDS. A volte, se si osserva attentamente, la separazione tra i due picchi è migliore, a volte, come in questo caso, è molto peggiore perché ora non è più possibile alcuna separazione. Ma riducendo il pH del tampone si ottiene una separazione molto migliore di questi due componenti.
Questa è una parte. Ora abbiamo l'interattività in JMP combinata con il nostro cromatogramma sintetico. Ma volevo fare un ulteriore passo avanti. Ingrandisco un po' l'elettroferogramma con le impostazioni selezionate e ho modificato la formula di previsione e intervallo di confidenza. Ho sostituito la formula di confidenza e intervallo di previsione con la formula del Picco 1 e del Picco 2. La formula dell'intervallo di confidenza ora mostra solo la componente del Picco 1.
Ingrandiamo un po' la situazione. La formula dell'intervallo di previsione ci mostra ora semplicemente la seconda componente del picco. Ciò che è possibile ora è piuttosto interessante. Vediamo che anche questi due picchi si sovrappongono. Vediamo ancora dove si trova il singolo picco e quanto sono separati l'uno dall'altro.
Ora posso davvero individuare dove si trova il componente Picco 1 sotto il secondo componente. Questo, ovviamente, mi aiuta molto a capire quanto bene viene eseguita la separazione e quali impostazioni sono alla fine le migliori.
Una cosa che dovresti sempre fare dopo la modellazione è abbinare i dati grezzi reali con la previsione del modello, ed è quello che ho fatto qui sotto forma di grafici di previsione rispetto alla misura. In rosso, vediamo i dati reali e in blu, potete vedere la previsione del modello. Ho selezionato un paio di esperimenti qui, solo per mostrarvi l'efficacia del modello.
Non confondetevi. Inizierò con l'Esecuzione 2 perché l'Esecuzione 1 è stato uno degli esperimenti in cui abbiamo avuto un limite di errore e, per questo motivo, non abbiamo dati con componenti di picco e non possiamo confrontare nulla con una previsione del modello. Non è molto utile in questo caso. Ma per tutti gli altri esperimenti qui, dall'Esecuzione 2 all'Esecuzione 11, possiamo vedere che il modello funziona piuttosto bene. A volte abbiamo una piccola variazione nel tempo di ritenzione, ma l'altezza del picco è solitamente adattata abbastanza bene. Anche l'ampiezza del picco è piuttosto buona.
Qui abbiamo un piccolo problema con la baseline, ma è un aspetto che Chris e il suo team stanno affrontando e cercando di migliorare con le tecniche di modellazione della baseline. Nel complesso, se osserviamo le prestazioni del modello, direi che abbiamo una previsione davvero buona tra dati reali e modello.
Un'ultima parte che volevamo fare ora nell'esempio CGE era, ovviamente, trovare le migliori impostazioni del fattore DOE per separare i picchi nel modo migliore possibile. Quello che di solito si fa è semplicemente calcolare la risoluzione analitica per due componenti del picco. Basta sottrarre il tempo di ritenzione o, in quel caso, il tempo di migrazione del secondo picco meno il primo picco e dividerlo per la larghezza del picco a metà picco, la larghezza a metà massimo del primo e del secondo picco.
Abbiamo già tutti i modelli per questi parametri, modellati in funzione dei nostri fattori DOE. Dobbiamo semplicemente collegare e riprodurre queste informazioni, e questo ci permette di creare un cosiddetto modello di supporto con la risoluzione in funzione dei fattori DOE da noi studiati. Qui possiamo vedere, accanto al nostro cromatogramma, in alto a destra. Possiamo vedere anche nella seconda riga la risoluzione in funzione dei fattori DOE.
Ora utilizziamo semplicemente le funzionalità di JMP, che ci permettono di ottimizzare le impostazioni. Significa che gli dico semplicemente di ottimizzare la risoluzione al massimo e, come condizioni al contorno, gli esperti in materia non volevano tempi di migrazione superiori o superiori a 50 minuti. Quindi impostiamo la formula di previsione M2, che comunque abbiamo, a un livello massimo di 50 minuti, ovviamente. Quindi eseguiamo l'algoritmo per ottimizzare tutto e otteniamo semplicemente i risultati. Questo è ciò che vediamo qui. Con queste impostazioni del fattore DOE, otteniamo una buona separazione tra queste due componenti di picco e potremmo risolvere il problema dello sviluppo del metodo CGE.
È stato un grande risultato. Per riassumere, il punto importante è che ora disponiamo di un sistema di rilevamento dei picchi all'interno di JMP e, in futuro, automatizzeremo anche questa ottimizzazione della parametrizzazione numerica dei cromatogrammi direttamente in JMP. Al momento è ancora un'operazione manuale, che ognuno può fare da solo se lo desidera, ma al momento è ancora un lavoro noioso, ma questo cambierà in JMP 19.
Ora disponiamo di una funzionalità interessante: possiamo modellare direttamente il cromatogramma completo, inclusi tutti i picchi, e visualizzare i risultati direttamente nel profilo JMP. Dalla mia esperienza, questo è stato di grande beneficio per gli esperti in materia, che hanno potuto comprendere come funzionano i DOE e come ottimizzare la loro metodologia. Si tratta di una tecnologia davvero all'avanguardia che colma il divario tra gli statistici, da un lato, e il personale di laboratorio e i chimici analitici, dall'altro.
Con questo vorrei concludere, e sono davvero felice che abbiate ascoltato questa presentazione. Grazie mille.
