Hallo zusammen. Mein Name ist Marco Kunzelmann, und ich arbeite als leitender Statistiker bei Boehringer Ingelheim. Wir kooperieren eng mit Chris Gotwalt von JMP an einem Projekt, bei dem wir Versuchsplanungen (DOEs) mit chromatographischen Daten kombinieren möchten. Obwohl das Projekt noch läuft, können wir Ihnen bereits erste Ergebnisse präsentieren. Bitte beachten Sie, dass viele der hier gezeigten Schritte noch manuell durchgeführt werden, in zukünftigen JMP-Versionen aber automatisiert werden.
Die Motivation für dieses Projekt lag darin, dass Effizienzsteigerung und Kostensenkung grundlegende Ziele der Industrie sind. Zudem treiben Behörden und regulatorische Richtlinien die Charakterisierung und Untersuchung multivariater Designräume in den letzten Jahren immer weiter voran. Beispiele hierfür sind ICH Q8 und die kürzlich veröffentlichte ICH Q14. Eine etablierte Methode zur Erfüllung dieser behördlichen Anforderungen ist die Versuchsplanung (Design of Experiments, kurz DOE).
Spätestens mit dem Inkrafttreten der ICH-Q14-Richtlinie im Juni 2024 fand die statistische Modellierung mittels Versuchsplanung (DOEs) Eingang in die analytische Entwicklung. Chromatogramme sind jedoch in der Regel sehr komplex, und typischerweise extrahieren Anwender, die analytische Methoden entwickeln möchten, Merkmale aus den Chromatogrammen und modellieren diese als Funktion der Eingangsparameter der Versuchsumgebung.
Was meine ich damit? Nun, die Merkmalsextraktion umfasst Informationen aus dem Chromatogramm, wie die Peakhöhe, die Peakretentionszeit oder die analytische Auflösung, die beschreibt, wie gut zwei oder drei Peaks voneinander getrennt sind. Das Problem bei der Merkmalsextraktion ist, dass sie mühsam ist, da man zunächst eine Software zur Peakdetektion benötigt. Anschließend ist in der Regel die Peakintegration erforderlich, und schließlich müssen all diese Informationen aus der Analysesoftware nach JMP exportiert werden, wo man dann die Modellierung mit der üblichen DOE-Methode durchführen kann.
Darüber hinaus benötigen Sie für jedes dieser extrahierten Merkmale ein eigenes Modell. In meinem vorherigen Beispiel mit neun verschiedenen Peaks benötigen wir allein neun Modelle, um die Peak-Retentionszeit zu beschreiben. Weitere neun Modelle sind erforderlich, um die Auflösung, die Peak-Höhe usw. zu beschreiben. Stellen Sie sich vor: Wenn Sie all diese Einzelmodelle optimieren möchten, ist die Interpretierbarkeit letztendlich sehr schwierig, da Sie zwar Informationen über Retentionszeiten, Peak-Höhe, Auflösung usw. erhalten, aber nie ein vollständiges Bild. Sie sehen nie das komplette Chromatogramm.
Das war im Grunde das Ziel dieses Projekts. Unsere Idee war, direkt in JMP im Funktionsdaten-Explorer eine Peak-Detektion zu ermöglichen. Anschließend wollten wir, ebenfalls in JMP, eine numerische Parametrisierung des gesamten Chromatogramms vornehmen. Darauf aufbauend sollte ein direktes Modell des gesamten Chromatogramms inklusive aller Peaks angewendet werden. Schließlich wollten wir natürlich die interaktiven Funktionen von JMP nutzen. Das heißt, wir wollten direkt im Profiler ein interaktives Chromatogramm zur Verfügung haben, mit dem man direkt arbeiten und die Auswirkungen verschiedener DOE-Faktoreinstellungen auf das Chromatogramm beobachten kann.
Chris und ich dachten, wir könnten unseren Prozess am besten anhand zweier Beispiele von Datensätzen veranschaulichen, mit denen wir im letzten Jahr gearbeitet haben. Beginnen wir mit dem ersten Beispiel mit gaschromatographischen Daten. Die Gaschromatographie (GC) ist eine weit verbreitete Analysemethode. Vereinfacht gesagt, wird die Probe verdampft, und in der Gasphase findet eine Wechselwirkung zwischen der mobilen Gasphase und der stationären Phase in der Kapillare statt. Diese Wechselwirkungen sind für jede Komponente der Probe unterschiedlich. Dadurch lassen sich die verschiedenen Komponenten voneinander trennen und schließlich mit einem Detektor nachweisen.
In diesem Beispiel verwendeten wir ein anderes GC-Gerät, ein sogenanntes Hyperfast-GC. Das Trennprinzip ist jedoch dasselbe wie beim herkömmlichen GC. Der Hauptunterschied liegt in der enorm erhöhten Heizrate, wodurch wir Chromatogramme mit einer Laufzeit von unter einer Minute erstellen konnten. Dies ist für dieses Projekt natürlich äußerst vorteilhaft, da wir so problemlos viele verschiedene Einstellungen testen konnten, ohne viel Zeit zu verlieren.
Unser Versuchsdesign (DOE) basierte auf vier verschiedenen Faktoren: Starttemperatur, Endtemperatur, Haltezeit und Zeitdifferenz. Anstatt diese Informationen nur tabellarisch darzustellen, zeige ich sie Ihnen rechts auch als Temperaturprofil. Dies war die Anfangstemperatur. Wir variierten diese Anfangstemperatur und hielten sie über verschiedene Haltezeiten konstant.
Durch die Anwendung unterschiedlicher Delta-t-Werte konnten wir verschiedene Heizraten in Kombination mit unterschiedlichen Endtemperaturen (T₂) anwenden. Da wir mit diesem hyperschnellen GC problemlos eine Vielzahl von Experimenten durchführen konnten, entschieden wir uns für ein vollständig faktorielles Design mit 81 Experimenten und sieben Mittelpunktsläufen, um alle verfügbaren Informationen aus diesem System zu gewinnen.
Aus diesem Grund untersuchten wir hier im DOE den Einfluss der vier DOE-Faktoren auf neun verschiedene Peaks im Chromatogramm. Im unteren Teil sehen wir ein Beispiel eines GC-Chromatogramms, in dem die neun einzelnen Peakkomponenten als Rohdaten dargestellt sind. Dieses Chromatogramm erhalten wir letztendlich für alle 88 DOE-Experimente.
An dieser Stelle übergebe ich an Chris, der Ihnen nun detaillierter erklären wird, wie er die Informationen aus den Chromatogrammen extrahiert hat, um am Ende die synthetischen Chromatogramme zu erstellen. Bitte, Chris.
Danke, Marco. Hier ist die finale visuelle Darstellung des synthetischen bzw. vorhergesagten Chromatogramms im Profiler zusammen mit den vier DOE-Faktoren. Das synthetische Chromatogramm befindet sich links mit gelbem Hintergrund. Es gibt neun spezifische Peaks von Interesse, die wir modellieren mussten.
Der von mir vorgestellte Ansatz erzeugt eine leicht verständliche Visualisierung mit Profiler-Steuerelementen, sodass der Anwender die DOE-Faktoreinstellungen präzise anpassen kann, um das beste Chromatogramm zu erhalten – in diesem Fall dasjenige mit den am besten getrennten bzw. hochaufgelösten Peaks. Man kann von dieser Einstellung im Zentrum des Designraums, bei der mehrere Peaks eng beieinander liegen, zu den Einstellungen übergehen, die in dieser Studie die beste Trennung erzielten.
Dafür mussten wir einige Herausforderungen bewältigen. Zunächst entfernten wir den irrelevanten Lösungsmittelpeak und den Blindwertlauf. Anschließend nutzten wir die Peakmodellierungsfunktionen im Funktionsdaten-Explorer von JMP Pro 18, um die Peaks zu identifizieren und zu kennzeichnen. Wir extrahierten die Peakhöhen, Halbwertsbreiten und Elutionszeiten für jeden Peak aller Chromatogramme. Diese modellierten wir dann mit Genreg und fügten die resultierenden Vorhersageformeln zu einer Gesamtformel für ein synthetisches Chromatogramm zusammen.
Als wir letztes Jahr damit begannen, war das noch sehr aufwendig. Ryan Parker und Clay Barker haben viel Arbeit investiert, um den Prozess in JMP Pro 18 zu optimieren. Wie Sie in meiner Demo sehen werden, sind zwar immer noch einige Schritte nötig, aber der Prozess hat sich von mehreren Tagen manueller Arbeit auf etwa eine Stunde verkürzt. Wir arbeiten daran, den Prozess in zukünftigen JMP Pro-Versionen weiter zu optimieren.
Wir beginnen wie gewohnt mit der FDE-Analyse. Zuvor mussten wir mithilfe von „tabulate“ die ursprünglichen Start- und Stoppzeiten für jede Charge berechnen. Dies ist notwendig, um die Daten zu entzerren und das Modell für den Blindlauf zu skalieren, sodass dieser von jedem Chromatogramm subtrahiert werden kann. Hier sehen wir die Rohchromatogramme. Wir möchten den dominanten Lösungsmittelpeak entfernen. Dazu verwenden wir „Align Maximum“.
Nun können wir den Zeitpunkt bestimmen, der nach dem Lösungsmittelpeak, aber vor dem ersten interessierenden Peak liegt. Dazu verwenden wir das Fadenkreuz-Werkzeug und ermitteln, dass der zeitliche Abstand zwischen allen Lösungsmittelpeaks und dem ersten interessierenden Peak 0,26 beträgt. Wir filtern alle Messwerte vor 0,26 heraus. Nun enthalten die Daten nur noch die relevanten Peaks. Diese speichern wir als neuen Datensatz, um den Überblick zu behalten.
Es gab einen Blindlauf ohne Produktzugabe. Dieses Signal soll aus den Daten entfernt werden, da es unser Modell verfälscht und die Ergebnisse beeinflusst. Daher habe ich den Blindlauf mit einem P-Spline angepasst und die Zusammenfassungen gespeichert. Anschließend habe ich die Formel auf die Daten ohne Lösungsmittelpeak angewendet. Die Chromatogramme wurden dann manuell mit der Formel des Blindlaufs ausgerichtet und der Blindlauf subtrahiert, als ich die Spalte „Intensität für die verblindete Formel“ erstellte, die wieder auf der absoluten Zeitskala basierte.
Nachdem wir die Chromatogrammdaten im gewünschten Format erhalten haben, können wir zur FDE zurückkehren. Wir verwenden die neue Peak-Erkennungsfunktion in JMP Pro 18. Zunächst führen wir die automatische Peak-Erkennung durch. Diese findet zahlreiche Peaks in den Daten und gibt für jeden gefundenen Kandidaten Peak Bereiche und zentrale Positionen an. Über den Reiter „Zusammenfassungen“ können wir die wichtigsten abgeleiteten Peak-Metriken einsehen.
Hier sehen Sie die AUC-Werte, Auflösungen, Peakhöhen und weitere abgeleitete Peak-Kennzahlen. Uns fällt auf, dass viele Chromatogramme in den Zusammenfassungen mehr als neun Peaks aufweisen, obwohl wir wissen, dass jedes Spektrum tatsächlich nur neun Peaks enthält.
Wir kehren also zur Benutzeroberfläche für die Peak-Suche zurück und untersuchen die Spektren mit mehr als neun Peaks. Nach kurzer Recherche stellen wir fest, dass alle vermeintlichen Peaks mit einer Höhe unter 500 lediglich auf geringfügige Messfehler zurückzuführen sind. Ein Beispiel für einen dieser fehlerhaften Peaks ist hier hervorgehoben. Mithilfe des Werkzeugs zur automatischen Peak-Entfernung können wir diese Peaks beseitigen, indem wir darauf klicken und 500 als untere Grenze für eine gültige Peak-Höhe eingeben.
Nachdem wir die Peaks unter 500 entfernt haben, verfügen wir nun über eine saubere und korrekte Extraktion der Peak-Zusammenfassungsstatistiken, die wir für die Erstellung unseres synthetischen chromatischen RAM-Modells benötigen. Wir speichern diese Zusammenfassungen in einer neuen Tabelle und führen anschließend eine generalisierte Regression durch, indem wir logarithmisch-normale quadratische Antwortflächenmodelle an alle extrahierten Metriken anpassen. Wir verwenden die Log-Normalverteilung, da alle Metriken strikt positiv sind.
In der Praxis müssen wir unsere Modelle, wie bei jeder anderen Modellierungsübung auch, auf ihre Passgenauigkeit überprüfen. Ich werde diesen Schritt hier überspringen. Sobald wir zufrieden sind, können wir die Strg-Taste gedrückt halten und die Vorhersageformeln speichern, um die Formeln für alle Messwerte auf einmal zu sichern. Wir haben nun Modelle, die die DOE-Faktoren nutzen, um jedes Merkmal der Chromatogramme vorherzusagen. Mithilfe einer Formelspalte habe ich eine Vorhersageformel erstellt, die das synthetische Chromatogramm berechnet. Diese Formelspalte kombiniert die einzelnen DOE-Modelle für die Position, die halbe Höhe, die Breite und die Höhe jedes Peaks.
Zur Überprüfung unseres Modells betrachten wir überlagerte Darstellungen der synthetischen Chromatogramme (rot) und der tatsächlichen Chromatogramme (blau). Insgesamt zeigt sich, dass das Modell zwar nicht perfekt ist, aber die Hauptmerkmale der tatsächlichen Spektren recht gut erfasst. Anschließend nutzen wir den Profiler, um Faktoreinstellungen zu finden, die die Auflösung der Peaks verbessern. Wir gehen dabei vom Zentrum des Designs aus und optimieren die Einstellungen, um eine Analysemethode zu erhalten, die die Komponenten des Produktionsprozesses für alle Peaks bestmöglich trennt.
Wir haben nun eine einfache, leicht verständliche Visualisierung, die zeigt, wie der Prozess so eingerichtet wird, dass er sich leicht an Personen vermitteln lässt, die in der Entwicklung analytischer Methoden tätig sind. Ich übergebe das Wort wieder an Marco.
Vielen Dank, Chris. Chris hat uns gezeigt, wie In-Silikat-Chromatogramme mit GC-Daten funktionieren. Wir haben diese Methodik bereits an einem anderen Beispiel, der Kapillargelelektrophorese, angewendet. CGE ist im Grunde ein weiteres Analyseverfahren. Die Trenntechnik ist jedoch etwas anders, was auch zu unterschiedlichen Peakformen führt. Darauf kommen wir gleich zurück. Die Hauptmotivation für die Entwicklung der CGE-Methode war die Trennung zweier unterschiedlicher Peaks. Genauer gesagt, hier Peak 1 von Peak 2.
Sie sehen, dass dies eine ziemliche Herausforderung darstellt, da Peak 1 im Vergleich zu Peak 2 extrem klein ist und sich die beiden Peaks zudem stark überlappen. Wir versuchen hier erneut, optimale Einstellungen zu finden, um diese beiden Komponenten voneinander zu trennen. Diesmal hatten wir fünf verschiedene UE-Faktoren, hauptsächlich auf drei verschiedenen Stufen, mit Ausnahme der Endkonzentration. Diese wurde auf vier verschiedenen Stufen untersucht.
Um alle Kombinationen zu untersuchen, wären üblicherweise 324 Experimente in einem vollständigen faktoriellen Versuchsplan erforderlich. Aus diesem Grund haben wir letztendlich einen I-optimalen Versuchsplan verwendet und dadurch etwa 80 % der Experimente eingespart, da wir nur 64 Experimente benötigten. Dieser Versuchsplan ermöglichte es uns nicht nur, Haupteffekte, Zwei-Faktor-Wechselwirkungen und quadratische Effekte zu untersuchen, sondern auch Drei-, Vier- und Fünf-Faktor-Wechselwirkungen sowie quadratische Effekte in Kombination mit Haupteffekten.
Warum haben wir das getan? Nun, im GC-Beispiel haben wir festgestellt, dass viele analytische DOE-Faktoren miteinander interagieren, und wir wollten dies genauer untersuchen und ein besseres Verständnis dafür gewinnen, wie komplex Modelle letztendlich sein müssen, um eine gute Präzision und Genauigkeit zu erreichen.
Normalerweise könnte man, wie bereits erwähnt, das gesamte Chromatogramm so modellieren, dass sich die Merkmale direkt extrahieren lassen. Dies war hier jedoch nicht möglich, da sich die beiden Peaks extrem überlappen und die Analysesoftware daher die analytische Auflösung für diese beiden Komponenten nicht mehr berechnen konnte. Aus diesem Grund mussten wir eine andere Methode finden, um das Chromatogramm mathematisch zu beschreiben.
Was haben wir hier gemacht? Nun, wie Chris bereits erläutert hat, lässt sich ein Peak natürlich durch eine mathematische Funktion beschreiben. Die Peakhöhe, die Retentionszeit, die Peakbreite usw. Der symmetrische Peak kann durch die Formel auf der linken Seite beschrieben werden.
Im CGE ist die Sache leider komplexer, da CGE immer zu asymmetrischen Peaks führt. Das sieht man auch hier: Die zweite Komponente, der zweite Peak, ist alles andere als symmetrisch. Wir müssen eine andere Formel finden, die die Asymmetrie dieses Peaks beschreibt.
In der Literatur fanden wir diese praktische Formel. Der Parameter a beschreibt die Asymmetrie des Peaks. Das sieht man gut links und rechts: Selbst ein Wert von 0 führt zu einem asymmetrischen Peak. Je höher der Wert von a ist, desto asymmetrischer wird der Peak. Die anderen Parameter sind im Wesentlichen die Retentionszeit, die Peakhöhe usw. Das Prinzip ist dasselbe wie zuvor, nur etwas komplexer.
Wie können wir diese Formel nun in JMP übertragen? Dazu haben wir in JMP eine neue Formelspalte erstellt. Gehen Sie dazu einfach auf „Spalten“, dann auf „Formel“ und Sie gelangen zum Formeleditor. Klicken Sie dort unten links auf „Parameter“, dann auf „Neuer Parameter“ und fügen Sie alle benötigten Parameter hinzu.
Dabei können Sie, wie hier in den grünen Rechtecken dargestellt, die beiden Formeln für die Peaks erstellen. Wir haben die Formel für Peak 1, bei der wir einen symmetrischen Peak annehmen, und die komplexere Formel für den zweiten Peak, bei der wir auch den asymmetrischen Teil des Peaks beschreiben möchten. Sie sehen hier auch alle Parameter, die wir eingefügt haben: h1, w1, t1, m2, d2, a2 und H2 für den zweiten Peak. Im nächsten Schritt müssen wir nun die passenden Parameterwerte für all diese Parameter finden.
Laden Sie dazu zunächst alle Rohdaten Ihres Analysegeräts in JMP. Die Daten bestehen aus einer Spalte für die Migrationszeit und einer weiteren für die Intensität. Die einzelnen Elektropherogramme werden durch eine dritte Spalte getrennt, die einfach „Run“ heißt und die DOE-Run-Nummer enthält.
Anschließend können Sie in der nichtlinearen Plattform auf „Analysieren“ und dann auf „Spezialisierte Modellierung“ gehen. Dort geben wir einfach die Y-Antwort, die Intensität und für die Vorhersageformel unsere neu erstellte Formelspalte ein und trennen die Daten spaltenweise. In diesem Fall ist es die Spalte „Durchlauf“, die ich hier gezeigt habe und die alle einzelnen DOE-Experimente enthält.
Anschließend klicken Sie auf OK und erhalten eine Ansicht wie die hier gezeigte. Hier sehen wir das zweite DOE-Experiment. Ich habe etwas hineingezoomt, sodass nur die Daten von Minute 26 bis 28 sichtbar sind. Die Punkte stellen die tatsächlichen Rohdaten dar. Die durchgezogene Linie ist die parametrisierte Funktion mit den unten dargestellten Parameterschätzungen. Sie sehen, dass die anfänglichen Startwerte natürlich nicht optimal sind.
Im nächsten Schritt müssen wir JMP ausführen, um die optimalen Schätzwerte für alle einzelnen Parameter zu finden und die Rohdaten bestmöglich anzupassen. Dies ist ein iterativer Prozess. Mit jeder Iteration nähern wir uns den optimalen Ergebnissen. Ich versuche dies hier in einem kleinen Diagramm anhand von nur vier oder fünf Iterationen zu veranschaulichen. In Wirklichkeit führen wir natürlich 250 Iterationen durch und müssen diesen Prozess für alle 64 Experimente wiederholen.
Es ist von entscheidender Bedeutung, visuell zu überprüfen, ob der Optimierer tatsächlich gute Schätzwerte für alle Parameter gefunden hat. Dies ist nur möglich, wenn wir gute Startwerte finden. Andernfalls geraten wir in ein lokales Optimum oder der Algorithmus konvergiert überhaupt nicht, was hier natürlich problematisch ist. Um gute Startwerte zu finden, ist es sinnvoll, dem Algorithmus bereits untere und obere Schranken vorzugeben und die Chromatogramme zunächst zu untersuchen, um zumindest grobe Schätzwerte für die Peakhöhe, die Retentionszeit usw. zu erhalten. Dies ist momentan ein sehr mühsamer und aufwendiger Schritt, wird aber in JMP 19 automatisiert.
Obwohl dies bereits eine umfangreiche Arbeit darstellte, wurde unsere Herausforderung noch größer, da neun der 64 Experimente zu einem Abbruch führten. Das bedeutet, dass die Migrationszeit unserer beiden Peaks für einige DOE-Faktorkombinationen unerwartet lang war. Da die Methode die Aufzeichnung nach 60 Minuten automatisch beendet, erhielten wir in neun der Experimente keine Daten zu diesen Peaks. Nun stehen wir vor zwei Möglichkeiten: Entweder wir betrachten diese Experimente als verloren, oder wir nutzen eine in JMP bereits implementierte Technik, um zumindest einen Teil der Informationen dieses Peaks zu verwenden.
Die Methodik wird als Datenzensur bezeichnet. Da wir beispielsweise für die Migrationszeit der Peaks wissen, dass diese mindestens nach 60 Minuten auftreten und Fachexperten zumindest angeben könnten, dass sie zwischen 60 und 62 Minuten liegen sollten, können wir diese Information nutzen. Dasselbe gilt auch für andere Peakparameter wie Peakhöhe, Peakbreite usw.
Wie haben wir diese Informationen in JMP verwendet? Man erstellt einfach eine neue Spalte namens „lower“ und „upper“ für alle Parameter. In diesem Beispiel habe ich den einfachsten Parameter M2 verwendet, also die Retentionszeit bzw. Migrationszeit des zweiten Peaks. Wir haben hier M2_lower und M2_upper.
Bei allen Experimenten, für die wir Daten erhalten, können wir einfach dieselbe Retentionszeit für die untere und obere Komponente einsetzen. Dies gilt für den zweiten, dritten Lauf usw. Bei allen Peaks, für die wir keine Migrationszeit erhalten haben (diese Läufe am Rande des Messfehlers), verwenden wir jedoch die niedrigere erwartete Migrationszeit für diesen Peak. Im ersten Experiment beträgt diese 60 Minuten, die höchste erwartete Migrationszeit 62 Minuten. Mit den anderen Peakparametern wie a2, d2 usw. verfahren wir analog.
Der nächste Schritt ist ganz einfach. Sie gehen zur Plattform „Modell anpassen“ und wählen dort die generalisierte Regression. Sie fügen M2_lower und M2_upper sowie natürlich alle Ihre DOE-Faktoren und Faktorkombinationen, Interaktionseffekte usw. hinzu. Klicken Sie einfach auf „Ausführen“. JMP erkennt automatisch, dass Sie intervallzensierte Daten verwenden und fragt Sie, ob dies korrekt ist. Klicken Sie einfach auf „Ja“. Dadurch können Sie die Informationen mit der oberen und unteren Grenze für alle Ihre Daten nutzen. Dies ist deutlich besser, als die Daten einfach zu entfernen, da wir Informationen über die fehlenden Daten erhalten und diese hier für die Modellierung verwenden.
Wir verfahren analog für alle anderen Parameter wie a2 (Peakhöhe), a2 (Asymmetrieparameter) und auch für den ersten Peak. Im nächsten Schritt, nach der Modellanpassung und -auswahl (hierfür habe ich die Pruned Forward Selection-Methode der Generalized Least Squares-Plattform verwendet), speichern Sie die Spalte für jeden einzelnen Parameter mit der Funktion „Vorhersageformel speichern“.
Der nächste Schritt ist eigentlich recht einfach. Sie wiederholen diesen Vorgang für jeden Parameter: h1, t1, w1 usw. Nun setzen wir die Chromatogrammformel wieder zusammen, indem wir die Parameter einfach durch die entsprechenden Vorhersageformeln ersetzen.
Erinnern Sie sich? Wir hatten hier am Anfang diese komplexe Formel für Peak 1 und Peak 2. Jetzt ersetzen wir die einzelnen Parameter durch die Vorhersageformeln. h1 befindet sich nun nicht mehr in der Vorhersageformel, sondern in der Formelspalte. Stattdessen haben wir hier h1_upper Vorhersageformel. Dieser Vorgang wird für alle anderen Parameter wiederholt. Da wir dadurch eine sehr lange Formel erhalten, passt sie nicht optimal auf meinen Bildschirm. Sie können sich aber vorstellen, wie das Ganze am Ende für die vollständige Formel aussieht.
Das ist das Ergebnis. Jetzt möchten wir das Ergebnis interaktiv im JMP Profiler anzeigen. Im nächsten Schritt gehen Sie einfach zum Graph-Profiler und wählen die Intensitätsformel aus, die nun die hier gezeigte, neu zusammengesetzte Formel ist. Klicken Sie auf „Zwischenformeln erweitern“, geben Sie die Intensitätsformel und die Y-Vorhersageformel ein und klicken Sie auf „OK“.
Ich möchte Ihnen kurz in JMP zeigen, wie das Ergebnis aussieht. Hier sehen Sie die JMP-Profilplattform. Auf der linken Seite werden der pH-Wert des Puffers, der DOE-Faktor, der SDS-Gehalt des Puffers und der DOE-Faktor – also alle von uns untersuchten DOE-Faktoren – angezeigt.
Das Interessante befindet sich hier rechts, im Elektropherogramm. Auf der x-Achse ist die Migrationszeit und auf der y-Achse die Intensität abgetragen. Ich habe bereits etwas hineingezoomt, weshalb wir hier nur den Bereich von 35–47 Minuten sehen. Es ist aber viel besser zu erkennen, wie gut die beiden Peaks jetzt voneinander getrennt sind. Ich kann nun direkt die Profilereinstellungen und die DOE-Faktoren ändern und die Auswirkungen auf das Chromatogramm beobachten. Durch die Änderung der Endkonzentration ändert sich natürlich auch die Peakhöhe.
Durch die Änderung der Trennspannung ändert sich auch die Migrationszeit der beiden Peaks. Ich kann diesen Vorgang mit der Kapillartemperatur und dem SDS-Puffer wiederholen. Manchmal ist die Trennung der beiden Peaks bei genauer Betrachtung besser, manchmal – wie hier – deutlich schlechter, da dann praktisch keine Trennung mehr möglich ist. Eine Reduzierung des pH-Werts des Puffers führt jedoch zu einer wesentlich besseren Trennung der beiden Komponenten.
Das ist ein Teil. Jetzt haben wir die Interaktivität in JMP mit unserem synthetischen Chromatogramm kombiniert. Aber ich wollte noch einen Schritt weitergehen. Ich zoome hier etwas in das Elektropherogramm mit den gewählten Einstellungen hinein und habe die Formel für das Vorhersage- und Konfidenzintervall angepasst. Ich habe die Formel für das Konfidenz- und Vorhersageintervall durch die Formel für Peak 1 und Peak 2 ersetzt. Die Formel für das Konfidenzintervall zeigt uns jetzt nur noch die Komponente von Peak 1 an.
Betrachten wir das Ganze etwas größer. Die Formel für das Vorhersageintervall zeigt uns nun nur noch die zweite Peakkomponente. Was jetzt möglich ist, ist ziemlich interessant. Wir sehen, dass sich sogar diese beiden Peaks überlappen. Wir können aber weiterhin erkennen, woher der einzelne Peak kommt und wie gut sie voneinander getrennt sind.
Jetzt kann ich genau feststellen, wo sich meine erste Peak-Komponente unterhalb meiner zweiten Peak-Komponente befindet. Das hilft mir natürlich sehr dabei, die Qualität der Trennung zu verstehen und die optimalen Einstellungen zu ermitteln.
Nach der Modellierung sollte man stets die realen Rohdaten mit der Modellvorhersage vergleichen. Genau das habe ich hier in Form von Vorhersage-gegen-Messwert-Diagrammen getan. Rot zeigt die realen Daten, blau die Modellvorhersage. Ich habe hier einige Experimente ausgewählt, um die Leistungsfähigkeit des Modells zu veranschaulichen.
Bitte lassen Sie sich nicht verwirren. Ich beginne hier mit Lauf 2, da Lauf 1 eines der Experimente war, bei denen wir einen Fehler am Rande des Messfehlers hatten. Daher liegen uns keine Daten mit Peakkomponenten vor, und wir können nichts mit einer Modellvorhersage vergleichen. Das ist hier nicht wirklich hilfreich. Aber bei allen anderen Experimenten von Lauf 2 bis Lauf 11 sehen wir, dass das Modell recht gut funktioniert. Manchmal gibt es geringfügige Änderungen in der Retentionszeit, aber die Peakhöhe wird in der Regel recht gut angepasst. Auch die Peakbreite ist ziemlich gut.
Hier gibt es ein kleines Problem mit der Basislinie, aber Chris und sein Team arbeiten intensiv daran, dieses Problem mithilfe der Basismodellierungstechniken zu beheben. Insgesamt betrachtet, wenn wir uns die Leistung des Modells ansehen, würde ich sagen, dass die Vorhersage zwischen realen Daten und Modell sehr gut übereinstimmt.
Ein letzter Schritt im CGE-Beispiel war die Optimierung der DOE-Faktoreinstellungen, um die Peaks bestmöglich zu trennen. Üblicherweise berechnet man dazu die analytische Auflösung für zwei Peakkomponenten. Man subtrahiert die Retentionszeit (bzw. in diesem Fall die Migrationszeit des zweiten Peaks) von der des ersten Peaks und teilt das Ergebnis durch die Halbwertsbreite (WBHM) des ersten und zweiten Peaks.
Wir haben hier bereits alle Modelle für diese Parameter als Funktion unserer DOE-Faktoren modelliert. Wir müssen diese Informationen lediglich miteinander verknüpfen, um ein sogenanntes Hilfsmodell mit der Auflösung als Funktion der untersuchten DOE-Faktoren zu erstellen. Hier sehen wir nun neben unserem Chromatogramm oben rechts die Auflösung als Funktion der DOE-Faktoren in der zweiten Zeile.
Wir nutzen nun einfach die Funktionen von JMP, mit denen wir die Einstellungen optimieren können. Ich weise ihn an, die Auflösung auf Maximum zu optimieren, und als Randbedingung legten die Fachexperten fest, dass die Migrationszeiten 50 Minuten nicht überschreiten sollten. Daher setzen wir die M2-Vorhersageformel, die wir ohnehin verwenden, auf einen Maximalwert von 50 Minuten. Anschließend führen wir den Algorithmus zur Optimierung aus und erhalten die Ergebnisse. Diese sehen wir hier. Mit diesen DOE-Faktoreinstellungen erzielen wir eine gute Trennung der beiden Peakkomponenten und konnten das Problem der CGE-Methodenentwicklung lösen.
Das war ein großer Erfolg. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir nun eine Peak-Erkennung in JMP haben und zukünftig auch die numerische Parametrisierungsoptimierung der Chromatogramme direkt in JMP automatisieren werden. Aktuell ist dies noch manuell möglich, aber noch recht mühsam. Das wird sich in JMP 19 ändern.
Wir verfügen nun über die großartige Funktion, das vollständige Chromatogramm inklusive aller Peaks direkt zu modellieren und die Ergebnisse direkt im JMP-Profil anzuzeigen und zu visualisieren. Meiner Erfahrung nach ist dies ein großer Vorteil für die Fachexperten, um die Funktionsweise von Versuchsplanungen (DOEs) zu verstehen und ihre Methodik zu optimieren. Es handelt sich hierbei um eine wirklich innovative Technologie, die die Kluft zwischen Statistikern und Laboranten sowie analytischen Chemikern schließt.
Damit möchte ich zum Schluss kommen und freue mich sehr, dass Sie dieser Präsentation zugehört haben. Vielen Dank.
