| Vocero |
Transcripción |
| Rebecca Clarke |
Bien, hola a todos. Mi nombre es Rebecca y hoy me acompañan José y George. Hoy vamos a hablarles sobre cómo usamos los métodos de validación de JMP Pro para ayudarnos a dejar de perder el tiempo investigando efectos falsos. |
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Primero, me gustaría presentarles la empresa y explicarles a qué nos dedicamos. Trabajamos para Oxford Biomedica. |
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Somos pioneros en el negocio de la terapia genética y celular, y tenemos una posición de liderazgo en la investigación, desarrollo y bioprocesamiento de vectores lentivirales. |
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Contamos con más de 20 años de experiencia en este campo. Fuimos la primera empresa en tratar a humanos con una terapia basada en un vector lentiviral. Algunos de los... |
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Los socios locales con los que trabajamos se enumeran aquí en la parte inferior derecha, por lo que trabajamos con Novartis, Sonofi, Boehringer Ingelheim y Orchard Therapeutics y algunas de las afecciones que tratamos incluyen cáncer, trastornos del sistema nervioso central y fibrosis quística, solo por nombrar algunas. |
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El año pasado, Oxford Biomedia también se unió a la lucha contra la COVID-19 cuando nos unimos al consorcio de vacunas del Reino Unido. |
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El consorcio estaba dirigido por el Instituto Jenner de la Universidad de Oxford y el objetivo era desarrollar rápidamente una vacuna candidata contra la COVID-19. |
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Al unirse a este consorcio, Oxford Biomedica permitió la fabricación a mayor escala de la vacuna al permitirle acceder a nuestras instalaciones de vanguardia. Posteriormente, firmamos un acuerdo de suministro clínico y comercial con AstraZeneca. |
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Con este acuerdo, acordamos suministrar la vacuna contra la COVID-19 de AstraZeneca si esta resulta exitosa en los ensayos clínicos. Como seguramente todos saben, la vacuna sí tuvo éxito y Oxford Biologica continúa fabricándola hasta la fecha. |
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También me gustaría presentarles brevemente los procesos que utilizamos aquí y en OXB. |
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Entonces, un bioproceso es un proceso que utiliza una célula viva o sus componentes para obtener un producto deseado, por lo que un término bien conocido es: |
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Un ejemplo de tal proceso sería la fermentación de bebidas alcohólicas. |
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Durante este proceso, la levadura es el componente vivo, y junto con todos los demás ingredientes necesarios para elaborar cerveza, se introducen en un biorreactor. Allí, la levadura inicia una reacción química llamada fermentación. Durante la fermentación, la glucosa se convierte en etanol. |
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Y luego, una vez que se completa esta reacción de fermentación, el contenido del biorreactor se recolecta y se purifica mediante filtración y luego nos queda el producto final que es la cerveza. |
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El proceso que utilizamos aquí en Oxford Biomedica es similar a la fermentación. Por lo tanto, el componente vivo de nuestro proceso es... |
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cultivos celulares, por lo que con los biorreactores ponemos en los cultivos celulares y también los otros componentes necesarios para fabricar los factores lentivirales. |
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Al final de este proceso de producción, el contenido del biorreactor pasa a un procesamiento posterior, donde el producto se purifica y luego se embotella y se envía para su uso en pacientes. |
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Esta diapositiva muestra el ciclo de vida del desarrollo de fármacos. En la parte inferior izquierda, se muestra la etapa de investigación. |
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Es en esta etapa donde identificamos genes o proteínas diana que son importantes en los mecanismos de la enfermedad. |
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Además, también desarrollamos fármacos contra estos objetivos y demostramos si el fármaco tiene éxito en su capacidad de atacar la enfermedad. |
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Y luego, al final del ciclo de vida, tenemos la fabricación comercial, donde se fabrica el medicamento y se envasa para su uso en pacientes. |
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Nuestro grupo, el de Procesos, Investigación y Desarrollo, se sitúa entre estas dos etapas. Nuestra labor consiste en diseñar, optimizar y escalar el proceso de producción. |
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y trasladamos el medicamento desde la investigación hasta la fabricación. Algunos de nuestros procesos incluyen matraces de agitación a pequeña escala y trabajamos con biorreactores de hasta 50 litros. |
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Como podéis imaginar, generamos una gran cantidad de datos durante nuestro trabajo y los biorreactores tienen muchos parámetros de entrada que necesitamos monitorizar y optimizar. |
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Con el gran volumen de datos que generamos, resulta bastante difícil discernir en cuáles de los parámetros debemos centrarnos durante nuestra optimización. |
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Y debido a la gran cantidad de parámetros con los que tenemos que trabajar, no es comercialmente viable para nosotros optimizar cada uno de ellos individualmente, por lo que en este punto recurrimos al modelado estadístico. |
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Y utilizamos los modelos para intentar reducir la lista de parámetros potenciales que deberíamos optimizar. |
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Y aunque estos modelos son útiles, generamos mucho ruido aleatorio durante nuestro trabajo y esto se debe a la naturaleza viva del bioprocesamiento, por lo que no hay dos cultivos iguales. |
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Por lo tanto, este ruido aleatorio obviamente se incorpora a nuestros modelos estadísticos y esto puede hacer que perdamos tiempo mirando efectos no genuinos durante nuestros experimentos de optimización. |
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Así que fue con esto en mente que buscamos utilizar JMP Pro, específicamente las funciones de validación, |
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lo cual, con suerte, nos ayudará a limitar aún más la lista de parámetros que analizaremos, eliminar los efectos no genuinos de los modelos y también |
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Para evitar también el sobreajuste de nuestros modelos. Ahora le cedo la palabra a José, quien les explicará todo el método de validación de datos. |
| José Gonçalves |
Bien, me llamo José y voy a hablar sobre todo el método de optimización. Se trata de una herramienta de modelado disponible únicamente en JMP Pro. Nos interesaba explorar cómo usarla... y su utilidad en OXB. |
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Vi lo útil que podría ser. |
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a OXB para el modelado de datos de bioprocesos. Como decía Rebecca, |
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Usamos estos reactores steritank(?) en nuestro proceso y básicamente cultivamos células en estos biorreactores y producimos estos vectores virales, que son nuestros |
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Producto principal. Es lo que queremos maximizar y modelar, así que esta es realmente nuestra variable de respuesta. |
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Y los biorreactores requieren muchas entradas de control y producen una gran cantidad de datos durante un proceso de producción, por lo que es necesario contar con una herramienta que ayude a determinar qué entradas y salidas merecen ser investigadas. |
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Sería de gran valor para nosotros. Nos permitiría ahorrar tiempo, liberar recursos y un enfoque más específico para las investigaciones de procesos. |
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Entonces, antes de comenzar a construir modelos, tuvimos que recopilar la mayor cantidad de datos posible de lotes históricos. |
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Estos datos nos dan indicaciones sobre el funcionamiento de nuestro proceso de producción y cualquier anomalía en ellos podría indicar un efecto perjudicial en los títulos de nuestros vectores. Aquí, a la izquierda, pueden ver que... |
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Recopilamos los datos de 20 variables, pero desafortunadamente no pudimos mostrar los nombres reales de las variables y tuvimos que anonimizar los datos. |
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Así que los enumeramos aquí de X1 a X20 y, dado que nuestro proceso es bastante dinámico, no podemos esperar el grado de colinealidad entre los predictores. |
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En resumen, tenemos un conjunto de datos que contiene 20 variables o 20 predictores candidatos para nuestro modelo, y hemos recopilado los datos de 67 lotes históricos. |
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Entonces, como esto era parte de la prueba de JMP Pro, pensamos que sería una buena idea comenzar usando JMP estándar para construir el modelo y luego usarlo como comparación con otro modelo construido usando el método de formulación de retención. |
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Aquí, para construir el modelo sin el método de validación, utilizamos la plataforma de modelado estándar en JMP y |
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Seleccionamos aquí el modelo de superficie de respuesta porque queríamos permitir que todos los efectos principales, términos de interacción y términos cuadráticos se incluyeran en el modelo. Y aquí, en la personalidad, optamos por una progresión escalonada. Así que aquí, en el lado derecho, |
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Tenemos el panel de control de regresión paso a paso y usamos la regla de detención como nuestro umbral de valor P, por lo que los parámetros restantes los dejamos por defecto. |
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Y luego, después de ejecutar la regresión paso a paso, este fue el modelo final que se generó. |
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Aquí pueden ver que tenemos ocho términos en el modelo, y siete de ellos son significativos. Me gustaría centrar su atención en estos tres primeros factores, ya que son altamente significativos en nuestro modelo. |
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Muy importante en un par de diapositivas cuando voy a mostrar |
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los resultados...los resultados |
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Cuando nos acercamos al uso del método de validación de retención, el modelo antiguo aquí es significativo y puede explicar aproximadamente el 44% de la variación en nuestro conjunto de datos. |
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Y así fue nuestro enfoque inicial. |
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Estábamos contentos con este primer modelo que se generó, pero nos interesaba más saber más sobre los métodos de validación. |
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Porque investigar todos estos predictores requeriría una cantidad considerable de tiempo y recursos de laboratorio, ese fue el enfoque que adoptamos a continuación. |
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A continuación se presenta una descripción general de cómo funciona este método de validación de retención. |
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Básicamente, tenemos nuestro conjunto de datos, que se dividirá aleatoriamente en dos grupos. Así, en el lado izquierdo, el 70 % de los datos... |
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será, se asignará a un conjunto de entrenamiento, que es la proporción de datos que se utilizarán exclusivamente para construir el modelo. |
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Y aquí en el lado derecho tenemos el 30% de los datos que asignaremos a un conjunto de validación, y esta es la proporción de datos que se utilizarán. |
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Para detener la construcción de nuestro modelo cuando este R cuadrado del conjunto de validación es su máximo. Aquí abajo, |
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Podemos ver que esta es una captura de pantalla de la plataforma de regresión por pasos, que es esencialmente la misma que usamos antes, pero había una regla de detención, que muestra que esto es así. |
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El R cuadrado de validación máximo en lugar de nuestro umbral de valor p. Aquí, este gráfico en la parte inferior muestra... |
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Tenemos el conjunto de entrenamiento y tenemos el conjunto de validación aquí, que está etiquetado como excluido. |
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Y entonces, como puede ver, el conjunto de entrenamiento, a medida que comenzamos a ingresar términos en el modelo, |
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porque tenemos esta regla aquí, esta regla de dirección hacia adelante, comenzamos con cero términos en el modelo y luego avanzamos paso a paso para agregar términos al modelo. |
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A medida que comenzamos a agregar esos términos, el R cuadrado aumenta bastante rápido, hasta que tenemos cinco términos en el modelo y después no hay un gran aumento en la mejora del R cuadrado. |
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Al comenzar... al agregar más y más términos, uno de los aspectos importantes al usar este método es también lo que ocurre en el conjunto de validación. |
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Porque esto está relacionado con nuestra regla de detención. Por lo tanto, lo que sucede es esencialmente lo mismo cuando empezamos a añadir términos al modelo. |
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El R cuadrado aumenta bastante rápido, hasta que alcanzamos el R cuadrado máximo y luego de ese punto, a medida que seguimos agregando más y más términos, el R cuadrado disminuye. |
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Y entonces, esto es exactamente lo que hace este conjunto de validación, es decir... lo que queremos usar con este conjunto de validación es detener el proceso de construcción del modelo en esta etapa, para que podamos incluir todos estos términos aquí que explican la mayor parte de la variación en nuestro conjunto de datos y evitar... |
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la inclusión de todos estos términos en el modelo podría crear un sobreajuste del modelo o podría ser que no sean genuinos en absoluto. |
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Después de ejecutar la regresión gradual, este fue el modelo final generado. Como pueden ver, tuvimos una reducción de ocho o siete términos significativos a solo tres. Y, como recordarán, estos términos eran altamente significativos cuando no usábamos... |
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el método de validación de retención y por eso aquí no parecen ser significativos en absoluto. |
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Y en realidad este modelo sólo es capaz de explicar alrededor del 4% de la variación en nuestro conjunto de datos. |
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Y entonces, esto fue bastante... pensamos que esto era una disminución bastante drástica en el número de términos en el modelo y comenzamos a pensar, bien, tal vez tuvimos un poco de mala suerte con el conjunto de validación que se generó para |
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para construir este modelo en particular y pensamos que... Una de las grandes cosas de JMP Pro es que podemos usar esta plataforma de regresión generalizada, que es esencialmente... el resultado es esencialmente el mismo que en una regresión por pasos, pero en esta |
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Plataforma de regresión generalizada: podemos usar esta función de simulación. Básicamente, esto permite ejecutar el modelo una y otra vez, tantas veces como queramos. |
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Y luego lo usamos para cada modelo que se genera, utiliza un conjunto de validación diferente, así que este fue el enfoque que tomamos a continuación. |
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Y porque |
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No pudimos enumerar todos los modelos que generamos; básicamente, solo intentamos generar 100 modelos o hicimos 100 simulaciones de modelos. Por lo tanto, no pudimos enumerarlos todos aquí. |
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Y la forma en que queríamos resumir los resultados es... tratamos de contar la cantidad de veces que un factor particular fue seleccionado para ser incluido en el modelo después de esas 100 simulaciones. |
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Y esto es exactamente lo que muestra este gráfico. A la derecha... a la izquierda. |
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Estas son solo las estimaciones de los parámetros. Esto sirve para observar la dispersión de los datos. Y aquí... |
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Como pueden ver, tenemos X13 y X8, y son estos términos de interacción los que realmente eran significativos cuando no usábamos este método. Y aquí, si tomamos como ejemplo X13, solo se detectó 46 veces. |
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para ser incluido en el modelo o el 46% del tiempo para incluir en el modelo, y por lo tanto, es un número bastante bajo, como esperábamos ya que |
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Estos factores aquí fueron muy significativos cuando no usamos este método. Entonces... |
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La conclusión a la que llegamos al utilizar el método de validación de reserva es que es definitivamente una buena herramienta para los científicos, especialmente cuando construimos modelos y |
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Tenemos estas variables que resultan significativas y no encajan del todo con nuestra comprensión científica. Así que otra conclusión que sacamos es que... |
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La principal ventaja de este estudio es que podemos asumir con seguridad que los atributos del proceso que estudiamos no afectan significativamente los títulos de nuestros vectores. Así que ahora le cedo la palabra a George. Él hablará sobre la autovalidación. |
| George Pamenter |
Hola a todos, me llamo George. Trabajo en el grupo de purificación de Oxford Biomedica. Les voy a hablar un poco sobre esta autovalidación. |
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El método que nos presentaron en JMP y su uso específico en el diseño de experimentos, como la estructura de datos. Voy a explicar brevemente cómo usamos esta metodología para eliminar una variable de un modelo de optimización de purificación de vectores virales. |
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Bien, para comenzar, un poco de información sobre la purificación de un vector viral para aquellos que no lo saben. |
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Así que, esencialmente, recibimos este material de cultivo celular de los biorreactores. |
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Y ese material es bastante crudo, por lo que incluye nuestro interés terapéutico, que son vectores muy virales, que también incluyen miles de otras especies, especies contaminantes. |
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Y pueden ser cualquier cosa, desde proteínas no deseadas hasta ADN bacteriano o, a veces, incluso virus ineficaces. |
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Y por lo tanto el objetivo real de la purificación es separar nuestro producto vector viral puro de todos estos diferentes contaminantes. |
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Pero estos pueden ser procesos increíblemente complejos, que implican cromatografía o tratamientos enzimáticos y diversos factores que afectan su rendimiento. Por lo tanto, necesitamos una forma de seleccionar eficientemente las mejores condiciones para alcanzar la máxima pureza. |
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Y la forma en que lo hacemos, muchas veces, es mediante el diseño de experimentos, un diseño de experimentos común a lo largo del desarrollo de bioprocesos. |
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Los utilizamos básicamente para seleccionar, optimizar y caracterizar completamente nuestros bioprocesos. |
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Básicamente, a medida que avanzamos en el cronograma de desarrollo de fármacos, a medida que avanzamos hacia la fabricación comercial, el tamaño de nuestros experimentos aumenta. |
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La cantidad de experimentos que podemos hacer en realidad disminuye, y se nos hace cada vez más difícil cambiar las cosas a medida que nos acercamos a un producto comercial. |
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Por eso, necesitamos poder tomar decisiones inteligentes desde el comienzo del desarrollo y la forma de hacerlo es mediante |
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Desarrollar modelos eficaces. Si contamos con un modelo eficaz desde el principio, nos da la seguridad de haber elegido las mejores condiciones a medida que avanzamos en nuestra escala de procedimientos. |
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Voy a detallar cómo usamos esta tecnología de autovalidación en un ejemplo específico. Realizamos el diseño de superficie de respuesta de los experimentos. |
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en un paso de purificación del vector viral y nuevamente no podemos compartir los datos reales con ustedes, pero tuvimos que normalizarlos aquí. |
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Este era un espacio de diseño de tres factores, y nuestra variable de salida o respuesta de interés es el nivel de impureza. Este nivel de impureza podría ser la cantidad de proteína de ADN contaminante, algo similar. |
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Así que el objetivo de esto realmente era optimizar estos modelos para el menor nivel de impurezas posible. |
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Y así es como lo vimos inicialmente en nuestras configuraciones JMP, hay tres variables de entrada y esta impureza de respuesta. |
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Así que inicialmente construimos algunos modelos, utilizando la plataforma de regresión paso a paso y también la regresión Lasso, que era una característica de JMP Pro. |
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Y, de hecho, al principio estábamos bastante satisfechos con lo que veíamos, así que explicamos muchos de los datos. |
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Parecía que lo estábamos explicando bastante bien y empezamos a ver las variables que esperábamos que aparecieran. |
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Pero había una variable que nos hacía estar menos seguros, y era esta interacción X1 X3, que puedes ver que he resaltado aquí. |
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Si diriges tu atención a la parte superior derecha de la pantalla, puedes ver que este perfil X1 cambia completamente dependiendo de |
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el valor de X3, por lo que en valores bajos de X3, tenemos este tipo de efecto real, para ser honesto, y luego con valores altos de X3, tenemos este tipo de correlación positiva. |
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Y eso realmente nos confundió mucho y fue un poco preocupante porque en realidad esta interacción X1 X3 realmente no encajaba con lo que entenderíamos científicamente. |
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Eso nos dejó un poco confundidos y también nos preguntamos si nuestros modelos realmente explicaban adecuadamente los datos que habíamos visto. |
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También tuvo importantes implicaciones en el mundo real para el desarrollo de procesos en el sentido de que esta variable X3 era realmente conocida. |
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cambiar bastante. Así que la analogía que usaría aquí sería que si estuviéramos desarrollando una dosificación de dos fármacos, X1 y X2, |
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Descubrimos que, en realidad, la dosis depende de la edad del paciente, digamos X3. Es algo que realmente hay que analizar a fondo y caracterizar. Por lo tanto, explorar esta interacción habría requerido costos de experimentación adicionales significativos, así como tiempo. |
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Queríamos aplicar una metodología de validación al respecto, por lo que consultamos a nuestros colegas de JMP, |
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Y básicamente nos dijeron que, desafortunadamente, no era realmente posible utilizar esta validación de reserva en el diseño de la estructura de datos del experimento. |
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Y la razón de esto es que, si puedes imaginarlo, asigné el 70% de un conjunto de validación, ese tipo de conjuntos de entrenamiento a mis datos aquí en el espacio de diseño, |
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En realidad, estamos construyendo el modelo, pero ignoramos por completo parte del espacio de diseño. Por lo tanto, no es realmente aplicable usar esta validación de retención en los conjuntos de datos del DOE. |
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Así que nuestros colegas de JMP vinieron a nosotros con esta autovalidación. |
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Y la forma en que me lo explicaron fue básicamente que se remuestrearía todo el conjunto de datos. Así que se usa todo el conjunto de datos para el entrenamiento y para la validación. |
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Y eso podría parecer a primera vista como una especie de trampa, ciertamente a mí me pareció, pero me han dicho que la forma en que esto se logra de manera justa es... |
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es mediante la aplicación de estas tres columnas adicionales, y realmente mediante este peso bootstrap ponderado fraccionalmente reducido. |
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Y, esencialmente, creo que la idea aquí es que si usas un dato en el entrenamiento de tu modelo, luego lo ponderas para no usar ese mismo dato tanto en la validación, y así es como evitas esta idea de contar dos veces tus datos. |
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Usamos esta metodología. La ejecutamos en nuestros modelos. Aquí pueden ver la configuración en JMP. Usamos esta plataforma de regresión generalizada, una herramienta de JMP Pro. |
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Y aquí es prácticamente lo mismo que lo que explicaba José, pero en lugar de simular para diferentes |
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En las tareas de entrenamiento y validación, simulamos esta ponderación parcial. Lo simulamos varias veces para generar diferentes modelos, y lo repasamos 500 veces. |
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Nuevamente, la salida de nuestros datos ahora, como pueden ver, con los de José antes, a la derecha aquí hay un histograma de cuántas veces una variable en particular |
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se incluyó en nuestro modelo y aquí a la izquierda tienes estas estimaciones de parámetros de varios modelos. |
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Acabo de dibujar esta línea roja aquí y la llamé línea de factor nulo. Así, esta variable de factor nulo funciona como una variable falsa. |
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Entonces, sabemos que esta es una especie de variable sin sentido porque, si observamos el factor nulo aquí a la izquierda, podemos ver que las estimaciones de sus parámetros están bastante distribuidas alrededor de cero, por lo que realmente no sabe a dónde ir. |
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Y entonces trazamos esta línea y decimos que cualquier... la primera vez que aparece ese factor nulo, cualquier cosa por debajo de eso consideraríamos muy probable que sea un efecto no genuino. |
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Este es un rango de términos no genuinos. He resaltado en azul, como seguramente pueden ver, esta interacción X1-X3, que era la preocupante. |
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Y puedes ver aquí que ha surgido menos veces y muchos de los efectos del factor nulo, por lo que este fue el primer indicio que tuvimos de que esto podría no ser un efecto genuino. |
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Así que no queríamos detenernos ahí. Realizamos varias iteraciones de esto con diferentes |
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Configuraciones de autovalidación. Acabo de generar tres ejemplos. Como pueden ver, en cada ejemplo, resaltado en azul, esta interacción X1 X 3 se situaba constantemente por debajo de esta línea roja, la línea de factor nulo. |
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Entonces, en base a eso, estábamos bastante seguros de que lo que estábamos viendo probablemente no era un efecto genuino, y pudimos eliminarlo de los modelos que deseábamos. |
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Ahora, una comparación de los resultados finales que obtuvimos. A la izquierda, el modelo inicial que construimos incluía la interacción X1-X3. |
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Y luego, a la derecha, este modelo autovalidado donde lo eliminamos. |
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Supongo que lo primero que notamos fue esta reducción en el R cuadrado. Al principio, parece que probablemente se explican menos datos, pero ahora estamos mucho más seguros de que lo que explicamos es real. |
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Y puedes ver aquí la diferencia en las condiciones de optimización de minimización que genera. |
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Y esto, de hecho, nos brindó varios beneficios en términos de procesamiento. Así que recuerden que todas estas son variables de la vida real, con factores reales detrás. |
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Así que esta variable X1, de hecho, es muy costosa para nuestros procesos. Por eso, nos alegró mucho ver que podíamos reducirla. |
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Nuevamente, a medida que esta variable X2 disminuye, eso también supone, por razones científicas, un gran beneficio para nuestro proceso, por lo que también podemos reducirla, lo que fue beneficioso para nosotros. |
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Y supongo que son una suerte de coincidencias felices, pero lo que realmente nos agradó fue que, en realidad, |
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Puedes ver la eliminación de esta interacción X1 X3, estábamos viendo que en realidad los perfiles de X1 y X2 eran constantes y eso realmente encajaba con |
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La comprensión científica que esperábamos, así que nos alegró mucho observar esto. Y, obviamente, ya nos hemos ido y hemos probado ambos modelos con experimentos de seguimiento para ver cuál funcionaba mejor. |
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Y en todas las ocasiones, este modelo autovalidado realmente ha estado de acuerdo con las observaciones que hemos visto en nuestros experimentos finales. |
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Te lo devolveré ahora, Rebecca. |
| Rebecca Clarke |
Haré un breve resumen de lo que hablamos. Así, sabemos que los efectos no reales tienen implicaciones reales tanto para los plazos de desarrollo como para los costos experimentales del bioprocesamiento. |
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Y aquí analizamos dos métodos de validación para ayudarnos con nuestros bioprocesos, para resaltar posibles efectos no reales que podemos eliminar de nuestros experimentos de optimización. |
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Entonces, la herramienta de validación de retención que utilizamos con éxito para eliminar una serie de parámetros de nuestra lista de optimización, y luego también usamos la validación automática durante nuestros experimentos de tipo DOE. |
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En estos casos, los modelos generados también se confirman posteriormente mediante trabajo experimental. En general, quedamos muy satisfechos con el uso de JMP Pro. |
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En particular, los métodos de validación dentro de nuestros bioprocesos para ayudarnos a ahorrar mucho tiempo y recursos y no centrarnos en efectos no reales. |
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Y para finalizar, nos gustaría agradecer a Robert Anderson y Anna Roper de JMP, quienes nos ayudaron a lo largo de esta presentación, y eso es todo por nuestra parte, y gracias por escuchar. |
