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抄本 |
| Meijian Guan |
好的。嗯，大家好。非常感謝大家參加這次演講。我很高興有機會分享我的工作。 |
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我一直在與 JMP 生命科學團隊和 SAS 研究所合作。今天的主題是使用 JMP Project 建立單細胞 RNA 定序工作流程。這是我為 JMP Genomics 10 開發的新功能。如果您不知道 JMP Genomics 是什麼，我會簡單介紹一下。 |
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概述一下，JMP 專案是 14 日發布的一項新功能，它是一款非常棒的工具，可以幫助你整理報告。因此，我們利用這個新平台，組織了一次單細胞 RNA 定序 |
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工作流程。首先，我想先介紹一下 JMP 的背景。 JMP Genomics 是 |
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JMP 家族的產品之一是基於 SAS 和 JMP Pro 建構的。因此，它充分利用了兩種產品的優勢，打造出非常強大的分析工具。 |
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它是為基因組數據設計的，因此它可以讀取不同類型的基因組數據，可以進行預處理，可以處理下一代定序分析。 |
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它在差異基因表現和生物標記發現方面非常出色，許多科學家正在將其用於作物和牲畜育種。所以它是一個非常強大的工具。如果你正在從事基因組學相關的工作，我鼓勵大家去了解它。 |
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接下來我想跟大家分享的是單細胞RNA定序。很多人可能對它不太熟悉。 |
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因此，這是一項相對較新的技術，用於從單一細胞的層面進行檢查。 |
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而相較於傳統的RNA定序技術，它只是測定一組細胞的平均表現量。 |
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這項新技術提供了更高的細胞差異分辨率，讓您更了解單一細胞在其微環境中的功能。 |
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它可以幫助做很多事情，例如發現新的和稀有的細胞群體，追蹤細胞發育軌跡，以及識別不同細胞類型之間差異表達的基因。因此，它的應用非常廣泛。 |
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最近的一個應用是科學家用它來對抗新冠病毒，因為它可以用來 |
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表徵免疫細胞的轉錄變化以及如何開發疫苗和治療方法。此外，它還廣泛應用於癌症研究、免疫學以及許多其他研究領域。嗯，所以它是一個非常強大的工具，但是 |
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分析這些數據確實面臨一些挑戰，這就是我們制定這個工作流程的原因。 |
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我只是想給你概述一下單細胞RNA定序的要點。你首先需要取得樣本， |
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無論是來自人類還是動物。可能是腫瘤樣本，也可能是實驗室樣本。然後你可以將這些樣本分離成單一細胞。 |
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因此，分離後，你可以對每個細胞進行所有基因定序。例如，人類大約有 30,000 個基因。因此，最終結果在讀取計數表中如下所示。我們有…30,000 個基因，每行有 |
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有時大約有五十萬個單元格作為列。所以如你所見，滿足這些非常大的資料集具有非常高的維度。你也可以注意到表格中的零，因為 |
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由於技術或生物學限制，我們無法檢測每個細胞中的每個基因。因此，90% 的細胞實際上 |
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零。所以它非常稀疏。稀疏性是分析單細胞RNA定序資料時的另一個挑戰。 |
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但在進行預處理、清理和降維之後，你可以對這些數據進行常規分析，例如聚類和主成分分析，以及差異基因表現分析。這些內容將在我的工作流程中提及。 |
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我已經提到過，我注意到了一些挑戰，包括高維度、高稀疏性，以及不同細胞群體之間存在不同的異質性。 |
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技術噪音和可重複性，因為存在許多不同的定序協議，因此存在許多不同的分析套件。 |
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在 R、Python 或其他工具中，很難按照精確的步驟來分析數據。如果你混淆了步驟，沒有按照正確的順序進行操作， |
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你可能無法獲得可重複的結果。這就是我們試圖解決的問題之一。 |
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我只想給你看一個單細胞RNA定序資料的例子。這個數據將用於我的演示，它是一個簡化的血液樣本數據，或者說ppm。注意，我說過，行代表細胞，列代表基因，所以 |
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約 8000 列和 100 |
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行，也就是單元格。你幾乎到處都能看到這些零。我相信在這個特定的資料集中，零的稀疏度超過了90%。 |
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那麼，JMP Genomics 10 中全新的單細胞 RNA 定序工作流程究竟包含哪些內容呢？為了建立這個工作流程，我們嘗試 |
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對於那些技術背景不太好或沒有時間學習程式設計和統計資料的人來說，我們把這些步驟按正確的順序排列，以便使用者自動執行工作流程中的其他步驟。此外，我們還 |
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提供高度互動的報告，幫助使用者與我們一起導航、更改參數並檢查不同的選擇。 |
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那麼這個工作流程包含什麼，包括資料導入進度、預處理，以及我們有一個可變基因選擇方法，這實際上是這個工作流程的支柱。 |
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因此，對於變數基因選擇，此方法的目標是降低基因的維度。 |
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因為人類樣本，我們有3萬個基因，但並非所有基因都具有資訊量。所以我們盡量挑選資訊量最大的基因。 |
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分散法和 |
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基於最低迴歸的變異穩定變換方法。我不會深入探討細節，但這兩種方法在研究界被廣泛使用，我很高興我們能夠復現它們。 |
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我們也應用了稀疏奇異值分解 (SVD) 來進一步降低維度。因此，我們也應用了層次聚類和 AK 均值聚類。 |
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我們使用 JMP 中的提升森林方法進行特徵重要性篩選，如果您安裝了 R 套件，我們將直接呼叫 T-SNE 和 UMAP 視覺化 |
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這在單細胞RNA測序分析中非常流行。我們也提供了一些動態視覺化功能，包括小提琴圖、脊線圖和dop圖；我們也進行差異基因表現分析。因此，所有報告都將與JMP專案集成，形成一個高度集成的報告。 |
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接下來我會做一個示範。這個演示有兩個目標。第一個目標是將這個PBMC資料集中的細胞群體進行分類。我們試圖找出這個資料集中的細胞類型。第二個目標是識別不同亞型和不同疾病條件下差異表達的基因。 |
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首先，我們來看看 JMP Genomics Starter。 JMP Genomics 的介面看起來與常規 JMP 有很大不同，但是 |
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導航非常方便。如果你想了解工作流程的基礎知識 |
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基本的單細胞RNA定序工作流程就在這裡，點擊一下就可以調出這個介面。介面非常直覺。你只需要提供一個資料集。 |
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然後指定品管選項。您需要移除哪些類型的基因或細胞，以及選擇哪些可變基因。您想使用哪一種方法？如果您選擇 VST，您也可以指定要保留的基因數量，2000 或 3000。 |
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還有聚類選項，對，你想用多少個主成分進行聚類， |
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你想要分層聚類演算法還是 K 均值聚類演算法？選擇更多，我們有標記基因 |
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幫助您添加用於識別細胞群體的標記基因列表，這是一個非常方便的工具。您可以啟動變異數分析和差異表達分析。所以這是一份單獨的報告。 |
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我不會在這次演講中討論這個問題。我們之前提到的另一個例子是實驗，對吧？如果你補充一下，基本上你可以提供任何與初始設計相關的信息，例如治療訊息， |
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性資訊。所以這是 |
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這裡的模擬數據。我只是想向你們展示如何比較不同組間的基因表現量和不同的測量值。 |
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最後，我們提供嵌入選項，如果您安裝了 t-SNE 或 UMAP R 套件，可以呼叫它們。您可以根據我們的演算法更改不同的參數。 |
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指定完所有選項後，只需運行，即可獲得類似這樣的報告。這是 |
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表格報告。此報告共有七個選項卡。我按照您想要的順序排列它們 |
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有多少個基因 |
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在細胞中，有多少讀取計數或數據中線粒體基因計數的百分比是多少，以及這三個測量值之間的相關性。 |
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你注意到左側有一個操作框。你可以展開它，找到裡面的選項，在這個框框裡你可以做很多事。 |
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在這個選項卡中，您可以根據實驗設計文件中提供的條件來拆分圖表。例如，我們可以進行一個處理，然後拆分 |
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藥物1，藥物2，安慰劑。然後你就可以看看不同組別之間是否有差異，對吧，如果你想回到我們最初的圖，我們可以取消分割。 |
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第二個標籤是可變基因選擇，這是整個工作流程的核心。紅點表示我選擇進行後續分析的基因，這些 |
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灰點是將在分析中丟棄的基因。如果你展開操作框，你會看到，由於我們使用了 VST，我們指定了 2000 個基因 |
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在這個分析中。但如果你改變主意了，你可以，無論何時改變主意，你都可以輸入不同的基因數量，然後點擊「確定」。這樣所有標籤頁都會根據這個新數字刷新。 |
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因此，在有了可變基因清單之後，您要做的就是透過執行稀疏 SVD 分析來進一步降低維度，這相當於主成分分析。 |
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因此，在應用SVD分析後，您可以繪製前兩個SVD或主成分。嘗試檢查資料集的整體結構。 |
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在這個例子中，我們可以看到這個資料集中有兩個大組，這很有趣。我們還提供了一個 3D 圖表，方便您進一步探索。 |
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你的數據。有時，有些見解你無法在二維圖中辨識；三維圖有時確實可以提供額外的價值。 |
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我們有這些 SVD，根據你選擇的數量（20 或 30），你可以使用它們來 |
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執行聚類分析。在本例中，我們選擇了層次聚類，並在資料集中找到了 9 個聚類。 |
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除了樹狀圖，我們也提供星座圖 |
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我非常喜歡這個圖，因為它和 t-SNE 或 UMAP 很相似。它能讓你更了解不同組別之間的距離，對吧？ |
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例如，有三個組，大組，三個集群 |
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與其他群體有點不同。如果你想看看它們在整體結構中的位置，這是我偵測到的前三個群集。看看3D圖，我們可以看到 |
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所有那些高亮的都在這裡。然後再回到二維，這是兩個大集群之一，你知道，我之前說過我高亮了，所以它的互動性真的能幫助你 |
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以多種方式觀察和視覺化您的數據。我們也提供平行圖，幫助您進一步識別不同組別之間的差異模式。 |
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下一個選項卡是嵌入，如果你安裝了 R 包，這意味著 t-SNE 和 UMAP 部分。我會 |
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調用 R，運行分析，然後返回數據並在 JMP 中可視化。這是 t-SNE 圖。我們得到了九個聚類，它們被很好地分離了。 |
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底部是完全相同的圖，但這次我用你提供的標記基因進行了著色；我們有14個標記基因。因此，你可以使用此功能切換到點擊瀏覽 |
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看看這些基因在哪裡表達，對吧？例如，有一個GNLY基因在這個小簇中高度表達，我們想知道，我們的數據是什麼？我們選中並回溯，現在我們可以看到所有數據，它們大部分來自簇9，簇8。 |
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所以GNLY是NK細胞的一個基因。這是NK細胞的標記基因。現在我們知道這個細胞群是什麼樣的了，對吧。 |
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這裡還有操作按鈕，幫您做更多事。如果您想切換到 UMAP，或者您喜歡 UMAP，也可以。現在圖表已經關聯到 UMAP 了。 |
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完全一樣，但 UMAP 確實能提供更好的分離效果，並且可以在視覺化中保留更全局的結構。此外，我們也可以提供一些方法，幫助您移除可能 |
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被污染或存在一些品質問題。例如，我們不喜歡這裡的一組細胞，可以將它們從視覺化中移除。讓它更乾淨，但你隨時可以將它們重新添加回來。 |
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再次，我們可以拆分圖表，這是一個拆分圖表按鈕。這次，我們可以按性別拆分，例如以女性、男性拆分。對，我們可以比較不同性別群體的基因表現水平，有時非常有用。 |
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我們分裂了。 |
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下一個選項卡為您提供了更多視覺化工具，用於可視化九個基因表現水平 |
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組，九個組單元，對吧。所以第一部分叫做小提琴圖。同樣，我們有一個功能切換器可以幫助你瀏覽 |
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所有這些基因都在不同的簇中，對吧？現在你可以看到，這取決於圖譜中各部分的高度和密度。 |
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你可以清楚地看到這些基因在哪裡高度表達。例如，我們再次舉例說明，我使用這個基因GNLY，你可以看到它在第八個簇中高度表達。 |
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中間我們提供的第二個圖是山脊圖。山脊圖組織了 |
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Y軸表示聚類，X軸表示基因表現量。但它基本上會提供類似的結果，這取決於你的喜好。 |
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例如，GNLY，我們再次看到集群八具有透過結或其他集群高度表達的 GNLY。 |
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底部還有另一個圖，叫做點圖。這是我們剛剛添加到報告中的新圖。除了顯示基因表現量外，點圖還可以顯示表達該基因的細胞百分比。例如，看看這個， |
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PPBP基因。我們可以看到，在第七組細胞中，100%的細胞都表達了PPBP基因。所以這個基因是 |
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實際上是 PPBP 細胞。現在很清楚，簇 7 是一種血細胞，即 PPBP 細胞，他們會觀察其他細胞，例如簇 2。 |
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只有12%的細胞表達這個基因。所以可能會有一些污染，但這組細胞絕對不是PPBP細胞。這張圖只是顯示 |
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每個簇中的表達水平和表達百分比為圖提供了額外的資訊。 |
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下一個標籤也非常有用。它被稱為特徵篩選。我使用了一種衰減增強森林演算法，然後利用這些基因來預測聚類。因此，對細胞分離有貢獻的最重要的基因已在這張表中進行了排序。 |
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查看這些基因的正確方法是打開這個操作框。選擇您想要視覺化的前 35 個基因，然後點擊「確定」。 |
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下一個標籤只會顯示你選擇的35個基因。這些基因大多是有用的。對。它們可以解釋 |
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為什麼這些不同的細胞群會被分開。所以，我們只需切換，或者你可以點擊查看，試著看看其中的模式。然後如果你注意到，有很多基因 LYZ， |
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CST3 和 NKG7。這些基因已經存在於標記基因中或已提供，這意味著該特徵篩選 |
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這種方法確實能成功從資料集中找出最重要的基因。另外，你可以透過 GTEx 資料庫進行視覺化。 GTEx 是一個組織特異性資料庫。 |
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告訴你哪些基因在你體內的哪些組織中表現。這樣我們就可以直接將基因清單傳送到資料庫。你只需點擊“確定”。我們將打開 |
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網站和GTEx網站會提供熱圖，對，上面列出了排名前35的基因。現在你可以看到我在這兩種人體組織和器官中表達的位置，這非常方便查看更多資訊。 |
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現在我們有了這些標記基因，你大概就能辨識出它們屬於哪一類細胞了。所以有一個 |
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這裡有個函數叫做「重新編碼」。它的作用是，你打開它，就可以把這些數字重新編碼成實際的細胞名稱。例如，8，我們已經知道是NK細胞。我們可以……我已經給每個細胞都取了名字。所以我只需輸入 |
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那些 |
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單核細胞。 |
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兩個實際上是 DC 細胞；三個是 FCGR3A+ 單核細胞。 |
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這些是幼稚 CD+ T 細胞。 |
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第五組記憶 CD4+ T 細胞。 |
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和 CD8+ T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
對於第六組，第七個是 PPBP，正如我們已經看到的，第九個是 B 細胞。 |
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有了這些重新編碼，我們點擊「重新編碼」。現在，由於所有圖表和標籤都已連接，您可以發現所有數字都已變更為實際的儲存格名稱。這只是為了幫助您探索數據 |
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很容易，對吧。你可以知道這些細胞在哪裡，然後你就可以在你的圖上和圖內進行一些探索。再說一次，包括這個聚類圖，你可以看到自訂名稱變成了實際的細胞名稱。嗯，所以 |
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今天的主題就到這裡。如果您有任何疑問，可以寄電子郵件給我或在 JMP 社群留言。非常感謝您的寶貴時間。 |
