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Transcripción |
| Meijian Guan |
Muy bien. Hola a todos. Muchas gracias por asistir a esta presentación. Me alegra mucho tener la oportunidad de compartir el trabajo que he hecho. |
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He estado trabajando con el grupo de Ciencias de la Vida de JMP y el Instituto SAS. El tema de hoy será la creación de un flujo de trabajo de secuenciación de ARN unicelular con el Proyecto JMP. Esta es una nueva función que desarrollé para JMP Genomics 10. Si no sabes qué es JMP Genomics, te daré una breve explicación. |
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Una descripción general del proyecto JMP es una nueva función, lanzada el 14, y es una herramienta muy útil que ayuda a organizar los informes. Aprovechamos esta nueva plataforma y organizamos una secuenciación de ARN unicelular. |
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flujo de trabajo. Primero que nada, quiero darles un poco de contexto sobre JMP. JMP Genomics es... |
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Uno de los productos de la familia JMP está basado en SAS y JMP Pro. Por lo tanto, aprovecha ambos productos, lo que crea una herramienta analítica muy potente. |
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Está diseñado para datos genómicos, por lo que puede leer distintos tipos de datos genómicos, puede realizar preprocesamiento y puede manejar la secuenciación de próxima generación y ese análisis. |
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Es muy eficaz para la expresión génica diferencial y el descubrimiento de biomarcadores, y muchos científicos lo utilizan para la mejora de cultivos y ganado. Por lo tanto, es una herramienta muy potente. Animo a todos a que la prueben si trabajan en algo relacionado con la genómica. |
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Lo siguiente que quiero compartir con ustedes es la secuenciación de ARN unicelular. Puede que muchos no estén muy familiarizados con ella. |
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Así que esta es una tecnología relativamente nueva que se utiliza para examinar eso a nivel de células individuales. |
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Y en comparación con la tecnología de secuenciación de ARN tradicional, que es una encuesta, el nivel de expresión promedio de un grupo de células. |
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Esta nueva tecnología proporciona una mayor resolución de las diferencias celulares y permite una mejor comprensión de la función de la célula individual en el contexto de su microambiente. |
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Y puede ayudar a muchas cosas, como descubrir poblaciones celulares nuevas y raras, rastrear trayectorias de desarrollo celular e identificar genes con expresión diferencial entre tipos celulares. Por lo tanto, tiene una aplicación muy amplia. |
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Una aplicación reciente es que los científicos la están usando para combatir el Covid 19, ya que se puede usar para |
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Caracterizar los cambios transcripcionales en las células inmunitarias y cómo desarrollar vacunas y tratamientos. Además, se usa ampliamente en la investigación del cáncer, en inmunología y en muchos otros campos de investigación. Es una herramienta muy poderosa, pero... |
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Analizar esos datos implica ciertos desafíos, por eso creamos este flujo de trabajo. |
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Solo quería darles una visión general de la secuenciación de ARN unicelular. Lo primero que necesitan es obtener una muestra. |
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Ya sea de humanos o animales. Podría ser un tumor o una muestra de laboratorio. Y luego se pueden aislar esas muestras en células individuales. |
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Después de aislar, se puede secuenciar cada célula individual para todos los genes presentes. Por ejemplo, en los humanos, tenemos unos 30.000 genes. El resultado final se verá así en nuestra tabla de recuento de lecturas. Tenemos 30.000 genes en filas y tenemos... |
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A veces, alrededor de medio millón de celdas como columnas. Como puede ver, este conjunto de datos tan grande tiene dimensiones muy altas. También puede observar los ceros en la tabla porque... |
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Debido a limitaciones técnicas o biológicas, no hay forma de detectar todos los genes en cada célula. Por lo tanto, no es raro ver que el 90 % de las células... |
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ceros. Por lo tanto, es muy escaso. La escasez es otro desafío al analizar datos de secuenciación de ARN de células individuales. |
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Pero después de realizar el preprocesamiento, la limpieza y la reducción de la dimensión, se pueden aplicar métodos regulares, como la agrupación en clústeres y el análisis de componentes principales, así como el análisis de expresión génica diferencial, a estos datos. Estos se mencionarán en mi flujo de trabajo. |
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Y ya mencioné que noté desafíos, incluida alta dimensionalidad, alta escasez y también heterogeneidad variable entre las poblaciones de células. |
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Ruidos técnicos y reproducibilidad, ya que hay tantos protocolos de secuenciación diferentes y tantos paquetes analíticos diferentes. |
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En R, Python u otras herramientas, es muy difícil seguir los pasos exactos para analizar los datos. Y si confundes los pasos y no haces las cosas en el orden correcto, |
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Es posible que no se puedan obtener resultados reproducibles. Ese es uno de los problemas que intentamos resolver. |
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Solo quiero mostrarles un ejemplo de datos de secuenciación de ARN de una sola célula. Estos datos se usarán en mi demostración y son datos de muestras de sangre reducidas o ppm. Como dije, tenemos las células en filas y los genes en columnas, así que... |
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alrededor de 8000 columnas y 100 |
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Filas, es decir, celdas. Y se pueden ver esos ceros prácticamente en todas partes. Creo que hay más del 90 % de escasez en este conjunto de datos específico. |
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¿Qué incluye nuestro nuevo flujo de trabajo de secuenciación de ARN unicelular en JMP Genomics 10? Para este flujo de trabajo, intentamos desarrollarlo |
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Para quienes no tienen una sólida formación técnica o no tienen tiempo para aprender a programar y todas esas estadísticas, en este flujo de trabajo ordenamos esos pasos correctamente para que los usuarios ejecuten automáticamente los demás. Además, |
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Proporcionar informes muy interactivos para ayudar a los usuarios a navegar con nosotros y cambiar los parámetros y verificar diferentes selecciones. |
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Entonces, ¿qué hay en este flujo de trabajo, incluido el progreso de la importación de datos, el preprocesamiento y tenemos un método de selección de genes variables, que en realidad es la columna vertebral de este flujo de trabajo? |
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Entonces, para la selección de genes variables el objetivo de este método es reducir una dimensión de los genes. |
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Porque en la muestra humana, tenemos 30.000 genes y no todos son informativos. Por eso, intentamos seleccionar los más informativos. |
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método de dispersión y |
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Método de transformación estabilizadora de la variabilidad basado en la regresión más baja. Por lo tanto, no entraré en detalles, pero estos dos métodos son ampliamente utilizados en la comunidad investigadora y me complace haberlos podido reproducir. |
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También aplicamos SVD dispersa para reducir aún más las dimensiones. Por lo tanto, también aplicamos agrupamiento jerárquico y agrupamiento de medias ak. |
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Contamos con un sistema de detección de importancia de características mediante un método de bosque de refuerzo en JMP y, si tiene paquetes R instalados, lo llamamos directamente a la visualización de T-SNE y UMAP. |
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Este método es muy popular gracias al análisis de secuenciación de ARN de células individuales. También proporcionamos visualizaciones dinámicas, como gráficos de violín, de líneas de cresta y de dop; además, realizamos análisis de expresión génica diferencial. Por lo tanto, todos los informes se organizarán en un sistema integrado con el proyecto JMP. |
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A continuación, haré una demostración. Esta demostración tiene dos objetivos. El primero es clasificar las poblaciones celulares en este conjunto de datos de PBMC. Intentamos determinar los tipos celulares en este conjunto de datos. El segundo objetivo es identificar la expresión diferencial de jeans en diferentes subtipos y condiciones. |
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Primero, vayamos a la interfaz de inicio de JMP Genomics. La interfaz de JMP Genomics es bastante diferente a la de JMP normal, pero... |
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Es bastante fácil de navegar. Si quieres encontrar los conceptos básicos de los flujos de trabajo... |
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El flujo de trabajo básico de secuenciación de ARN unicelular se encuentra aquí. Al hacer clic, se abre esta interfaz. Es bastante intuitiva. Digamos que simplemente se proporciona un conjunto de datos. |
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Y especifica las opciones de control de calidad. ¿Qué tipos de genes o células desea eliminar para su análisis y selección de genes variables? ¿Qué método desea utilizar? Si selecciona un VST, también puede especificar el número de genes que desea conservar: 2000 o 3000. |
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Y las opciones de agrupamiento, ¿cierto?, ¿cuántos componentes principales desea utilizar para el agrupamiento y |
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O prefiere algoritmos jerárquicos o de agrupamiento de k-means. Y cuantas más opciones, más genes marcadores tenemos. |
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Para ayudarte a agregar una lista de genes marcadores que quieras usar para identificar las poblaciones celulares, lo cual es una herramienta muy útil. También puedes iniciar análisis de ANOVA y de expresión diferencial. Este es un informe aparte. |
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No abordaré esto en esta charla. Otro ejemplo que tuvimos fue un experimento. Si agregamos que, básicamente, se puede proporcionar cualquier información relacionada con el diseño inicial, como información del tratamiento, |
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Información sobre sexo. Así que esto es |
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Los datos simulados aquí. Solo quiero mostrarles cómo compararemos los niveles de expresión génica y las diferentes mediciones entre los grupos. |
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Finalmente, contamos con opciones de incrustación que pueden llamar a paquetes t-SNE o UMAP R si los tiene instalados. Puede modificar diferentes parámetros para nuestros algoritmos. |
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Después de especificar todas esas opciones, simplemente vaya a ejecutar y obtendrá un informe similar a este. Este es un... |
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Informe tabular. Hay un total de siete pestañas en este informe. Las organicé en el orden que desee. |
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¿Cuántos genes hay? |
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En las células, ¿cuántos recuentos de lectura o cuál es el porcentaje de recuentos de genes mitocondrial en sus datos y las correlaciones entre estas tres mediciones? |
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Observen que en el lado izquierdo está el cuadro de acción. Pueden expandirlo y encontrar opciones; en este cuadro pueden hacer muchas cosas. |
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En esta pestaña, puedes dividir el gráfico según las condiciones proporcionadas en el archivo de diseño experimental. Por ejemplo, podemos realizar un tratamiento y dividirlo. |
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Fármaco 1, Fármaco 2, placebo. Entonces puedes ver si hay alguna diferencia entre los diferentes grupos, ¿cierto? Y podemos desglosar si quieres volver a nuestra gráfica original. |
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La segunda pestaña es la selección de genes variables, que es la columna vertebral de este flujo de trabajo. Los puntos rojos representan los genes que seleccioné para el análisis posterior y estos... |
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Los puntos grises son los genes que se descartarán en el análisis. Si expandes el cuadro de acción, puedes ver que, como usamos el VST, especificamos 2000 genes. |
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En este análisis. Pero si cambia de opinión, puede, siempre que lo desee, introducir un número diferente de genes y hacer clic en Aceptar. Así, todas las pestañas se actualizarán con este nuevo número. |
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Entonces, después de tener una lista de genes variables, lo que vas a hacer es reducir aún más las dimensiones realizando un análisis SVD disperso, que es equivalente al análisis de componentes principales. |
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Después de aplicar el análisis SVD, puede trazar los dos SVD principales o componentes principales. Intente comprobar la estructura global de su conjunto de datos. |
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En este caso, podemos ver que hay dos grandes grupos en este conjunto de datos, lo cual es interesante. Además, proporcionamos un gráfico 3D para ayudarle a explorar más a fondo. |
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Sus datos. A veces hay información que no se puede identificar en un gráfico 2D; los gráficos 3D a veces pueden aportar un valor añadido. |
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Y tenemos esos SVD, dependiendo de cuántos hayas seleccionado (20 o 30), puedes usarlos para |
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Realizar la agrupación. En este caso, seleccionamos la agrupación jerárquica y encontramos nueve clústeres en el conjunto de datos. |
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Además del dendograma, también ofrecemos un gráfico de constelaciones. |
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Lo cual me gusta mucho porque este gráfico es similar al t-SNE o al UMAP. Te da una mejor idea de la distancia entre los diferentes grupos, ¿verdad? |
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Por ejemplo, hay tres grupos, grandes grupos, tres clústeres. |
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Se distinguen bastante de otros grupos. Y si quieres ver dónde se ubican en la estructura global, estos son los tres grupos principales que detecto. Observa los gráficos 3D; podemos ver... |
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Todos los resaltados están aquí. Y luego, vayan a 2D nuevamente. Este es uno de los dos grandes grupos que resalté, así que su interactividad realmente les ayuda. |
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Observe y visualice sus datos de diversas maneras. También proporcionamos un gráfico paralelo para ayudarle a identificar mejor los diferentes patrones en los distintos grupos. |
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Y la siguiente pestaña es incrustación, lo que significa partes t-SNE y UMAP si tiene instalado el paquete R. Lo haré |
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Llamar a R, ejecutar el análisis, recuperar los datos y visualizarlos en JMP. Aquí se muestra un gráfico t-SNE. Tenemos nueve clústeres perfectamente separados. |
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En la parte inferior se ve exactamente el mismo gráfico, pero esta vez lo coloreé con los genes marcadores que proporcionaste; tenemos 14 genes marcadores. Así que, con esta función, puedes cambiar a la navegación. |
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Para ver dónde se expresan estos genes, ¿cierto? Por ejemplo, hay un gen GNLY, altamente expresado en este pequeño grupo, y nos preguntamos: ¿cuáles son nuestros datos? Seleccionamos y retrocedemos, y ahora vemos que todos son del grupo nueve y del grupo ocho. |
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Entonces, GNLY es un gen para las células NK. Este es un gen marcador para las células NK. Así que ahora tenemos una idea de qué grupo de estas células es, ¿cierto? |
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También tenemos botones de acción que te ayudan a hacer más cosas. Si quieres cambiar a UMAP, puedes hacerlo. Ahora las parcelas se asocian a UMAP. |
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Exactamente lo mismo, pero UMAP ofrece una separación ligeramente mejor y conserva una estructura más global en la visualización. Además, podemos ofrecerle algunas maneras de eliminar las celdas que podrían estar... |
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Están contaminadas o presentan problemas de calidad. Por ejemplo, si no nos gusta un grupo de células, podemos eliminarlas de la visualización. Para que queden más limpias, pero siempre podemos recuperarlas. |
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Y de nuevo, podemos dividir las gráficas (el botón "Dividir gráfico"). En esta ocasión, podemos dividir por género: femenino y masculino. Podemos comparar el nivel de expresión génica entre los grupos de género, lo cual resulta muy útil en ocasiones. |
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Y estamos divididos. |
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Y la siguiente pestaña le proporciona más herramientas de visualización para visualizar los niveles de expresión genética en los nueve |
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Grupos, nueve celdas de grupo, ¿cierto? La primera parte se llama gráfico de violín. De nuevo, tenemos un selector de características que te ayuda a navegar. |
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Todos esos genes en diferentes grupos, ¿cierto? Ahora puedes ver, dependiendo de cómo, la altura de la parte del gráfico y su densidad. |
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Se puede ver claramente dónde se expresan con mayor intensidad esos genes. Por ejemplo, de nuevo, estoy usando este gen, GNLY, y se puede ver que se expresa con mayor intensidad en el grupo ocho. |
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Y en el medio, el segundo gráfico que les proporcionamos es el gráfico de cresta. Un gráfico de cresta organiza... |
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grupos en el eje Y y el nivel de expresión genética en el eje X. Pero básicamente te proporciona algo similar dependiendo de lo que te guste. |
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Por ejemplo, GNLY, nuevamente, podemos ver que el grupo ocho tiene GNLY altamente expresado por nudos u otros grupos. |
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En la parte inferior tenemos otro gráfico llamado diagrama de puntos. Este es el nuevo gráfico que acabamos de añadir a este informe. Además de mostrar los niveles de expresión génica, el diagrama de puntos también puede mostrar el porcentaje de células que expresan ese gen. Por ejemplo, observen este punto: |
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Gen PPBP. Podemos ver este grupo, en el grupo siete que hemos tenido, podemos ver que el 100% de las células en el grupo siete expresan este gen PPBP. Por lo tanto, este gen es el gen marcador para... |
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De hecho, son células PPBP. Ahora queda claro que el grupo siete es un tipo de célula sanguínea, una célula PPBP, y analizan otras, como por ejemplo, el grupo dos. |
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Solo el 12% de las células expresan este gen. Por lo tanto, podría haber contaminación, pero este grupo de células definitivamente no son células PPBP. Este gráfico solo muestra... |
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el nivel de expresión y el porcentaje de expresión en cada clúster, lo que ofrece información adicional en la gráfica. |
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La siguiente pestaña también es muy útil. Se llama cribado de características. Lo que hice fue un algoritmo de bosque de potenciación de desvanecimiento y luego usé esos genes para predecir los clústeres. Así, los genes más importantes que contribuyeron a la separación de las células se clasifican en esta tabla. |
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La forma correcta de ver estos genes es abrir este cuadro de acción. Seleccione los 35 genes principales que desea visualizar. Haga clic en Aceptar. |
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La siguiente pestaña te mostrará solo los 35 genes que seleccionaste. Esos son los genes, principalmente informativos. Correcto. Pueden explicar... |
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¿Por qué se separan esos diferentes grupos de células? De nuevo, simplemente cambiamos o puedes hacer clic para ver los patrones. Y si te fijas, hay muchos genes LYZ, |
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CST3 y NKG7. Estos ya están en los genes marcadores o fueron proporcionados, lo que significa que esta evaluación de características... |
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Este método es muy eficaz para identificar los genes más importantes del conjunto de datos. Además, se puede visualizar mediante la base de datos GTEx, una base de datos específica para cada tejido. |
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Te indicamos qué genes se expresaron en qué tejido de tu cuerpo. Así, podemos enviar la lista de genes directamente a la base de datos. Simplemente haz clic en Aceptar. Se abrirá el... |
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El sitio web y el sitio web de GTEx te proporcionarán un mapa de calor, ¿verdad? Con los 35 genes principales, puedes ver dónde me he expresado en esos dos tejidos y órganos humanos, lo cual es muy útil para obtener información adicional. |
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Ahora que usamos esos genes marcadores, probablemente puedas identificar qué grupo de células son, ¿verdad? Así que ahí está... |
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La función aquí se llama recodificar. Lo que hace es abrirla y recodificar esos números en nombres de células reales. Por ejemplo, ya sabemos que son células NK. Ya tengo los nombres de cada una de ellas. Simplemente escribo... |
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Aquellos |
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Monocitos. |
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En realidad, dos son células DC y tres son monocitos FCGR3A+. |
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Se trata de células T CD+ Naive. |
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Grupo cinco Células T CD4+ de memoria. |
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Y células T CD8+ |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
para el grupo seis; el siete es PPBP, como ya vimos y el noveno son células B. |
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Con esas recodificaciones, hacemos clic en "recodificar". Como todos los gráficos y las pestañas están conectados, puedes ver que todos los números se han convertido en nombres de celda reales. Esto te ayudará a explorar tus datos. |
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Fácilmente, ¿verdad? Puedes saber dónde están esas celdas y explorar de nuevo tus gráficos. Y, de nuevo, incluyendo estos gráficos de agrupamiento, verás que el nombre personalizado se ha cambiado por los nombres de las celdas. Bueno, entonces... |
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Eso es todo por hoy. Si tienen alguna pregunta, pueden enviarme un correo electrónico o dejar un mensaje en la Comunidad JMP. Muchas gracias por su tiempo. |
