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使用 JMP® 项目构建单细胞 RNA 测序工作流程 (2020-US-30MP-603)

关美建，JMP 研究统计开发人员，SAS

单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）能够更高分辨率地观察细胞差异，并更好地理解单个细胞在其微环境中的功能。近年来，该技术已用于表征单个免疫细胞的转录变化，从而对抗COVID-19。然而，由于其高维度、稀疏性以及不同细胞群体间存在差异的异质性，也给数据可视化和分析带来了新的挑战。JMP Project是一种组织数据表、报告、脚本以及外部文件的新方法。在本演讲中，我将演示如何使用JMP Project创建一个集成的ScRNA-seq基本工作流程，该工作流程对scRNA-seq数据集执行标准探索。首先，它使用离散度或方差稳定变换（VST）方法选择一组高变异基因。然后，通过执行稀疏SVD分析进一步降低数据维度和稀疏性。然后，它会生成一个交互式报告，其中包含数据概览、变量基因图、层次聚类、特征重要性筛选以及单个基因表达水平的动态小提琴图。此外，如果安装了合适的 R 软件包，它还会利用 JMP 中的 R 集成功能对细胞群体执行 t-SNE 或 UMAP 可视化。

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扬声器	抄本
Meijian Guan	好的。嗯，大家好。非常感谢大家参加这次演讲。我很高兴有机会分享我的工作。
	我一直在与 JMP 生命科学团队和 SAS 研究所合作。今天的主题是使用 JMP Project 构建单细胞 RNA 测序工作流程。这是我为 JMP Genomics 10 开发的新功能。如果您不知道 JMP Genomics 是什么，我会简单介绍一下。
	概述一下，JMP 项目是 14 日发布的一项新功能，它是一款非常棒的工具，可以帮助你整理报告。因此，我们利用这个新平台，组织了一次单细胞 RNA 测序
	工作流程。首先，我想先介绍一下 JMP 的背景。JMP Genomics 是
	JMP 家族的其中一款产品是基于 SAS 和 JMP Pro 构建的。因此，它充分利用了两种产品的优势，打造出一款非常强大的分析工具。
	它是为基因组数据设计的，因此它可以读取不同类型的基因组数据，可以进行预处理，可以处理下一代测序分析。
	它在差异基因表达和生物标志物发现方面非常出色，许多科学家正在将其用于作物和牲畜育种。所以它是一个非常强大的工具。如果你正在从事基因组学相关的工作，我鼓励大家去了解一下它。
	接下来我想和大家分享的是单细胞RNA测序。很多人可能对它不太熟悉。
	因此，这是一项相对较新的技术，用于从单个细胞的层面进行检查。
	而相比传统的RNA测序技术，它只是测定一组细胞的平均表达水平。
	这项新技术提供了更高的细胞差异分辨率，让您更好地了解单个细胞在其微环境中的功能。
	它可以帮助做很多事情，比如发现新的和稀有的细胞群体，追踪细胞发育轨迹，以及识别不同细胞类型之间差异表达的基因。因此，它的应用非常广泛。
	最近的一个应用是科学家用它来对抗新冠病毒，因为它可以用来
	表征免疫细胞的转录变化以及如何开发疫苗和治疗方法。此外，它还广泛应用于癌症研究、免疫学以及许多其他研究领域。嗯，所以它是一个非常强大的工具，但是
	分析这些数据确实面临一些挑战，这就是我们制定这个工作流程的原因。
	我只是想给你概述一下单细胞RNA测序的要点。你首先需要获取样本，
	无论是来自人类还是动物。可能是肿瘤样本，也可能是实验室样本。然后你可以将这些样本分离成单个细胞。
	因此，分离后，你可以对每个细胞进行所有基因测序。例如，人类大约有 30,000 个基因。因此，最终结果在读取计数表中如下所示。我们有……30,000 个基因，每行有
	有时大约有五十万个单元格作为列。所以正如你所见，满足这些非常大的数据集具有非常高的维度。你也可以注意到表格中的零，因为
	由于技术或生物学限制，我们无法检测每个细胞中的每个基因。因此，90% 的细胞实际上
	零。所以它非常稀疏。稀疏性是分析单细胞RNA测序数据时的另一个挑战。
	但在进行预处理、清理和降维之后，你可以对这些数据进行常规分析，例如聚类和主成分分析，以及差异基因表达分析。这些内容将在我的工作流程中提到。
	我已经提到过，我注意到了一些挑战，包括高维性、高稀疏性，以及不同细胞群体之间存在不同的异质性。
	技术噪声和可重复性，因为存在许多不同的测序协议，因此存在许多不同的分析包。
	在 R、Python 或其他工具中，很难按照精确的步骤来分析数据。如果你混淆了步骤，没有按照正确的顺序进行操作，
	你可能无法获得可重复的结果。这就是我们试图解决的问题之一。
	我只想给你看一个单细胞RNA测序数据的例子。这个数据将用于我的演示，它是一个简化的血液样本数据，或者说ppm。注意，我说过，行代表细胞，列代表基因，所以
	约 8000 列和 100
	行，也就是单元格。你几乎到处都能看到这些零。我相信在这个特定的数据集中，零的稀疏度超过了90%。
	那么，JMP Genomics 10 中全新的单细胞 RNA 测序工作流程究竟包含哪些内容呢？为了构建这个工作流程，我们尝试
	对于那些技术背景不太好或没有时间学习编程和统计信息的人来说，我们把这些步骤按正确的顺序排列，以便用户自动执行工作流程中的其他步骤。此外，我们还
	提供高度交互式的报告，帮助用户与我们一起导航、更改参数并检查不同的选择。
	那么这个工作流程包括什么，包括数据导入进度、预处理，以及我们有一个可变基因选择方法，这实际上是这个工作流程的支柱。
	因此，对于变量基因选择，该方法的目标是降低基因的维度。
	因为对于人类样本，我们有3万个基因，但并非所有基因都具有信息量。所以我们尽量挑选信息量最大的基因。
	分散法和
	基于最低回归的变异稳定变换方法。我不会深入探讨细节，但这两种方法在研究界被广泛使用，我很高兴我们能够复现它们。
	我们还应用了稀疏奇异值分解 (SVD) 来进一步降低维度。因此，我们还应用了层次聚类和 AK 均值聚类。
	我们使用 JMP 中的提升森林方法进行特征重要性筛选，如果您安装了 R 包，我们将直接调用 T-SNE 和 UMAP 可视化
	这在单细胞RNA测序分析中非常流行。我们还提供了一些动态可视化功能，包括小提琴图、脊线图和dop图；我们也进行差异基因表达分析。因此，所有报告都将与JMP项目集成，形成一个高度集成的报告。
	接下来我会做一个演示。这个演示有两个目标。第一个目标是对这个PBMC数据集中的细胞群体进行分类。我们试图找出这个数据集中的细胞类型。第二个目标是识别不同亚型和不同疾病条件下差异表达的基因。
	首先，我们来看一下 JMP Genomics Starter。JMP Genomics 的界面看起来与常规 JMP 有很大不同，但是
	导航非常方便。如果你想了解工作流程的基础知识
	基本的单细胞RNA测序工作流程就在这里，点击一下就可以调出这个界面。界面非常直观。你只需要提供一个数据集。
	然后指定质控选项。您需要移除哪些类型的基因或细胞，以及选择哪些可变基因。您想使用哪种方法？如果您选择 VST，您还可以指定要保留的基因数量，2000 或 3000。
	还有聚类选项，对，你想用多少个主成分进行聚类，
	你想要分层聚类算法还是 K 均值聚类算法？选择更多，我们有标记基因
	帮助您添加用于识别细胞群体的标记基因列表，这是一个非常方便的工具。您可以启动方差分析和差异表达分析。所以这是一份单独的报告。
	我不会在这次演讲中讨论这个问题。我们之前提到的另一个例子是实验。如果你补充一下，基本上你可以提供任何与初始设计相关的信息，比如治疗信息，
	性信息。所以这是
	这里的模拟数据。我只是想向你们展示如何比较不同组间的基因表达水平和不同的测量值。
	最后，我们提供嵌入选项，如果您安装了 t-SNE 或 UMAP R 包，可以调用它们。您可以根据我们的算法更改不同的参数。
	指定完所有选项后，运行程序，就会得到类似这样的报告。这是
	表格报告。此报告共有七个选项卡。我按照您想要的顺序排列它们
	有多少个基因
	在细胞中，有多少读取计数或数据中线粒体基因计数的百分比是多少，以及这三个测量值之间的相关性。
	你注意到左侧有一个操作框。你可以展开它，找到里面的选项，在这个框里你可以做很多事情。
	在这个选项卡中，您可以根据实验设计文件中提供的条件来拆分图表。例如，我们可以进行一个处理，然后拆分
	药物1，药物2，安慰剂。然后你就可以看看不同组之间是否存在差异，对吧，如果你想回到我们最初的图，我们可以取消分割。
	第二个标签是可变基因选择，这是整个工作流程的核心。红点表示我选择进行后续分析的基因，这些
	灰点是将在分析中丢弃的基因。如果你展开操作框，你会看到，由于我们使用了 VST，我们指定了 2000 个基因
	在这个分析中。但如果你改变主意了，你可以，无论何时改变主意，你都可以输入不同的基因数量，然后点击“确定”。这样所有标签页都会根据这个新数字刷新。
	因此，在有了可变基因列表之后，您要做的就是通过执行稀疏 SVD 分析来进一步降低维度，这相当于主成分分析。
	因此，在应用SVD分析后，您可以绘制出前两个SVD或主成分。尝试检查数据集的整体结构。
	在这个例子中，我们可以看到这个数据集中有两个大组，这很有趣。我们还提供了一个 3D 图表，方便您进一步探索。
	你的数据。有时，有些见解你无法在二维图中识别；三维图有时确实可以提供额外的价值。
	我们有这些 SVD，根据你选择的数量（20 或 30），你可以使用它们来
	执行聚类分析。在本例中，我们选择了层次聚类，并在数据集中找到了 9 个聚类。
	除了树状图，我们还提供星座图
	我非常喜欢这个图，因为它和 t-SNE 或 UMAP 很相似。它能让你更好地了解不同组之间的距离，对吧？
	例如，有三个组，大组，三个集群
	与其他群体有点不同。如果你想看看它们在整体结构中的位置，这是我检测到的前三个集群。看看3D图，我们可以看到
	所有那些高亮的都在这里。然后再回到二维，这是两个大集群之一，你知道，我之前说过我高亮了，所以它的交互性真的能帮助你
	以多种方式观察和可视化您的数据。我们还提供平行图，帮助您进一步识别不同组之间的差异模式。
	下一个选项卡是嵌入，如果你安装了 R 包，这意味着 t-SNE 和 UMAP 部分。我会
	调用 R，运行分析，然后返回数据并在 JMP 中可视化。这是 t-SNE 图。我们得到了九个聚类，它们被很好地分离了。
	底部是完全相同的图，但这次我用你提供的标记基因进行了着色；我们有14个标记基因。因此，你可以使用此功能切换到点击浏览
	看看这些基因在哪里表达，对吧？比如，有一个GNLY基因在这个小簇中高度表达，我们想知道，我们的数据是什么？我们选中并回溯，现在我们可以看到所有数据，它们大部分来自簇9，簇8。
	所以GNLY是NK细胞的一个基因。这是NK细胞的标记基因。现在我们知道这个细胞群是什么样的了，对吧。
	这里还有操作按钮，帮您做更多事情。如果您想切换到 UMAP，或者您喜欢 UMAP，也可以。现在图表已经关联到 UMAP 了。
	完全一样，但 UMAP 确实能提供更好的分离效果，并且可以在可视化中保留更全局的结构。此外，我们还可以提供一些方法，帮助您移除可能
	被污染或存在一些质量问题。例如，我们不喜欢这里的一组细胞，可以将它们从可视化中移除。让它更干净，但你随时可以将它们重新添加回来。
	再次，我们可以拆分图表，这是一个拆分图表按钮。这次，我们可以按性别拆分，例如按女性、男性拆分。对，我们可以比较不同性别组的基因表达水平，这有时非常有用。
	我们分裂了。
	下一个选项卡为您提供了更多可视化工具，用于可视化九个基因表达水平
	组，九个组单元，对吧。所以第一部分叫做小提琴图。同样，我们有一个功能切换器可以帮助你浏览
	所有这些基因都在不同的簇中，对吧？现在你可以看到，这取决于图谱中各部分的高度和密度。
	你可以清楚地看到这些基因在哪里高度表达。例如，我们再次举例说明，我使用这个基因GNLY，你可以看到它在第八个簇中高度表达。
	中间我们提供的第二个图是山脊图。山脊图组织了
	Y轴表示聚类，X轴表示基因表达水平。但它基本上会提供类似的结果，具体取决于你的喜好。
	例如，GNLY，我们再次看到集群八具有通过结或其他集群高度表达的 GNLY。
	底部还有另一个图，叫做点图。这是我们刚刚添加到报告中的新图。除了显示基因表达水平外，点图还可以显示表达该基因的细胞百分比。例如，看看这个，
	PPBP基因。我们可以看到，在第七组细胞中，100%的细胞都表达了PPBP基因。所以这个基因是
	实际上是 PPBP 细胞。现在很清楚，簇 7 是一种血细胞，即 PPBP 细胞，他们会观察其他细胞，例如簇 2。
	只有12%的细胞表达这个基因。所以可能存在一些污染，但这组细胞肯定不是PPBP细胞。这张图只是显示
	每个簇中的表达水平和表达百分比为图提供了额外的信息。
	下一个标签也非常有用。它被称为特征筛选。我使用了一种衰减增强森林算法，然后利用这些基因来预测聚类。因此，对细胞分离有贡献的最重要的基因已在这张表中进行了排序。
	查看这些基因的正确方法是打开这个操作框。选择您想要可视化的前 35 个基因，然后点击“确定”。
	下一个标签只会显示你选择的35个基因。这些基因大多是有用的。对。它们可以解释
	为什么这些不同的细胞群会被分开。所以，我们只需切换，或者你可以点击查看，试着看看其中的模式。然后如果你注意到，有很多基因 LYZ，
	CST3 和 NKG7。这些基因已经存在于标记基因中或已提供，这意味着该特征筛选
	这种方法非常有效地从数据集中挑选出最重要的基因。另外，你可以通过 GTEx 数据库进行可视化。GTEx 是一个组织特异性数据库。
	告诉你哪些基因在你体内的哪些组织中表达。这样我们就可以直接将基因列表发送到数据库。你只需点击“确定”。我们将打开
	网站和GTEx网站会提供热图，对，上面列出了排名前35位的基因。现在你可以看到我在这两种人体组织和器官中表达的位置，这非常方便查看更多信息。
	现在我们有了这些标记基因，你大概就能识别出它们属于哪一类细胞了。所以有一个
	这里有个函数叫做“重新编码”。它的作用是，你打开它，就可以把这些数字重新编码成实际的细胞名称。比如，8，我们已经知道是NK细胞。我们可以……我已经给每个细胞都取好了名字。所以我只需输入
	那些
	单核细胞。
	两个实际上是 DC 细胞；三个是 FCGR3A+ 单核细胞。
	这些是幼稚 CD+ T 细胞。
	第五组记忆 CD4+ T 细胞。
	和 CD8+ T
	Meijian Guan
Meijian Guan	对于第六组，第七个是 PPBP，正如我们已经看到的，第九个是 B 细胞。
	有了这些重新编码，我们点击“重新编码”。现在，由于所有图表和标签都已连接，您可以发现所有数字都已更改为实际的单元格名称。这只是为了帮助您探索数据
	很容易，对吧。你可以知道这些细胞在哪里，然后你就可以在你的图上和图内进行一些探索。再说一次，包括这个聚类图，你可以看到自定义名称已经变成了实际的细胞名称。嗯，所以
	今天的主题就到这里。如果您有任何疑问，可以给我发邮件或在 JMP 社区留言。非常感谢您的宝贵时间。

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