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JMP®プロジェクトによるシングルセルRNAシーケンスワークフローの構築（2020-US-30MP-603）

SAS、JMPリサーチ統計開発者、Meijian Guan

シングルセルRNAシーケンス技術（scRNA-seq）は、細胞の違いをより高解像度で捉え、微小環境における個々の細胞の機能をより深く理解することを可能にします。最近では、個々の免疫細胞の転写変化を特徴づけることで、COVID-19と闘うために使用されています。しかし、高次元性、スパース性、細胞集団間の異質性の違いにより、データの視覚化と分析において新たな課題も生じています。JMPプロジェクトは、データテーブル、レポート、スクリプト、外部ファイルを整理するための新しい方法です。このプレゼンテーションでは、JMPプロジェクトを使用して、scRNA-seqデータセットで標準的な探索を実行する統合された基本的なscRNA-seqワークフローを作成する方法を紹介します。まず、分散法または分散安定化変換（VST）法を使用して、変動の大きい遺伝子のセットを選択します。次に、スパースSVD分析を実行することで、データの次元とスパース性をさらに削減します。その後、データ概要、変数遺伝子プロット、階層的クラスタリング、特徴量重要度スクリーニング、そして個々の遺伝子発現レベルにおける動的バイオリンプロットで構成されるインタラクティブなレポートを生成します。さらに、適切なRパッケージがインストールされている場合は、JMPのR統合機能を利用して、細胞集団のt-SNEまたはUMAP可視化を実行します。

自動生成されたトランスクリプト...

スピーカー	トランスクリプト
メイジアン・グアン	さあ、皆さんこんにちは。このプレゼンテーションにご参加いただき、誠にありがとうございます。自分の研究成果を皆さんに共有できる機会をいただき、大変嬉しく思っています。
	JMPライフサイエンスグループとSAS Instituteと共同で取り組んできた成果です。本日のトピックは、JMP Projectを使ったシングルセルRNAシーケンスワークフローの構築です。これはJMP Genomics 10で開発した新機能です。JMP Genomicsが何なのかご存じない方のために、簡単にご説明します。
	JMPプロジェクトの概要とJMPプロジェクトは14日にリリースされた新機能で、レポートの整理に役立つ非常に優れたツールです。そこで私たちは、この新しいプラットフォームを活用して、シングルセルRNAシーケンシングを整理しました。
	ワークフローを組み込むことです。まずはJMPについて少し背景を説明したいと思います。JMP Genomicsは
	JMPファミリーの製品の一つは、SASとJMP Proをベースに構築されています。そのため、両製品のメリットを活かした非常に強力な分析ツールとなっています。
	これはゲノムデータ用に設計されており、さまざまな種類のゲノムデータを読み取り、前処理を行い、次世代シーケンシングの分析を処理できます。
	遺伝子発現の差異やバイオマーカーの発見に非常に優れており、多くの科学者が作物や家畜の育種に使用しています。非常に強力なツールです。ゲノミクス関連の研究に携わっている方は、ぜひ一度お試しください。
	次にご紹介したいのは、シングルセルRNAシーケンシングです。皆さんの中には、あまり馴染みのない方もいらっしゃるかもしれません。
	これは、個々の細胞レベルでそれを調べるために使用される比較的新しい技術です。
	そして、調査対象の細胞群の平均発現レベルである従来の RNA シーケンシング技術と比較します。
	この新しい技術により、細胞の違いをより高解像度で観察できるようになり、微小環境における個々の細胞の機能をより深く理解できるようになります。
	また、新規かつ希少な細胞集団の発見、細胞発達の軌跡の追跡、細胞種間で発現が異なる遺伝子の特定など、様々なことに役立ちます。そのため、非常に幅広い応用が可能です。
	最近の応用例の一つは、科学者がCOVID-19と戦うためにそれを使用していることです。
	免疫細胞における転写変化の特徴づけ、そしてワクチンや治療法の開発に役立てています。さらに、がん研究や免疫学、その他多くの研究分野でも広く利用されています。つまり、非常に強力なツールなのですが、
	そのデータを分析するにはいくつかの課題があるため、このワークフローを作成しました。
	シングルセルRNAシーケンシングの主要部分の概要を説明したいと思います。まずサンプルを入手する必要があります。
	ヒトまたは動物由来のものです。腫瘍や実験室サンプルなどです。そして、それらのサンプルを個々の細胞に分離することができます。
	分離後、すべての遺伝子について個々の細胞ごとにシーケンシングを行うことができます。例えば、ヒトには約3万個の遺伝子があります。最終的な結果は、リードカウントテーブルでこのようになります。3万個の遺伝子が列になって並んでおり、
	列には約50万個のセルが含まれます。ご覧のとおり、これらの非常に大規模なデータセットは非常に高い次元数を持っています。また、表にゼロがあることにもお気づきでしょうか。
	技術的または生物学的な限界のため、すべての細胞のすべての遺伝子を検出することは不可能です。そのため、細胞の90%が実際には
	ゼロです。つまり、非常にスパースです。スパース性は、単一細胞RNAシーケンスデータを解析する際のもう一つの課題です。
	しかし、前処理、クリーンアップ、次元削減を行った後、このデータにクラスタリングや主成分分析、遺伝子発現差解析といった通常の手法を適用できます。これらについては、私のワークフローで詳しく説明します。
	すでに述べたように、高次元性、高スパース性、そして細胞集団間でのさまざまな異質性などの課題に気づきました。
	非常に多くの異なるシーケンス プロトコルと分析パッケージが存在するため、技術的なノイズと再現性の問題が生じます。
	RやPythonなどのツールでは、データを分析するための正確な手順に従うのは非常に困難です。手順を間違えたり、正しい順序で実行しなかったりすると、
	再現性のある結果が得られない可能性があります。これが、私たちがここで解決しようとした問題の一つです。
	シングルセルRNAシーケンシングデータの例をお見せしたいと思います。このデータは私のデモで使用します。これは還元血液サンプルデータ、つまりppmです。細胞は行に、遺伝子は列に並んでいると言いましたね。
	約8000本の柱と100本の
	行、つまりセルのことです。そして、ほぼどこにでもゼロが見られます。この特定のデータセットでは、スパース性の90%以上を占めていると思います。
	JMP Genomics 10の新しいシングルセルRNAシーケンスワークフローには何が含まれていますか？このワークフローでは、
	技術的な知識があまりない人や、コーディングや統計を学ぶ時間がない人にとっては、このワークフローは大きな問題です。そこで、このワークフローでは、これらのステップを適切な順序で配置することで、ユーザーがワークフロー内の他のステップを自動的に実行できるようにしています。また、
	非常にインタラクティブなレポートを提供して、ユーザーがナビゲートしてパラメータを変更し、さまざまな選択を確認できるようにします。
	このワークフローには、データのインポートの進行状況、前処理、そしてこのワークフローのバックボーンとなる可変遺伝子選択方法など、何が含まれていますか。
	したがって、この方法の目標は、可変遺伝子選択において、遺伝子の次元を削減することです。
	ヒトのサンプルには3万個の遺伝子があり、そのすべてが有益な情報をもたらすわけではありません。そのため、最も有益な遺伝子を選ぶようにしています。
	分散法と
	最小回帰に基づく変動安定化変換法です。詳細については触れませんが、この2つの手法は研究コミュニティで広く使用されており、再現できたことを大変嬉しく思います。
	さらに次元を削減するために、スパースSVDも適用しました。また、階層的クラスタリングとAK平均法クラスタリングも適用しました。
	JMPではブースティングフォレスト法を用いた特徴量重要度スクリーニングを行っており、Rパッケージがインストールされている場合は、T-SNEとUMAPの視覚化を直接呼び出すことができます。
	これはシングルセルRNAシーケンシング解析で非常に人気があります。また、バイオリンプロット、リッジラインプロット、DOPプロットといった動的な可視化機能も提供しています。さらに、遺伝子発現差の解析も可能です。すべてのレポートはJMPプロジェクトと統合された形で提供されます。
	それでは次にデモを行います。このデモには2つの目標があります。1つ目は、このPBMCデータセット内の細胞集団を分類することです。このデータセットに含まれる細胞の種類を特定します。2つ目の目標は、サブタイプと条件間で発現が異なるジーンズを特定することです。
	まず、JMP Genomics Starterを見てみましょう。JMP Genomicsのインターフェースは通常のJMPとはかなり異なりますが、
	操作はとても簡単です。ワークフローの基本を知りたい場合は
	基本的なシングルセルRNAシーケンシングワークフローはここにあります。クリックするとこのインターフェースが表示されます。インターフェースは非常に直感的です。データセットを提供するだけで済みます。
	QCオプションを指定します。解析や遺伝子選択において、どのような遺伝子や細胞を除去したいか、どの手法を使用するかを指定します。VSTを選択した場合は、保持したい遺伝子の数（2000個または3000個）も指定できます。
	クラスタリングのオプション、つまりクラスタリングに使用する主成分の数と
	階層的クラスタリングアルゴリズムかK平均クラスタリングアルゴリズムのどちらかを選択します。選択肢が増えると、マーカー遺伝子も表示されます。
	細胞集団の同定に使用したいマーカー遺伝子のリストを追加するのに役立ちます。これは非常に便利なツールです。また、分散分析（ANOVA）と差次的発現解析も実行できます。これは別のレポートです。
	この講演ではこれについては触れません。もう一つ、実験例がありましたよね。これを追加すると、基本的に、治療情報など、開始設計に関連するあらゆる情報を提供できるようになります。
	性別に関する情報です。これは
	ここにシミュレーションデータがあります。グループ間の遺伝子発現レベルと様々な測定値をどのように比較するかをお見せしたいと思います。
	最後に、t-SNEまたはUMAP Rパッケージ（インストールされている場合）を呼び出す埋め込みオプションがあります。この埋め込みオプションでは、アルゴリズムに合わせて様々なパラメータを変更できます。
	これらすべてのオプションを指定したら、実行するだけで、このようなレポートが表示されます。
	表形式のレポートです。このレポートには合計7つのタブがあります。必要な順に並べました。
	遺伝子の数
	細胞内の読み取りカウント数はいくつですか、データ内のミトコンドリア遺伝子カウントの割合はどれくらいですか、そしてこの 3 つの測定値間の相関関係はどれくらいですか。
	左側にアクションボックスがありますね。展開するとオプションが表示され、このボックスで様々な操作を行うことができます。
	このタブでは、実験計画ファイルで指定した条件に基づいてグラフを分割できます。例えば、ある処理を行って、
	薬剤1、薬剤2、プラセボ。これで、各グループ間に差があるかどうかを確認できます。元のプロットに戻りたい場合は、分割を解除することもできます。
	2つ目のタブは、このワークフローの根幹となる可変遺伝子の選択です。赤い点は、後続の解析のために選択した遺伝子です。
	灰色の点は解析で除外される遺伝子です。アクションボックスを展開すると、VSTを使用しているため、2000個の遺伝子を指定していることがわかります。
	この分析では、遺伝子の数を変更する必要はありません。もし気が変わったら、いつでも別の遺伝子数を入力して「OK」をクリックできます。すると、すべてのタブがこの新しい数に基づいて更新されます。
	したがって、変数遺伝子のリストができたら、主成分分析に相当するスパース SVD 分析を実行して次元をさらに削減します。
	SVD分析を適用した後、上位2つのSVD、つまり主成分をプロットすることができます。データセット全体の構造を確認してみてください。
	この場合、データセットには2つの大きなグループがあることがわかります。これは興味深いことです。さらに詳しく調べるために、3Dプロットも用意しています。
	データを分析します。2Dプロットでは特定できない洞察が得られる場合もありますが、3Dプロットでは新たな価値が得られる場合もあります。
	そして、これらのSVDは、選択した数（20または30）に応じて、次のように使用できます。
	クラスタリングを実行します。今回は階層的クラスタリングを選択し、データセット内に9つのクラスターが見つかりました。
	樹形図に加えて、星座図も提供しています
	このプロットはt-SNEやUMAPに似ているので、とても気に入っています。異なるグループ間の距離をより正確に把握できますよね。
	例えば、3つのグループ、大きなグループ、3つのクラスターがあります
	他のグループとは明らかに異なります。これらが全体構造の中でどこに位置しているかを確認したい場合は、私が検出した上位3つのクラスターをご覧ください。3Dプロットを見れば、
	ハイライトされているものはすべてここにあります。そして2Dに戻ってください。これは先ほどハイライトした2つの大きなクラスターのうちの1つです。インタラクティブ性によって、
	データを複数の方法で観察・視覚化できます。また、異なるグループ間の異なるパターンをさらに特定するのに役立つ並列プロットも提供しています。
	次のタブは埋め込みです。Rパッケージがインストールされている場合は、t-SNEとUMAPのパーツが含まれます。
	Rを呼び出して分析を実行し、データをJMPに取り込んで可視化します。これがt-SNEプロットです。9つのクラスターがきれいに分離されています。
	下のグラフは全く同じですが、今回はご提供いただいたマーカー遺伝子で色付けしました。マーカー遺伝子は14個あります。この機能を使えば、クリックして切り替えることができます。
	これらの遺伝子がどこで発現しているかを確認するためです。例えば、この小さなクラスターで高発現しているGNLY遺伝子があります。このデータはどうなっているのでしょうか？選択して戻ると、ほとんどがクラスター9とクラスター8のものであることがわかります。
	GNLYはNK細胞の遺伝子です。これはNK細胞のマーカー遺伝子です。これで、この細胞群がどのようなものなのかが分かりましたね。
	また、ここにはアクションボタンがあり、より多くの操作を行うことができます。UMAPに切り替えたい場合は、そちらをご利用ください。これで、プロットがUMAPに関連付けられました。
	全く同じことですが、UMAPの方が少しだけ分離が良く、視覚化においてより全体的な構造を保持できます。また、不要なセルを削除する方法もいくつか提供しています。
	汚染されていたり、品質に問題があったりする場合もあります。例えば、ここにあるセルの集まりが気に入らない場合は、視覚化から削除できます。視覚化をよりクリーンにすることができますが、いつでも元に戻すことができます。
	グラフを分割することもできます。これはグラフ分割ボタンです。今回は性別、つまり女性と男性で分割できます。性別グループ間で遺伝子発現レベルを比較できるので、非常に便利です。
	そして私たちは分裂した。
	次のタブでは、9つの遺伝子発現レベルを視覚化するための視覚化ツールがさらに提供されています。
	グループ、9つのグループセルですね。最初の部分はバイオリンプロットと呼ばれます。ここでも、機能スイッチャーを使って操作できます。
	全ての遺伝子が異なるクラスターに分かれていますね。グラフ上の各部分の高さや密度がどのようになっているかが分かります。
	これらの遺伝子が高発現している場所が明確にわかります。例えば、GNLYという遺伝子を例に挙げると、クラスター8で高発現していることがわかります。
	そして真ん中に、私たちが提供している2つ目のプロットはリッジラインプロットです。リッジラインプロットは、
	Y軸にクラスター、X軸に遺伝子発現レベルが表示されます。基本的には、好みに応じて似たようなものが表示されます。
	たとえば、GNLY の場合、クラスター 8 には、knot や他のクラスターによって高度に発現されている GNLY があることがわかります。
	一番下にはドットプロットと呼ばれる別のプロットがあります。これはこのレポートに追加された新しいプロットです。遺伝子発現レベルを示すだけでなく、ドットプロットではその遺伝子を発現している細胞の割合も表示できます。例えば、ここを見てください。
	PPBP遺伝子です。このクラスター、つまりクラスター7では、クラスター7の細胞の100%がこのPPBP遺伝子を発現していることがわかります。つまり、この遺伝子は
	実際にはPPBP細胞です。クラスター7は血液細胞の一種で、PPBP細胞であることが非常に明確になりました。そして、例えばクラスター2のような他の細胞も見ていきます。
	この遺伝子を発現している細胞はわずか12%です。そのため、多少の混入はあるかもしれませんが、この細胞群は間違いなくPPBP細胞ではありません。このグラフは、
	各クラスター内の発現レベルと発現パーセンテージは、プロットに追加情報を提供します。
	次のタブも非常に便利です。「特徴スクリーニング」と呼ばれるものです。私はフェーディングブースティングフォレストアルゴリズムを用いて、得られた遺伝子を用いてクラスターを予測しました。この表には、細胞の分離に貢献した最も重要な遺伝子がランク付けされています。
	これらの遺伝子を表示する正しい方法は、このアクションボックスを開くことです。可視化したい遺伝子（上位35個程度）を選択し、「OK」をクリックします。
	次のタブには、選択した35個の遺伝子だけが表示されます。これらが主に情報を提供する遺伝子です。
	なぜこれらの異なる細胞群が分離されているのか、ここでも切り替えるか、クリックしてパターンを確認してみてください。そして、LYZ遺伝子がたくさんあることにお気づきでしょうか。
	CST3とNKG7は既にマーカー遺伝子に含まれているか、提供されているため、この特徴スクリーニングは
	この方法は、データセットの中で最も重要な遺伝子を拾い出すのに非常に効果的です。また、GTExデータベースを使えば可視化も可能です。GTExは組織特異的なデータベースです。
	あなたの体のどの組織でどの遺伝子が発現しているかを教えてくれます。遺伝子リストをデータベースに直接送信できます。「OK」をクリックするだけです。
	ウェブサイトとGTExのウェブサイトでは、上位35個の遺伝子を示すヒートマップが提供されます。これで、これら2つのヒト組織、臓器における発現部位を確認できます。これは、追加情報を確認するのに非常に便利です。
	マーカー遺伝子が使われているので、どの細胞群なのかを特定できると思います。
	ここで使われている関数は「再コード」と呼ばれています。これを開くと、数字を実際の細胞名に再コードできます。例えば、8はNK細胞だと既に分かっています。そして…それぞれに名前が既にあります。それで、次のように入力するだけです。
	それらの
	単球。
	2 つ目は実際には DC 細胞であり、3 つ目は FCGR3A+ 単核細胞です。
	これらはナイーブ CD+ T 細胞です。
	グループ 5 メモリー CD4+ T 細胞。
	そしてCD8+T
	メイジアン・グアン
メイジアン・グアン	グループ 6 は、すでに見たように 7 番目は PPBP、9 番目は B 細胞です。
	再コードをクリックすると、すべてのプロットとタブが接続され、すべての数値が実際のセル名に変わっているのが分かります。これで、データをより詳しく調べることができます。
	簡単にできますね。これらのセルがどこにあるのかが分かり、プロット上でも探索が可能です。また、このクラスタリングプロットでは、カスタム名が実際のセル名に変更されているのが分かります。
	本日は以上です。ご質問がありましたら、メールまたはJMPコミュニティにメッセージをお寄せください。お時間をいただき、ありがとうございました。

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