| Oratore |
Trascrizione |
| Meijian Guan |
Bene. Ciao a tutti. Grazie mille per aver partecipato a questa presentazione. Sono così felice di avere questa opportunità di condividere il lavoro che ho svolto. |
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Ho lavorato con il gruppo JMP Life Science e il SAS Institute. L'argomento di oggi sarà la creazione di un flusso di lavoro per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula con JMP Project. Questa è una nuova funzionalità che ho sviluppato per JMP Genomics 10. Se non sapete cos'è JMP Genomics, ve ne darò una breve descrizione. |
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Una panoramica su di esso e sul progetto JMP è una nuova funzionalità, rilasciata il 14, ed è uno strumento molto utile che può aiutarti a organizzare i tuoi report. Abbiamo quindi sfruttato questa nuova piattaforma e organizzato un sequenziamento dell'RNA a singola cellula. |
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flusso di lavoro al suo interno. Quindi, prima di tutto, voglio solo darvi un po' di informazioni di base su JMP, JMP Genomics è |
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Uno dei prodotti della famiglia JMP è basato su SAS e JMP Pro. Sfrutta quindi i vantaggi di entrambi i prodotti, il che lo rende uno strumento analitico molto potente. |
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È progettato per i dati genomici, quindi può leggere diversi tipi di dati genomici, può effettuare la pre-elaborazione, può gestire il sequenziamento di nuova generazione e l'analisi. |
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È davvero efficace nell'espressione genica differenziale e nella scoperta di biomarcatori, e molti scienziati lo utilizzano per la selezione di colture e bestiame. È quindi uno strumento molto potente. Incoraggio tutti a provarlo se vi occupate di genomica. |
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La prossima cosa che voglio condividere con voi è il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Molti di voi potrebbero non averne molta familiarità. |
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Si tratta quindi di una tecnologia relativamente nuova utilizzata per esaminare questo aspetto a livello di singole cellule. |
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E confrontandolo con la tradizionale tecnologia di sequenziamento dell'RNA, che consiste nell'indagine, il livello medio di espressione di un gruppo di cellule. |
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Questa nuova tecnologia fornisce una risoluzione più elevata delle differenze cellulari e consente di comprendere meglio la funzione della singola cellula nel contesto del suo microambiente. |
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E può aiutare a fare molte cose, come scoprire popolazioni cellulari nuove e rare, tracciare le traiettorie dello sviluppo cellulare e identificare geni espressi in modo differenziale tra i diversi tipi di cellule. Quindi ha un'applicazione molto ampia. |
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Un'applicazione recente è quella degli scienziati che lo usano per combattere il Covid 19, quindi perché può essere utilizzato per |
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caratterizzare i cambiamenti trascrizionali nelle cellule immunitarie e come sviluppare vaccini e trattamenti. Inoltre, è ampiamente utilizzato nella ricerca sul cancro, in immunologia e in molti altri campi di ricerca. Quindi, è uno strumento molto potente, ma |
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L'analisi di tali dati presenta alcune difficoltà, ecco perché abbiamo messo a punto questo flusso di lavoro. |
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Volevo solo darvi una panoramica della parte principale del sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Quindi la prima cosa di cui avete bisogno è ottenere un campione, |
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sia da esseri umani che da animali. Potrebbe trattarsi di un tumore o di un campione di laboratorio. E poi è possibile isolare quei campioni in singole cellule. |
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Quindi, dopo aver isolato, è possibile sequenziare ogni singola cellula per tutti i geni presenti. Ad esempio, negli esseri umani abbiamo circa 30.000 geni. Quindi il prodotto finale apparirà così nella nostra tabella di conteggio delle letture. Abbiamo geni... 30.000 geni in righe e abbiamo |
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Circa mezzo milione di celle come colonne. Come potete vedere, la dimensione di questo set di dati molto ampio è molto elevata. Potete anche notare gli zeri nella tabella perché |
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A causa di limitazioni tecniche o biologiche, non è possibile rilevare ogni singolo gene in ogni singola cellula. Quindi non è raro vedere che il 90% delle cellule sono effettivamente |
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zeri. Quindi è molto scarso. La scarsità è un'altra sfida quando si analizzano i dati di sequenziamento dell'RNA di singole cellule. |
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Ma dopo aver eseguito la pre-elaborazione, la pulizia e la riduzione delle dimensioni, è possibile applicare a questi dati analisi standard, come il clustering e le componenti principali, e analisi dell'espressione genica differenziale. Queste saranno quindi menzionate nel mio flusso di lavoro. |
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E ho già accennato a questo, ovvero che ho notato delle sfide, tra cui un'elevata dimensionalità, un'elevata scarsità e anche una diversa eterogeneità tra le popolazioni cellulari. |
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Rumori tecnici e riproducibilità, poiché esistono così tanti protocolli di sequenziamento diversi e così tanti pacchetti analitici diversi. |
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In R, Python o altri strumenti, è molto difficile seguire i passaggi esatti per analizzare i dati. E se si confondono i passaggi e non si esegue il tutto nell'ordine corretto, |
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Potresti non essere in grado di ottenere risultati riproducibili. Questo è uno dei problemi che abbiamo cercato di risolvere qui. |
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Voglio solo mostrarvi un esempio di dati di sequenziamento dell'RNA di una singola cellula. Questi dati saranno utilizzati nella mia dimostrazione e si tratta di dati di campioni di sangue ridotti, o ppm. Vedete, ho detto che abbiamo le cellule in righe e i geni in colonne, quindi è |
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circa 8000 colonne e 100 |
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Righe, il che significherebbe celle. E puoi vedere quegli zeri praticamente ovunque. Credo che la scarsità in questo specifico set di dati sia superiore al 90%. |
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Quindi, cosa c'è nel nostro nuovo flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a singola cellula in JMP Genomics 10? Quindi, per questo flusso di lavoro, abbiamo cercato di costruirlo |
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Per coloro che non hanno una solida preparazione tecnica o non hanno tempo per imparare a programmare e a gestire tutte quelle statistiche, in questo flusso di lavoro abbiamo messo questi passaggi nell'ordine corretto in modo che gli utenti possano eseguire automaticamente gli altri passaggi del flusso di lavoro. E inoltre |
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forniamo report molto interattivi per aiutare gli utenti a navigare con noi, modificare i parametri e verificare le diverse selezioni. |
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Quindi cosa c'è in questo flusso di lavoro, incluso lo stato di avanzamento dell'importazione dei dati, la pre-elaborazione e abbiamo un metodo di selezione genica variabile, che in realtà è la spina dorsale di questo flusso di lavoro. |
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Quindi, per la selezione genica variabile, l'obiettivo di questo metodo è quello di ridurre una dimensione dei geni. |
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Poiché per il campione umano abbiamo 30.000 geni e non tutti sono informativi, cerchiamo di scegliere quelli più informativi. |
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metodo di dispersione e |
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Metodo di trasformazione stabilizzante della variabilità basato sulla regressione minima. Non entrerò quindi nei dettagli, ma questi due metodi sono ampiamente utilizzati nella comunità scientifica e sono molto contento che siamo riusciti a riprodurli. |
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Applichiamo anche SVD sparse per ridurre ulteriormente le dimensioni. Abbiamo quindi applicato anche il clustering gerarchico e il clustering ak. |
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Eseguiamo uno screening dell'importanza delle funzionalità utilizzando un metodo di foresta di boosting in JMP e se hai installato pacchetti R, veniamo direttamente richiamati per la visualizzazione T-SNE e UMAP |
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che è molto popolare utilizzando l'analisi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Abbiamo anche fornito alcune visualizzazioni dinamiche, tra cui il grafico a violino, il grafico a cresta, il grafico Dop; eseguiamo anche l'espressione genica differenziale. Quindi tutti i report saranno organizzati in un ambiente altamente integrato con il progetto JMP. |
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Quindi ora farò una demo. Questa demo ha due obiettivi. Il primo è classificare le popolazioni cellulari in questo set di dati PBMC. Cerchiamo di scoprire quali sono i tipi cellulari in questo set di dati. Il secondo obiettivo è semplicemente identificare i jeans differenzialmente espressi nei diversi sottotipi e condizioni. |
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Quindi, prima di tutto, andiamo allo starter di JMP Genomics. L'interfaccia di JMP Genomics è piuttosto diversa da quella normale di JMP, ma |
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è piuttosto facile da navigare. Se vuoi trovare le basi dei flussi di lavoro |
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e il flusso di lavoro di base per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è qui: cliccandoci sopra si apre questa interfaccia. L'interfaccia è piuttosto intuitiva. Direi che basta fornire un set di dati. |
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E si specificano le opzioni di controllo qualità. Quali, quali tipi di geni o cellule si desidera rimuovere per l'analisi e le selezioni di geni variabili. Quale metodo si desidera utilizzare, giusto? Se si seleziona un VST, è anche possibile specificare il numero di geni che si desidera mantenere, 2000 o 3000. |
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E le opzioni di clustering, giusto, quanti componenti principali vuoi usare per il clustering e |
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o vuoi algoritmi di clustering gerarchici o k significa. E più opzioni abbiamo, più geni marcatori |
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Per aiutarti ad aggiungere un elenco di geni marcatori che vuoi utilizzare per identificare le popolazioni cellulari, uno strumento molto utile in questo caso. Puoi anche avviare l'ANOVA e l'analisi dell'espressione differenziale. Quindi questo è un report separato. |
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Non ne parlerò in questa conferenza. Un altro aspetto che abbiamo analizzato è l'esempio di un esperimento, giusto? Se aggiungiamo questo, possiamo fornire qualsiasi informazione relativa alla progettazione iniziale, come le informazioni sul trattamento, |
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informazioni sul sesso. Quindi questo è |
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i dati simulati qui. Vorrei solo mostrarvi come confronteremo i livelli di espressione genica e le diverse misurazioni tra i gruppi. |
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Infine, abbiamo opzioni di incorporamento che possono richiamare i pacchetti R t-SNE o UMAP, se installati. È possibile modificare diversi parametri per i nostri algoritmi. |
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Quindi, dopo aver specificato tutte queste opzioni, basta andare su Esegui e si ottiene un report simile a questo. Questo è un |
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Rapporto tabulare. Ci sono un totale di sette schede in questo rapporto. Le ho organizzate nell'ordine che preferisci |
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quanti geni ci sono |
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nelle cellule, quanti conteggi di lettura o qual è la percentuale di conteggi dei geni mitocondriali nei tuoi dati e le correlazioni tra queste tre misurazioni. |
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E noi, come vedi, sul lato sinistro abbiamo la casella delle azioni. Puoi espanderla e trovare le opzioni che cerchi, in questa casella puoi fare molte cose. |
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In questa scheda, in particolare, è possibile suddividere il grafico in base alle condizioni specificate nel file di progettazione sperimentale. Ad esempio, possiamo eseguire un trattamento e suddividerlo |
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Farmaco 1, Farmaco 2, placebo. Poi puoi vedere se c'è qualche differenza tra i diversi gruppi, giusto? E possiamo tornare al grafico originale se vuoi. |
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La seconda scheda riguarda la selezione dei geni variabili, che è la spina dorsale di questo flusso di lavoro. I punti rossi indicano i geni che ho selezionato per l'analisi successiva e questi |
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I punti grigi sono i geni che verranno scartati nell'analisi. E se espandi la casella di azione, puoi vedere che, poiché utilizziamo il VST, abbiamo specificato 2000 geni. |
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In questa analisi. Ma se cambi idea, puoi, puoi, ogni volta che cambi idea, digitare un numero diverso di geni e poi cliccare su OK. Quindi tutte le schede verranno aggiornate in base a questo nuovo numero. |
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Quindi, dopo aver ottenuto un elenco di geni variabili, quello che si dovrà fare sarà ridurre ulteriormente le dimensioni eseguendo un'analisi SVD sparsa, che equivale all'analisi delle componenti principali. |
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Dopo aver applicato l'analisi SVD, è possibile tracciare un grafico delle due componenti principali o SVD principali. Provate a verificare la struttura globale del vostro set di dati. |
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Quindi, in questo caso, possiamo vedere che ci sono due grandi gruppi in questo set di dati, il che è interessante. E forniamo anche un grafico 3D per aiutarvi ad approfondire l'argomento. |
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i tuoi dati. A volte ci sono delle informazioni che non puoi identificare in un grafico 2D; i grafici 3D a volte possono davvero fornire un valore aggiunto. |
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E abbiamo quegli SVD, a seconda di quanti ne hai selezionati (20 o 30), puoi usarli per |
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Eseguire il clustering. In questo caso abbiamo selezionato il clustering gerarchico e abbiamo trovato nove cluster nel tuo set di dati. |
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Oltre al dendogramma, offriamo anche un grafico a costellazione |
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Cosa che mi piace molto perché questo grafico è simile a t-SNE o UMAP. Dà un'idea migliore della distanza tra i diversi gruppi, giusto? |
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Ad esempio, ci sono tre gruppi, grandi gruppi, tre cluster |
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In un certo senso, diversi dagli altri gruppi. E se volete vedere dove si trovano nella struttura globale, questi sono i primi tre cluster che ho rilevato. Guardando i grafici 3D, possiamo vedere |
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tutti quelli evidenziati sono qui. E poi torna di nuovo in 2D, questo è uno dei due grandi cluster, sai, che ho detto di aver evidenziato, quindi la sua interattività ti aiuta davvero a |
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Osserva e visualizza i tuoi dati in diversi modi. Forniamo anche un grafico parallelo per aiutarti a identificare meglio i diversi modelli nei diversi gruppi. |
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E la scheda successiva è l'incorporamento, che significa parti t-SNE e UMAP se hai installato il packaging R. Lo farò |
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Chiama R, esegui l'analisi, recupera i dati e li visualizza in JMP. Ecco un grafico t-SNE. Abbiamo nove cluster ben separati. |
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In basso c'è esattamente lo stesso grafico, ma questa volta l'ho colorato con i geni marcatori che hai fornito; abbiamo 14 geni marcatori. Quindi, usando questa funzione, puoi passare alla modalità "clicca". |
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Per vedere dove sono espressi questi geni, giusto. Ad esempio, c'è un gene GNLY, altamente espresso in questo piccolo cluster e ci chiediamo: quali sono i nostri dati? Selezioniamo, torniamo indietro e ora vediamo tutto, la maggior parte proviene dal cluster nove, cluster otto. |
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Quindi GNLY è un gene per le cellule NK. Questo è un gene marcatore per le cellule NK. Ora abbiamo un'idea di cosa sia un gruppo di queste cellule, giusto? |
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E qui abbiamo anche dei pulsanti di azione, che ti aiutano a fare più cose. Se preferisci passare a UMAP, puoi farlo. Ora i grafici sono associati a UMAP. |
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Esattamente la stessa cosa, ma UMAP offre una separazione leggermente migliore e può preservare una struttura più globale nella visualizzazione. E possiamo anche fornire alcuni metodi per aiutarti a rimuovere le celle che potrebbero essere |
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contaminati o presentano problemi di qualità. Ad esempio, se un gruppo di cellule non ci piace, possiamo rimuoverlo dalla visualizzazione. Renderlo più pulito, ma è sempre possibile ripristinarlo. |
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E ancora, possiamo dividere i grafici, tramite il pulsante "Dividi grafico". Questa volta, possiamo dividere per genere, per femmine e maschi. Bene, possiamo confrontare il livello di espressione genica tra i gruppi di genere, il che a volte è molto utile. |
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E siamo divisi. |
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E la scheda successiva ti fornisce più strumenti di visualizzazione per visualizzare i livelli di espressione genica nei nove |
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gruppi, nove celle di gruppo, giusto. Quindi la prima parte è chiamata grafico a violino. Di nuovo, abbiamo un selettore di funzionalità che ti aiuta a scorrere |
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Tutti quei geni in cluster diversi, giusto. Ora puoi vedere, a seconda di come, quanto è alta la parte del grafico e qual è la sua densità. |
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Si può vedere chiaramente dove questi geni sono altamente espressi. Ad esempio, di nuovo, prendiamo come esempio il gene GNLY, che è altamente espresso nel cluster otto. |
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E al centro, il secondo grafico che vi forniamo è il grafico della linea di cresta. Un grafico della linea di cresta organizza il |
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cluster sull'asse Y e il livello di espressione genica sull'asse X. Ma sostanzialmente fornisce qualcosa di simile, a seconda di ciò che ti piace. |
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Ad esempio, GNLY, ancora una volta, possiamo vedere che il cluster otto ha GNLY altamente espresso da knot o altri cluster. |
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In basso abbiamo un altro grafico chiamato "dot plot". Questo è il nuovo grafico che abbiamo appena aggiunto a questo report. Oltre a mostrarvi i livelli di espressione genica, il dot plot può anche mostrarvi la percentuale di cellule che esprimono quel gene. Ad esempio, date un'occhiata a questo punto: |
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Gene PPBP. E possiamo vedere questo cluster, nel cluster sette che abbiamo avuto, possiamo vedere il 100% delle cellule nel cluster sette che esprimono questo gene PPBP. Quindi questo gene è il gene marcatore per |
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In realtà, le cellule PPBP. Quindi ora è molto chiaro che il cluster sette è un tipo di cellula del sangue, che è una cellula PPBP, e ne prendono in esame altre, come ad esempio il cluster due. |
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Solo il 12% delle cellule esprime questo gene. Quindi potrebbe esserci qualche contaminazione, ma questo gruppo di cellule non è sicuramente costituito da cellule PPBP. Quindi questo grafico mostra solo... |
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il livello di espressione e la percentuale di espressione in ciascun cluster, che fornisce informazioni aggiuntive nel grafico. |
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Anche la scheda successiva è molto utile. Si chiama "feature screening". Ho sviluppato un algoritmo di fading boosting forest e ho poi utilizzato i geni per predire i cluster. Quindi, i geni più importanti che hanno contribuito alla separazione delle cellule sono classificati in questa tabella. |
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Il modo corretto per visualizzare questi geni è aprire questa casella di azione. Seleziona i primi 35 geni che desideri visualizzare e clicca su OK. |
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Quindi la scheda successiva ti mostrerà solo i 35 geni che hai selezionato. Quindi questi sono i geni, per lo più informativi. Giusto. Loro, loro possono spiegare |
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Perché questi diversi gruppi di cellule sono separati? Quindi, di nuovo, possiamo semplicemente cambiare, oppure puoi cliccare e provare a vedere gli schemi. E poi, se noti, ci sono molti geni LYZ, |
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CST3 e NKG7. Sono già presenti nei geni marcatori o sono stati forniti, il che significa che questo screening delle caratteristiche |
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Il metodo è davvero efficace per individuare i geni più importanti nel tuo set di dati. Un'altra possibilità è la visualizzazione tramite il database GTEx. GTEx è un database tessuto-specifico. |
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Ti diremo quali geni sono espressi in quale tessuto del tuo corpo umano. Così possiamo inviare direttamente l'elenco dei geni al database. Basta cliccare su OK. Apriremo il |
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Il sito web e il sito GTEx vi forniranno una mappa termica, con i 35 geni principali. Ora potete vedere dove sono espressi in quei due tessuti e organi umani, il che è molto comodo per avere informazioni aggiuntive. |
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Quindi ora che abbiamo quei geni marcatori in uso, probabilmente puoi identificare a quale gruppo di cellule appartengono, giusto? Quindi ce n'è uno |
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La funzione qui si chiama "recode". Quello che fa è che, aprendola, puoi ricodificare quei numeri in nomi di celle effettivi, giusto. Ad esempio, otto sappiamo già che sono celle NK, sono celle NK. E possiamo fare... Ho già i nomi per ognuna di esse. Quindi digito semplicemente |
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Quelli |
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Monociti. |
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Due sono in realtà celle DC; tre sono monociti FCGR3A+. |
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Si tratta di cellule T CD+ naive. |
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Gruppo cinque cellule T CD4+ di memoria. |
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E CD8+ T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
per il gruppo sei; il sette è PPBP, come abbiamo già visto e il nono sono le cellule B. |
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Quindi, con queste ricodificazioni clicchiamo su "Ricodifica". Ora che tutti i grafici e le schede sono collegati, puoi vedere che tutti i numeri sono stati convertiti in nomi di celle effettivi. Quindi ti aiuta a esplorare i tuoi dati in |
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Facilmente, giusto. Puoi sapere dove si trovano quelle celle e puoi di nuovo esplorare i tuoi grafici. E ancora, includendo questi grafici di clustering, vedi, il nome personalizzato è stato cambiato nei nomi effettivi delle celle. Ehm, quindi |
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Questo è tutto per l'argomento di oggi. Se avete domande, potete inviarmi un'e-mail o lasciare un messaggio nella community JMP. Grazie mille per il tempo che mi avete dedicato. |
