| Lautsprecher |
Transkript |
| Meijian Guan |
Alles klar. Ähm, hallo zusammen. Vielen Dank für Ihre Teilnahme an dieser Präsentation. Ich freue mich sehr, dass ich die Gelegenheit habe, meine Arbeit zu teilen. |
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Ich habe mit der JMP Life Science Group und dem SAS Institute gearbeitet. Heute geht es darum, einen Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Workflow mit JMP Project zu erstellen. Dies ist eine neue Funktion, die ich für JMP Genomics 10 entwickelt habe. Falls Sie JMP Genomics noch nicht kennen, gebe ich Ihnen hier eine kurze Einführung. |
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Überblick darüber und das JMP-Projekt ist eine neue Funktion, die am 14. veröffentlicht wurde. Dieses sehr nützliche Tool kann Ihnen bei der Organisation Ihrer Berichte helfen. Wir haben diese neue Plattform genutzt und eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung organisiert. |
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Workflow hinein. Zunächst möchte ich Ihnen ein wenig Hintergrundwissen über JMP geben. JMP Genomics ist |
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Eines der Produkte der JMP-Familie basiert auf SAS und JMP Pro. Es nutzt die Vorteile beider Produkte und ist somit ein äußerst leistungsstarkes Analysetool. |
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Es ist für genomische Daten konzipiert und kann daher unterschiedliche Arten genomischer Daten einlesen, Vorverarbeitungen durchführen und die Sequenzierung der nächsten Generation und die Analyse verarbeiten. |
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Es eignet sich hervorragend für die differentielle Genexpression und die Entdeckung von Biomarkern. Viele Wissenschaftler nutzen es für die Pflanzen- und Viehzucht. Es ist also ein sehr leistungsfähiges Werkzeug. Ich empfehle jedem, der sich mit Genomik beschäftigt, es auszuprobieren. |
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Und als Nächstes möchte ich Ihnen die Einzelzell-RNA-Sequenzierung vorstellen. Viele von Ihnen sind damit vielleicht nicht so vertraut. |
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Es handelt sich hierbei also um eine relativ neue Technologie, die verwendet wird, um dies auf der Ebene einzelner Zellen zu untersuchen. |
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Und im Vergleich zur herkömmlichen RNA-Sequenzierungstechnologie, die eine Untersuchung des durchschnittlichen Expressionsniveaus einer Gruppe von Zellen darstellt. |
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Diese neue Technologie bietet eine höhere Auflösung zellulärer Unterschiede und ermöglicht ein besseres Verständnis der Funktion der einzelnen Zelle im Kontext ihrer Mikroumgebung. |
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Und es kann bei vielen Dingen hilfreich sein, beispielsweise bei der Entdeckung neuer und seltener Zellpopulationen, der Verfolgung von Zellentwicklungsverläufen und der Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene zwischen Zelltypen. Es hat also ein sehr breites Anwendungsspektrum. |
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Eine Anwendung ist, dass Wissenschaftler es kürzlich zur Bekämpfung von Covid 19 einsetzen, also weil es verwendet werden kann, um |
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Charakterisierung transkriptioneller Veränderungen in Immunzellen und Entwicklung von Impfstoffen und Behandlungen. Darüber hinaus wird es häufig in der Krebsforschung, in der Immunologie und in vielen anderen Forschungsbereichen eingesetzt. Es ist also ein sehr leistungsfähiges Werkzeug, aber |
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Die Analyse dieser Daten ist mit einigen Herausforderungen verbunden, deshalb haben wir diesen Workflow zusammengestellt. |
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Ich wollte Ihnen nur einen Überblick über die einzelnen Zell-RNA-Sequenzierungen geben. Als Erstes benötigen Sie eine Probe, |
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entweder vom Menschen oder vom Tier. Es könnte sich um einen Tumor oder eine Laborprobe handeln. Und dann können Sie diese Proben in einzelne Zellen isolieren. |
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Nach der Isolierung können Sie jede einzelne Zelle auf alle vorhandenen Gene sequenzieren. Beim Menschen gibt es beispielsweise etwa 30.000 Gene. Das Endprodukt sieht in unserer Read-Count-Tabelle folgendermaßen aus: Wir haben 30.000 Gene in Zeilen und wir haben |
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etwa eine halbe Million Zellen als Spalten. Wie Sie sehen, hat die Erfüllung dieser sehr großen Datensätze sehr hohe Dimensionen. Sie können auch die Nullen in der Tabelle bemerken, weil |
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Aufgrund technischer oder biologischer Einschränkungen ist es uns nicht möglich, jedes einzelne Gen in jeder einzelnen Zelle zu erkennen. Daher ist es nicht ungewöhnlich, dass 90 % der Zellen tatsächlich |
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Nullen. Es ist also sehr spärlich. Spärlichkeit ist eine weitere Herausforderung bei der Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. |
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Aber nachdem Sie die Vorverarbeitung, Bereinigung und Dimensionsreduzierung durchgeführt haben, können Sie auf diese Daten reguläre Methoden anwenden, wie Clustering und Hauptkomponentenanalyse sowie differentielle Genexpressionanalyse. Diese werden in meinem Arbeitsablauf erwähnt. |
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Und ich habe bereits erwähnt, dass mir Herausforderungen aufgefallen sind, darunter eine hohe Dimensionalität, eine hohe Spärlichkeit und auch eine unterschiedliche Heterogenität zwischen den Zellpopulationen. |
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Technische Störungen und Reproduzierbarkeit, da es so viele verschiedene Sequenzierungsprotokolle und so viele verschiedene Analysepakete gibt. |
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In R, Python oder anderen Tools ist es sehr schwierig, die genauen Schritte zur Analyse Ihrer Daten zu befolgen. Und wenn Sie die Schritte verwechseln und die Dinge nicht in der richtigen Reihenfolge ausführen, |
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Sie können möglicherweise keine reproduzierbaren Ergebnisse erzielen. Das ist eines der Probleme, die wir hier zu lösen versucht haben. |
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Ich möchte Ihnen ein Beispiel für Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zeigen. Diese Daten werden in meiner Demonstration verwendet und sind reduzierte Blutprobendaten (ppm). Wie ich bereits sagte, haben wir Zellen in Zeilen und Gene in Spalten. Es ist also |
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etwa 8000 Spalten und 100 |
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Zeilen, also Zellen. Und man sieht diese Nullen so ziemlich überall. Ich glaube, es liegt an der Spärlichkeit von über 90 % in diesem spezifischen Datensatz. |
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Was beinhaltet unser neuer Workflow zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung in JMP Genomics 10? Für diesen Workflow haben wir versucht, ihn zu erstellen |
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Für diejenigen, die nicht über sehr gute technische Kenntnisse verfügen oder keine Zeit haben, das Programmieren und all diese Statistiken zu lernen. In diesem Workflow haben wir diese Schritte in der richtigen Reihenfolge angeordnet, damit Benutzer die anderen Schritte im Workflow automatisch ausführen können. Und wir haben auch |
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Stellen Sie sehr interaktive Berichte bereit, die den Benutzern helfen, mit uns zu navigieren, die Parameter zu ändern und verschiedene Auswahlmöglichkeiten auszuprobieren. |
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Was also ist in diesem Workflow enthalten, einschließlich des Datenimportfortschritts, der Vorverarbeitung und einer Methode zur variablen Genauswahl, die eigentlich das Rückgrat dieses Workflows bildet. |
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Bei der variablen Genselektion besteht das Ziel dieser Methode darin, eine Dimension der Gene zu reduzieren. |
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Da wir für die menschliche Stichprobe 30.000 Gene haben und nicht alle davon informativ sind, versuchen wir, die informativsten auszuwählen. |
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Dispersionsverfahren und |
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Variabilitätsstabilisierende Transformationsmethode basierend auf niedrigster Regression. Ich werde also nicht ins Detail gehen, aber diese beiden Methoden werden in der Forschungsgemeinschaft häufig verwendet, und ich bin ziemlich froh, dass wir sie reproduzieren konnten. |
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Und wir wenden auch Sparse SVD an, um die Dimensionen weiter zu reduzieren. Und so haben wir auch hierarchisches Clustering und ak-Means-Clustering angewendet. |
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Wir führen ein Feature-Importance-Screening mithilfe einer Boosting-Forest-Methode in JMP durch. Wenn Sie R-Pakete installiert haben, werden wir direkt zur T-SNE- und UMAP-Visualisierung aufgerufen. |
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Dies ist eine sehr beliebte Methode zur Einzelzell-RNA-Sequenzanalyse. Wir haben auch dynamische Visualisierungen bereitgestellt, darunter Violinendiagramme, Ridgeline-Diagramme und Dop-Diagramme. Wir führen auch die differentielle Genexpression durch. Alle Berichte werden in einem integrierten JMP-Projekt organisiert. |
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Als nächstes werde ich eine Demo machen. Diese Demo verfolgt zwei Ziele. Erstens geht es darum, die Zellpopulationen in diesem PBMC-Datensatz zu klassifizieren. Wir versuchen herauszufinden, welche Zelltypen in diesem Datensatz vorkommen. Das zweite Ziel besteht darin, unterschiedlich exprimierte Jeans über verschiedene Subtypen und Bedingungen hinweg zu identifizieren. |
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Schauen wir uns zunächst den JMP Genomics Starter an. Die JMP Genomics-Oberfläche sieht ganz anders aus als die reguläre JMP-Oberfläche, aber |
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Es ist ziemlich einfach zu navigieren. Wenn Sie die Workflow-Grundlagen finden möchten |
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Der grundlegende Workflow zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung befindet sich hier. Klicken Sie darauf, um diese Schnittstelle aufzurufen. Die Schnittstelle ist also ziemlich intuitiv. Sie geben einfach einen Datensatz ein. |
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Und Sie geben die QC-Optionen an. Welche Arten von Genen oder Zellen möchten Sie für Ihre Analyse und variable Genauswahl entfernen? Welche Methode möchten Sie verwenden? Wenn Sie ein VST auswählen, können Sie auch die Anzahl der Gene angeben, die Sie behalten möchten, 2000 oder 3000 |
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Und die Clustering-Optionen, richtig, wie viele Hauptkomponenten Sie für das Clustering verwenden möchten und |
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entweder Sie wollen hierarchische oder k-Means-Clustering-Algorithmen. Und je mehr Optionen, wir haben Markergene |
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Damit können Sie eine Liste von Markergenen hinzufügen, die Sie zur Identifizierung der Zellpopulationen verwenden möchten. Dies ist hier ein sehr praktisches Tool. Außerdem können Sie ANOVA und differentielle Expressionsanalyse starten. Dies ist also ein separater Bericht. |
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Ich werde das in diesem Vortrag nicht diskutieren. Wir hatten auch ein Experimentbeispiel. Wenn Sie das hinzufügen, können Sie grundsätzlich alle Informationen zum Startdesign bereitstellen, z. B. Behandlungsinformationen. |
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Geschlechtsinformationen. Das ist also |
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die simulierten Daten hier. Ich möchte Ihnen nur zeigen, wie wir die Genexpressionsniveaus und verschiedene Messungen zwischen den Gruppen vergleichen. |
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Und schließlich verfügen wir über Einbettungsoptionen, die t-SNE- oder UMAP R-Pakete aufrufen können, sofern diese installiert sind. Sie können hierfür verschiedene Parameter unserer Algorithmen ändern. |
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Nachdem Sie alle Optionen angegeben haben, klicken Sie einfach auf „Ausführen“. Der Bericht sieht dann wie folgt aus. Das ist also ein |
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tabellarischer Bericht. Es gibt insgesamt sieben Registerkarten in diesem Bericht. Ich habe sie in der Reihenfolge angeordnet, in der Sie |
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wie viele Gene in |
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in den Zellen, wie viele Lesezählungen oder wie hoch der Prozentsatz der Mitochondrien-Genzählungen in Ihren Daten ist und welche Korrelationen zwischen diesen drei Messungen bestehen. |
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Und wir, Sie sehen diese linke Seite, wir haben das Aktionsfeld. Sie können es erweitern und darin Optionen finden. In diesem Feld können Sie viele Dinge damit tun. |
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In diesem Reiter können Sie das Diagramm basierend auf den Bedingungen, die Sie in der Datei des Versuchsdesigns angegeben haben, aufteilen. Zum Beispiel können wir eine Behandlung durchführen und teilen |
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Medikament 1, Medikament 2, Placebo. Dann können Sie sehen, ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen gibt, und wir können die Aufteilung aufheben, wenn Sie zu unserem ursprünglichen Diagramm zurückkehren möchten. |
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Und der zweite Reiter ist die variable Genauswahl, die das Rückgrat dieses Workflows bildet. Die roten Punkte bedeuten die Gene, die ich für die nachfolgende Analyse ausgewählt habe, und diese |
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Graue Punkte sind die Gene, die bei der Analyse verworfen werden. Und wenn Sie das Aktionsfeld erweitern, können Sie sehen, dass wir, da wir den VST verwenden, 2000 Gene angegeben haben |
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in dieser Analyse. Wenn Sie Ihre Meinung ändern, können Sie jederzeit eine andere Anzahl von Genen eingeben und dann auf „OK“ klicken. Alle Registerkarten werden dann basierend auf der neuen Zahl aktualisiert. |
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Nachdem Sie also eine Liste variabler Gene haben, werden Sie die Dimensionen weiter reduzieren, indem Sie eine spärliche SVD-Analyse durchführen, die einer Hauptkomponentenanalyse entspricht. |
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Nachdem Sie die SVD-Analyse angewendet haben, können Sie die beiden wichtigsten SVDs oder Hauptkomponenten darstellen. Versuchen Sie, die globale Struktur Ihres Datensatzes zu überprüfen. |
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In diesem Fall sehen wir, dass es in diesem Datensatz zwei große Gruppen gibt, was interessant ist. Außerdem bieten wir ein 3D-Diagramm an, das Ihnen bei der weiteren Untersuchung hilft. |
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Ihre Daten. Manchmal gibt es Erkenntnisse, die Sie in einem 2D-Diagramm nicht erkennen können. 3D-Diagramme können manchmal wirklich einen Mehrwert bieten. |
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Und wir haben diese SVDs, je nachdem, wie viele Sie ausgewählt haben (20 oder 30), können Sie sie verwenden, um |
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Führen Sie eine Clusterbildung durch. In diesem Fall haben wir die hierarchische Clusterbildung ausgewählt und neun Cluster in Ihrem Datensatz gefunden. |
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Neben dem Dendogramm bieten wir auch ein Konstellationsdiagramm an |
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Das gefällt mir sehr gut, da dieses Diagramm t-SNE oder UMAP ähnelt. Es gibt Ihnen eine bessere Vorstellung von der Distanz zwischen verschiedenen Gruppen, richtig. |
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Zum Beispiel gibt es drei Gruppen, große Gruppen, drei Cluster |
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Sie unterscheiden sich von anderen Gruppen. Und wenn Sie sehen möchten, wo sie in der globalen Struktur liegen, sind dies die drei wichtigsten Cluster, die ich erkenne. Betrachten wir 3D-Diagramme, sehen wir |
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Alle hervorgehobenen sind hier. Und dann gehen Sie wieder zu 2D. Dies ist einer von zwei großen Clustern, die ich hervorgehoben habe. Die Interaktivität hilft Ihnen wirklich dabei, |
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Beobachten und visualisieren Sie Ihre Daten auf vielfältige Weise. Außerdem bieten wir ein Paralleldiagramm, mit dem Sie die unterschiedlichen Muster in verschiedenen Gruppen besser erkennen können. |
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Und der nächste Reiter ist Einbettung, d. h. t-SNE- und UMAP-Teile, wenn Sie R-Pakete installiert haben. Ich werde |
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Rufen Sie R auf, führen Sie die Analyse aus, rufen Sie die Daten zurück und visualisieren Sie sie in JMP. Hier ist also ein t-SNE-Diagramm. Wir haben neun Cluster, die sehr gut getrennt sind. |
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Unten ist genau das gleiche Diagramm, aber diesmal habe ich sie mit den von Ihnen bereitgestellten Markergenen eingefärbt; wir haben 14 Markergene. Sie können also mit dieser Funktion zum Durchklicken wechseln |
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um zu sehen, wo diese Gene exprimiert werden. Zum Beispiel gibt es ein GNLY-Gen, das in diesem kleinen Cluster stark exprimiert wird, und wir fragen uns: Was sind unsere Daten? Wir wählen aus und gehen zurück und sehen nun alle, die meisten davon stammen aus Cluster neun, Cluster acht. |
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GNLY ist also ein Gen für NK-Zellen. Es ist ein Markergen für NK-Zellen. Jetzt haben wir also eine Vorstellung davon, was eine Gruppe dieser Zellen ist. |
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Außerdem haben wir hier Aktionsschaltflächen, die Ihnen weitere Funktionen bieten. Wenn Sie zu UMAP wechseln möchten, können Sie das tun. Die Diagramme sind nun mit UMAP verknüpft. |
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Genau dasselbe, aber UMAP bietet eine etwas bessere Trennung und kann die globale Struktur in der Visualisierung besser bewahren. Außerdem bieten wir Ihnen einige Möglichkeiten, die Zellen zu entfernen, die möglicherweise |
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kontaminiert oder weist Qualitätsprobleme auf. Wenn uns beispielsweise eine Gruppe von Zellen hier nicht gefällt, können wir sie aus der Visualisierung entfernen. So wird die Visualisierung übersichtlicher, aber Sie können sie jederzeit wieder zurückholen. |
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Und wieder können wir die Diagramme teilen, was über eine Schaltfläche zum Teilen von Diagrammen möglich ist. Diesmal können wir nach Geschlecht teilen, wir teilen nach weiblich und männlich. Richtig, wir können das Genexpressionsniveau zwischen den Geschlechtergruppen vergleichen, was manchmal sehr nützlich ist. |
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Und wir sind gespalten. |
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Und die nächste Registerkarte bietet Ihnen weitere Visualisierungstools zur Visualisierung der Genexpressionsniveaus in den neun |
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Gruppen, neun Gruppenzellen, richtig. Der erste Teil wird als Violinplot bezeichnet. Auch hier haben wir einen Feature-Switcher, der Ihnen hilft, durch |
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alle diese Gene in verschiedenen Clustern, richtig. Jetzt können Sie sehen, wie hoch der Teil des Graphen ist und wie hoch seine Dichte ist, je nachdem, wie. |
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Sie können deutlich sehen, wo diese Gene stark exprimiert werden. Als Beispiel verwenden wir beispielsweise dieses Gen, GNLY. Sie können sehen, dass es im Cluster 8 stark exprimiert wird. |
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Und in der Mitte, das zweite Grundstück, das wir Ihnen anbieten, ist ein Ridgeline-Grundstück. Ein Ridgeline-Grundstück organisiert die |
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Cluster auf der Y-Achse und das Genexpressionsniveau auf der X-Achse. Aber im Grunde bietet es Ihnen je nach Wunsch etwas Ähnliches. |
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Beispielsweise können wir bei GNLY wieder sehen, dass Cluster 8 GNLY stark durch Knoten oder andere Cluster exprimiert. |
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Unten sehen Sie ein weiteres Diagramm, das sogenannte Punktdiagramm. Dieses neue Diagramm haben wir gerade zu diesem Bericht hinzugefügt. Neben der Anzeige der Genexpressionswerte zeigt das Punktdiagramm auch den Prozentsatz der Zellen an, die dieses Gen exprimieren. Sehen Sie sich zum Beispiel Folgendes an: |
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PPBP-Gen. Und wir können diesen Cluster sehen, in Cluster sieben, den wir hatten, können wir sehen, dass 100 % der Zellen in Cluster sieben dieses PPBP-Gen exprimieren. Dieses Gen ist also das Markergen für |
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Tatsächlich handelt es sich um PPBP-Zellen. Es ist also ganz klar, dass Cluster sieben eine Art von Blutzellen ist, nämlich eine PPBP-Zelle, und sie sehen sich andere an, zum Beispiel Cluster zwei. |
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Nur 12 % der Zellen exprimieren dieses Gen. Es könnte also eine Kontamination vorliegen, aber diese Zellgruppe ist definitiv keine PPBP-Zellen. Dieses Diagramm zeigt Ihnen |
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das Expressionsniveau und der Expressionsprozentsatz in jedem Cluster, die zusätzliche Informationen im Diagramm bieten. |
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Der nächste Tab ist ebenfalls sehr nützlich. Er heißt Feature-Screening. Ich habe einen Fading-Boosting-Forest-Algorithmus verwendet und die Gene dann zur Vorhersage der Cluster verwendet. Die wichtigsten Gene, die zur Trennung der Zellen beigetragen haben, sind in dieser Tabelle aufgelistet. |
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Um diese Gene anzuzeigen, öffnen Sie einfach dieses Aktionsfeld. Wählen Sie die 35 Gene aus, die Sie visualisieren möchten. Klicken Sie auf „OK“. |
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Der nächste Reiter zeigt Ihnen nur die 35 von Ihnen ausgewählten Gene. Das sind die Gene, die hauptsächlich informativ sind. Richtig. Sie können erklären, |
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warum diese verschiedenen Zellgruppen getrennt sind. Also wechseln wir einfach, oder Sie können durchklicken und versuchen, die Muster zu erkennen. Und dann, wenn Sie bemerken, gibt es viele Gene LYZ, |
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CST3 und NKG7. Diese sind bereits in den Markergenen vorhanden oder wurden bereitgestellt, was bedeutet, dass dieses Merkmalsscreening |
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Diese Methode ist sehr erfolgreich, um die wichtigsten Gene in Ihrem Datensatz zu erfassen. Eine weitere Visualisierungsmöglichkeit bietet die GTEx-Datenbank. GTEx ist eine gewebespezifische Datenbank. |
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Sagen Sie uns, welche Gene in welchem Gewebe Ihres Körpers exprimiert werden. So können wir die Genliste direkt an die Datenbank senden. Klicken Sie einfach auf OK. Wir öffnen die |
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Die Website und die GTEx-Website bieten Ihnen eine Heatmap mit den 35 wichtigsten Genen. Jetzt können Sie sehen, wo ich in diesen beiden menschlichen Geweben und Organen exprimiert wurde. Das ist sehr praktisch, um zusätzliche Informationen zu erhalten. |
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Jetzt, da wir diese Markergene verwenden, können Sie wahrscheinlich identifizieren, um welche Zellgruppe es sich handelt. Es gibt also eine |
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Die Funktion hier heißt „Umkodieren“. Sie öffnet die Funktion und kann die Zahlen in Zellnamen umkodieren. Zum Beispiel: Acht, wir wissen bereits, dass es sich um NK-Zellen handelt. Und wir können … Ich habe bereits Namen für jede einzelne Zelle. Ich tippe einfach |
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Diese |
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Monozyten. |
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Zwei sind tatsächlich DC-Zellen; drei sind FCGR3A+-Monozit. |
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Dies sind naive CD+ T-Zellen. |
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Gruppe fünf: Gedächtnis-CD4+-T-Zellen. |
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Und CD8+ T |
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Meijian Guan |
| Meijian Guan |
für Gruppe sechs; sieben ist PPBP, wie wir bereits gesehen haben, und die neunte sind B-Zellen. |
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Klicken Sie mit der Neukodierung auf „Neukodieren“. Da alle Diagramme und Registerkarten verknüpft sind, können Sie nun feststellen, dass alle Zahlen in tatsächliche Zellnamen geändert wurden. Dies hilft Ihnen, Ihre Daten zu erkunden. |
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Ganz einfach. Sie können sehen, wo sich die Zellen befinden, und Ihre Diagramme erkunden. Auch hier, einschließlich der Clusterdiagramme, wurde der benutzerdefinierte Name in die tatsächlichen Zellennamen geändert. Ähm, also |
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Soweit zum heutigen Thema. Bei Fragen können Sie mir gerne eine E-Mail schreiben oder eine Nachricht in der JMP-Community hinterlassen. Vielen Dank für Ihre Zeit. |
