| Conférencier |
Transcription |
| Guan Meijian |
Très bien. Bonjour à tous. Merci beaucoup d'avoir assisté à cette présentation. Je suis ravi d'avoir l'occasion de partager mon travail. |
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J'ai travaillé avec le groupe JMP Life Science et le SAS Institute. Aujourd'hui, nous allons développer un workflow de séquençage d'ARN monocellulaire avec JMP Project. Il s'agit d'une nouvelle fonctionnalité que j'ai développée pour JMP Genomics 10. Si vous ne savez pas ce qu'est JMP Genomics, je vais vous en donner un bref aperçu. |
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Présentation du projet JMP : une nouvelle fonctionnalité, lancée en 2014, est un outil très pratique pour organiser vos rapports. Nous avons donc profité de cette nouvelle plateforme pour organiser un séquençage d'ARN monocellulaire. |
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flux de travail. Tout d'abord, je voudrais vous présenter brièvement JMP. JMP Genomics est |
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L'un des produits de la famille JMP est basé sur SAS et JMP Pro. Il exploite ainsi les avantages des deux produits, ce qui en fait un outil d'analyse très puissant. |
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Il est donc conçu pour les données génomiques, il peut donc lire différents types de données génomiques, il peut effectuer un prétraitement, il peut gérer le séquençage de nouvelle génération et cette analyse. |
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Il est très performant pour l'expression différentielle des gènes et la découverte de biomarqueurs, et de nombreux scientifiques l'utilisent pour la sélection végétale et animale. C'est donc un outil très puissant. J'encourage tout le monde à le découvrir si vous travaillez dans le domaine de la génomique. |
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Je souhaite maintenant vous présenter le séquençage de l'ARN monocellulaire. Beaucoup d'entre vous ne le connaissent peut-être pas très bien. |
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Il s’agit donc d’une technologie relativement nouvelle utilisée pour examiner cela au niveau des cellules individuelles. |
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Et en comparant la technologie traditionnelle de séquençage de l'ARN qui est une enquête, le niveau d'expression moyen d'un groupe de cellules. |
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Cette nouvelle technologie offre une meilleure résolution des différences cellulaires et permet de mieux comprendre la fonction de la cellule individuelle dans le contexte de son microenvironnement. |
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Elle peut contribuer à de nombreuses tâches, comme la découverte de populations cellulaires nouvelles et rares, le suivi des trajectoires de développement cellulaire et l'identification de gènes exprimés différemment selon les types de cellules. Ses applications sont donc très vastes. |
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Une application récente est que les scientifiques l'utilisent pour lutter contre le Covid 19, car il peut être utilisé pour |
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Caractériser les changements transcriptionnels dans les cellules immunitaires et développer des vaccins et des traitements. De plus, il est largement utilisé dans la recherche sur le cancer, en immunologie et dans de nombreux autres domaines de recherche. C'est donc un outil très puissant, mais |
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L'analyse de ces données présente certains défis, c'est pourquoi nous avons mis en place ce flux de travail. |
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Je voulais juste vous donner un aperçu du séquençage de l'ARN monocellulaire. La première chose à faire est de prélever un échantillon. |
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Qu'il s'agisse d'un échantillon humain ou animal, il peut s'agir d'une tumeur ou d'un échantillon de laboratoire. Ces échantillons peuvent ensuite être isolés en cellules individuelles. |
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Après avoir isolé, vous pouvez séquencer chaque cellule individuellement pour tous les gènes présents. Par exemple, chez l'humain, nous avons environ 30 000 gènes. Le résultat final ressemblera donc à ceci dans notre tableau de lecture. Nous avons 30 000 gènes en lignes, et nous avons |
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Parfois, environ un demi-million de cellules sont disposées en colonnes. Comme vous pouvez le constater, ces données très volumineuses ont des dimensions très importantes. Vous remarquerez également la présence de zéros dans le tableau, car |
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En raison de limitations techniques ou biologiques, il est impossible de détecter chaque gène dans chaque cellule. Il n'est donc pas rare de constater que 90 % des cellules sont effectivement |
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zéros. C'est donc très clairsemé. La rareté constitue un autre défi lors de l'analyse des données de séquençage d'ARN de cellules individuelles. |
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Mais après avoir effectué le prétraitement, le nettoyage et la réduction dimensionnelle, vous pouvez appliquer à ces données des méthodes classiques, comme le clustering et les composantes principales, ainsi que des analyses différentielles de l'expression génétique. Ces éléments seront donc abordés dans mon flux de travail. |
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Et j’ai déjà mentionné que j’ai remarqué des défis, notamment une dimensionnalité élevée, une grande rareté et également une hétérogénéité variable entre les populations cellulaires. |
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Bruits techniques et reproductibilité, car il existe de nombreux protocoles de séquençage différents et de nombreux packages analytiques différents. |
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En R, Python ou d'autres outils, il est très difficile de suivre les étapes exactes pour analyser ses données. Et si vous mélangez les étapes et ne procédez pas dans le bon ordre, |
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Il est possible que vous ne puissiez pas obtenir de résultats reproductibles. C'est l'un des problèmes que nous avons tenté de résoudre ici. |
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Je voudrais simplement vous montrer un exemple de données de séquençage d'ARN sur cellule unique. Ces données seront utilisées dans ma démonstration et il s'agit de données d'échantillon sanguin réduites (en ppm). J'ai indiqué que nous avions des cellules en lignes et des gènes en colonnes. |
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environ 8000 colonnes et 100 |
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Des lignes, c'est-à-dire des cellules. Et on voit ces zéros un peu partout. Je crois que cela représente plus de 90 % de la parcimonie dans cet ensemble de données. |
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Alors, que contient notre nouveau workflow de séquençage d'ARN monocellulaire dans JMP Genomics 10 ? Pour ce workflow, nous avons essayé de le construire. |
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Pour les personnes n'ayant pas de très bonnes connaissances techniques ou n'ayant pas le temps d'apprendre à coder et à gérer toutes ces statistiques, nous avons placé ces étapes dans le bon ordre pour que les utilisateurs puissent exécuter automatiquement les autres étapes. Nous avons également |
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fournir des rapports très interactifs pour aider les utilisateurs à naviguer avec nous et à modifier les paramètres et à vérifier différentes sélections. |
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Alors, que contient ce flux de travail, y compris la progression de l'importation des données, le prétraitement et nous avons une méthode de sélection de gènes variables, qui est en fait l'épine dorsale de ce flux de travail. |
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Ainsi, pour la sélection génétique variable, l'objectif de cette méthode est de réduire une dimension des gènes. |
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Parce que pour un échantillon humain, nous disposons de 30 000 gènes, et tous ne sont pas informatifs. Nous essayons donc de sélectionner les plus pertinents. |
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méthode de dispersion et |
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Méthode de transformation stabilisatrice de la variabilité basée sur la régression la plus faible. Je n'entrerai donc pas dans les détails, mais ces deux méthodes sont largement utilisées par la communauté scientifique et je suis ravi que nous ayons pu les reproduire. |
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Nous appliquons également la SVD creuse pour réduire encore les dimensions. Nous avons également appliqué le clustering hiérarchique, « ak » signifiant clustering. |
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Nous avons un filtrage de l'importance des fonctionnalités à l'aide d'une méthode de forêt boosting dans JMP et si vous avez des packages R installés, nous faisons directement appel à la visualisation T-SNE et UMAP. |
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Ce modèle est très populaire grâce à l'analyse du séquençage de l'ARN monocellulaire. Nous avons également fourni des visualisations dynamiques, notamment des graphiques en violon, en crête et en Dop. Nous effectuons également des analyses d'expression génétique différentielle. Tous les rapports seront donc organisés de manière très intégrée au projet JMP. |
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Je vais maintenant faire une démonstration. Elle a deux objectifs. Le premier est de classer les populations cellulaires de cet ensemble de données de PBMC. Nous essayons d'identifier les types cellulaires dans cet ensemble de données. Le second objectif est simplement d'identifier les jeans différentiellement exprimés selon les sous-types et les conditions. |
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Commençons par la version de démarrage de JMP Genomics. L'interface de JMP Genomics est assez différente de celle de JMP standard, mais |
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La navigation est assez simple. Si vous souhaitez trouver les bases des workflows, |
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Le flux de travail de base du séquençage d'ARN monocellulaire est accessible ici. Un clic suffit pour afficher cette interface. Elle est assez intuitive. Il suffit de fournir un ensemble de données. |
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Vous spécifiez ensuite les options de contrôle qualité. Quels types de gènes ou de cellules souhaitez-vous supprimer pour votre analyse et la sélection des gènes variables ? Quelle méthode utiliser ? Si vous sélectionnez un VST, vous pouvez également spécifier le nombre de gènes à conserver : 2 000 ou 3 000. |
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Et les options de clustering, à droite, combien de composants principaux vous souhaitez utiliser pour le clustering et |
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Soit vous optez pour des algorithmes hiérarchiques, soit pour des algorithmes de clustering k-means. Plus vous avez d'options, plus nous avons de gènes marqueurs. |
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Pour vous aider à ajouter une liste de gènes marqueurs à utiliser pour identifier les populations cellulaires, cet outil est très pratique. Vous pouvez également lancer une ANOVA et une analyse d'expression différentielle. Il s'agit donc d'un rapport distinct. |
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Je n'aborderai pas ce sujet dans cet exposé. Nous avons également abordé un exemple d'expérience. Si vous ajoutez qu'en gros, vous pouvez fournir toute information relative à la conception initiale, comme des informations sur le traitement. |
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informations sexuelles. Donc, c'est |
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Voici les données simulées. Je voudrais simplement vous montrer comment comparer les niveaux d'expression génétique et les différentes mesures entre les groupes. |
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Enfin, nous disposons d'options d'intégration permettant d'appeler les packages R t-SNE ou UMAP, si vous les avez installés. Vous pouvez modifier différents paramètres de nos algorithmes. |
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Après avoir spécifié toutes ces options, cliquez sur Exécuter et vous obtiendrez le rapport qui ressemble à celui-ci. |
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Rapport tabulaire. Ce rapport comporte sept onglets. Je les ai organisés dans l'ordre souhaité. |
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combien de gènes dans |
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dans les cellules, combien de lectures sont effectuées ou quel est le pourcentage de gènes mitochondriaux dans vos données et les corrélations entre ces trois mesures. |
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Vous remarquerez sur le côté gauche la zone d'action. Vous pouvez la développer et y trouver des options. Cette zone vous permet de faire de nombreuses choses. |
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Dans cet onglet, vous pouvez scinder le graphique en fonction des conditions fournies dans le plan d'expérience. Par exemple, nous pouvons effectuer un traitement et le scinder. |
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Médicament 1, Médicament 2, placebo. On peut ensuite voir s'il y a une différence entre les différents groupes, et on peut annuler la division si on veut revenir à notre graphique initial. |
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Le deuxième onglet concerne la sélection des gènes variables, qui constitue l'épine dorsale de ce processus. Les points rouges indiquent les gènes que j'ai sélectionnés pour une analyse ultérieure. |
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Les points gris représentent les gènes qui seront ignorés lors de l'analyse. En développant la zone d'action, vous constaterez que, grâce à l'utilisation du VST, nous avons spécifié 2 000 gènes. |
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Dans cette analyse, si vous changez d'avis, vous pouvez saisir un nombre différent de gènes, puis cliquer sur OK. Tous les onglets seront actualisés en fonction de ce nouveau nombre. |
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Ainsi, une fois que vous avez une liste de gènes variables, vous allez réduire davantage les dimensions en effectuant une analyse SVD clairsemée, qui équivaut à une analyse en composantes principales. |
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Après avoir appliqué l'analyse SVD, vous pouvez tracer les deux principaux SVD ou composantes principales. Essayez de vérifier la structure globale de votre ensemble de données. |
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Dans ce cas, nous voyons deux grands groupes dans cet ensemble de données, ce qui est intéressant. Nous fournissons également un graphique 3D pour vous aider à approfondir votre exploration. |
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Vos données. Il y a parfois des informations que vous ne pouvez pas identifier dans un graphique 2D ; les graphiques 3D peuvent parfois apporter une réelle valeur ajoutée. |
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Et nous avons ces SVD, selon le nombre que vous avez sélectionné (20 ou 30), vous pouvez les utiliser pour |
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Effectuer un clustering. Dans ce cas, nous avons sélectionné un clustering hiérarchique et nous avons trouvé neuf clusters dans votre ensemble de données. |
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En plus du dendogramme, nous proposons également un tracé de constellation |
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Ce que j'apprécie beaucoup, car ce graphique est similaire à celui de t-SNE ou d'UMAP. Il donne une meilleure idée de la distance entre les différents groupes. |
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Par exemple, il y a trois groupes, de grands groupes, trois clusters |
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Ils se distinguent plutôt des autres groupes. Si vous souhaitez les situer dans la structure globale, voici les trois principaux groupes que je détecte. Regardez les graphiques 3D : |
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Tous ceux mis en évidence sont ici. Revenons à la 2D. C'est l'un des deux grands groupes que j'ai mis en évidence, donc son interactivité vous sera très utile. |
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Observez et visualisez vos données de multiples façons. Nous proposons également un graphique parallèle pour vous aider à identifier plus précisément les différentes tendances parmi différents groupes. |
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Et l'onglet suivant est l'intégration, ce qui signifie les pièces t-SNE et UMAP si vous avez installé le packaging R. Je vais |
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Appelez R, exécutez l'analyse, récupérez les données et visualisez-les dans JMP. Voici un graphique t-SNE. Nous avons neuf clusters parfaitement séparés. |
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En bas, vous trouverez exactement le même tracé, mais cette fois-ci, je les ai colorés avec les gènes marqueurs que vous avez fournis ; nous en avons 14. Vous pouvez donc, grâce à cette fonctionnalité, cliquer dessus. |
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Pour voir où ces gènes sont exprimés, n'est-ce pas ? Par exemple, il y a un gène GNLY, fortement exprimé dans ce petit groupe, et nous nous demandons quelles sont nos données. Nous sélectionnons, revenons en arrière et voyons maintenant tout. La plupart proviennent du groupe neuf, du groupe huit. |
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GNLY est donc un gène des cellules NK. C'est un gène marqueur pour ces cellules. Nous avons donc maintenant une idée de ce qu'est un groupe de ces cellules. |
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Nous avons également des boutons d'action pour vous aider à faire plus de choses. Si vous préférez passer à UMAP, vous pouvez le faire. Les tracés sont désormais associés à UMAP. |
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C'est exactement la même chose, mais UMAP offre une séparation légèrement plus précise et permet de mieux préserver la structure globale de la visualisation. Nous pouvons également vous proposer des méthodes pour supprimer les cellules potentiellement indésirables. |
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Si un groupe de cellules est contaminé ou présente des problèmes de qualité, par exemple, nous pouvons le supprimer de la visualisation. Il est plus propre, mais vous pouvez toujours le réintégrer. |
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Et encore une fois, nous pouvons diviser les graphiques grâce au bouton « Split graph ». Cette fois, nous pouvons diviser par sexe, par sexe féminin et par sexe masculin. Nous pouvons ainsi comparer le niveau d'expression génétique entre les groupes de sexe, ce qui est parfois très utile. |
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Et nous sommes divisés. |
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Et l'onglet suivant vous fournit davantage d'outils de visualisation pour visualiser les niveaux d'expression génétique dans les neuf |
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groupes, neuf cellules de groupe, à droite. La première partie est appelée « tracé en violon ». Là encore, un sélecteur de fonctionnalités vous aide à naviguer. |
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Tous ces gènes sont répartis en différents groupes. Vous pouvez maintenant voir, selon la taille de la partie du graphique, sa hauteur et sa densité. |
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On voit clairement où ces gènes sont fortement exprimés. Par exemple, j'utilise le gène GNLY, qui est fortement exprimé dans le groupe huit. |
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Et au milieu, la deuxième parcelle que nous vous proposons est une parcelle de crête. Une parcelle de crête organise |
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Les clusters sont sur l'axe Y et le niveau d'expression génétique sur l'axe X. Mais cela vous fournit essentiellement une chose similaire selon vos préférences. |
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Par exemple, GNLY, encore une fois, nous pouvons voir que le groupe huit a GNLY fortement exprimé par le nœud ou d'autres groupes. |
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En bas, nous avons un autre graphique appelé « dot plot ». C'est le nouveau graphique que nous venons d'ajouter à ce rapport. En plus de vous montrer les niveaux d'expression génétique, le dot plot peut également vous indiquer le pourcentage de cellules exprimant ce gène. Par exemple, regardez ici : |
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Gène PPBP. On peut voir ce groupe, dans le groupe sept, où 100 % des cellules expriment ce gène PPBP. Ce gène est donc le gène marqueur de |
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En fait, ce sont des cellules PPBP. Il est donc clair que le groupe sept est un type de cellule sanguine, une cellule PPBP, et qu'il en existe d'autres, comme par exemple le groupe deux. |
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Seulement 12 % des cellules expriment ce gène. Il pourrait donc y avoir une contamination, mais ce groupe de cellules n'est certainement pas des cellules PPBP. Ce graphique vous le montre. |
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le niveau d'expression et le pourcentage d'expression dans chaque cluster qui offrent des informations supplémentaires dans le graphique. |
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L'onglet suivant est également très utile. Il s'appelle « Criblage des caractéristiques ». J'ai utilisé un algorithme de forêt à amplification progressive, puis j'ai utilisé ces gènes pour prédire les clusters. Les gènes les plus importants ayant contribué à la séparation des cellules sont donc classés dans ce tableau. |
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Pour visualiser ces gènes, ouvrez cette boîte de dialogue. Sélectionnez les 35 gènes les plus importants à visualiser. Cliquez ensuite sur OK. |
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L'onglet suivant ne vous montrera que les 35 gènes sélectionnés. Ce sont donc les gènes les plus informatifs. Ils peuvent expliquer |
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Pourquoi ces différents groupes de cellules sont-ils séparés ? On peut donc simplement alterner, ou cliquer et essayer d'observer les schémas. Vous remarquerez qu'il y a beaucoup de gènes LYZ. |
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CST3 et NKG7. Ces gènes sont déjà présents dans les gènes marqueurs ou ont été fournis, ce qui implique ce dépistage de caractéristiques. |
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Cette méthode est très efficace pour identifier les gènes les plus importants de vos données. La base de données GTEx permet également une visualisation. GTEx est une base de données spécifique aux tissus. |
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Indiquez les gènes exprimés dans les tissus de votre corps. Nous pouvons ainsi envoyer directement la liste des gènes à la base de données. Cliquez simplement sur OK. Le fichier s'ouvrira. |
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Les sites web de GTEx et de GTEx vous fourniront une carte thermique des 35 principaux gènes. Vous pouvez maintenant voir où je me suis exprimé dans ces deux tissus et organes humains, ce qui est très pratique pour obtenir des informations supplémentaires. |
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Maintenant que ces gènes marqueurs sont utilisés, vous pouvez probablement identifier à quel groupe de cellules il s'agit. Il y en a donc un. |
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La fonction ici s'appelle « recode ». Son fonctionnement est simple : on l'ouvre et on peut recoder ces nombres en noms de cellules. Par exemple, huit, on sait déjà que c'est des cellules NK. Et on peut… J'ai déjà un nom pour chacune d'elles. Il suffit donc de saisir |
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Ceux |
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Monocytes. |
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Deux sont en fait des cellules DC ; trois sont des cellules monocites FCGR3A+. |
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Ce sont des cellules T CD+ naïves. |
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Groupe cinq Cellules T CD4+ mémoire. |
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Et CD8+ T |
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Guan Meijian |
| Guan Meijian |
pour le groupe six ; le septième est PPBP, comme nous l'avons déjà vu et le neuvième est les cellules B. |
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Avec ces recodages, cliquez sur « Recoder ». Maintenant que tous les tracés et les onglets sont connectés, vous pouvez constater que tous les nombres ont été transformés en noms de cellules. Cela vous permet d'explorer vos données plus facilement. |
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C'est facile, n'est-ce pas ? Vous pouvez savoir où se trouvent ces cellules et explorer vos graphiques. Et, encore une fois, y compris ces graphiques de clustering, vous voyez que le nom personnalisé a été remplacé par les noms réels des cellules. |
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Voilà pour le sujet du jour. Si vous avez des questions, n'hésitez pas à m'envoyer un e-mail ou à laisser un message sur la communauté JMP. Merci beaucoup pour votre temps. |
