Cerba Research は、世界中の臨床試験に合わせた最高レベルの分析および診断ソリューションの提供を専門とする世界的に有名な企業です。Cerba Research Montpellier では、専任チームが免疫組織化学プロトコルをカスタマイズし、患者の組織切片内で特定の標的発現を検出します。プロトコル開発の需要の高まりに対応し、プロセスの収益性を高めるために、開発スケジュールを合理化し、コストを削減することが極めて重要であると認識しています。
開発されるカスタム プロトコルの多様性を考えると、従来の OFAT (1 度に 1 つの要因) アプローチではもはや十分ではありません。そのため、JMP を使用して、カスタム デザインや空間充填設計などのさまざまな実験計画法 (DOE) を比較する詳細な評価を実施しました。これらの DOE アプローチは、以前に開発された OFAT プロトコルと比較して評価されます。コスト効率と品質の観点から、OFAT アプローチと DOE アプローチの比較優位性を示すデータを示します。
こんにちは。私は Marie Gérus-Durand です。Cerba Research で検証エンジニアとして働いています。今日は、免疫組織化学臨床プロトコルを設定する際に実験計画法を使用して、コストを削減し、品質を向上させる方法を紹介します。まず、Cerba Research は世界規模の企業であり、すべての大陸で活動しています。私が働いている部門を黄色で強調表示しました。
それは病理学と IHC 部門です。IHC の主要研究部門は私が勤務しているモンペリエにあります。免疫組織化学とは何でしょうか? 免疫組織化学は、タンパク質や組織内のさまざまなターゲットを研究するものです。生検を行う際は、組織からスライドを切り出し、抗体ベースの技術を使用して、組織上のテロリストのさまざまなターゲットを検出します。これは、顕微鏡やスキャナーでデジタル画像として確認できます。
たとえば、ここには皮膚組織があり、赤く染まったきれいなターゲットが見えます。Cerba Research Montpellier のクライアント向けのプロトコル設定に関する当社の活動の 4 分の 1 以上は、50 社を超えるクライアントのものです。これらのクライアントはそれぞれお気に入りのターゲットです。臨床試験のプロトコル設定の領域全体で競争力を維持するためには、最善の開発戦略を迅速に実行できることが当社にとって重要です。
これは別の染色の例です。これは最初の例で使用する染色です。これからお見せします。これは IHC による茶色のターゲットの検出です。このプロトコルでは 1 つのターゲットのみを検出できます。これをシンプレックスと呼んでいますが、これは私たちが行っていることのほとんどです。
私たちの実際のアプローチは、一度に 1 つの要素です。そのため、まず、認識するターゲットの組織の抗原アクセシビリティを評価し、次に抗体の滴定を行って最適な条件を見つけ、最適な信号対比率を得て、必要に応じてさらに最適化を行います。ここの矢印はそれぞれ、開発プロトコルのステップです。各ステップは少なくとも 1 つのオートマトン サイクルであり、各サイクルはリクエストからテスト結果まで少なくとも 4 日間続きます。
助成金の収益性と開発されたプロトコルの数を増やすには、最適化されたプロトコルに到達するまでの時間とテストの数を減らす必要があります。ここで戦略を図式化します。抗体なしまたは定義された抗体相談の 2 つの抗原アクセシビリティ条件をテストし、これら 4 つのポイントを取得します。次に、最適なものを選択します。つまり、より多くのポイントを持つ抗体の滴定を行う条件 2 です。しかし、実際には、最適なポイントが条件 1 のテスト範囲外のどこかにあった場合はどうなるでしょうか。
これを見ると、JNP で見た実験計画法やウェビナーを思い出します。これはマニュアル ルームのスライドの例です。ここでは、現在使用している 1 つの要素ごとに提示されたアプローチを DOE と比較し、実験領域をより広くカバーしていることがわかります。これは、私たちの設定では大きな改善になる可能性があります。試してみることにしました。
まず、最も簡単なものから始めます。これは、私がお見せするとおり、この問題で 1 つのターゲットのみを検出する単純なプロトコル開発です。まず、制約とパラメータを定義します。この実験で使用しているオートマトンでは、このオートマトンには独立したポジションがあります。実験計画からの 1 つのテストと混合すると、オートマトン内の 1 つのスライドになり、応答と要因を定義する必要があります。
分析したい応答は信号強度です。これを最大化し、バックグラウンドを最小化したいと考えています。この段階で操作できる要素は、カテゴリ要素である抗原回復と、連続変数である一次抗体濃度です。設計を進めましょう。私はさまざまな設計を比較することにしました。
カスタム デザインと空間充填デザインを紹介します。このデザインを一緒に設定します。DOE プラットフォームとカスタム デザインに移動し、昨年の応答と要因または応答をここに入力する必要があります。最初のものは、最大化したい信号強度です。
信号なしの 0 から信号ありの 3 まで任意に評価すると仮定し、ここに別の応答を追加します。最小化したいのは背景なので、今回は最小化する必要があります。背景をここに配置します。同様に、0 は背景なし、3 は非常に高い背景です。次に、要因を追加します。
ここでは少し隠れていたので、お見せします。因子として、2 レベルのカテゴリ因子、抗原検索があります。これは簡単に変更できます。また、通常 PH 6 と PH 9 の 2 つの PH があります。これはオートマトンによって異なる名前で呼ばれますが、これはあまり重要ではありません。
連続因子、つまり抗体濃度があります。これは通常、10 と最大値をテストするので、0 から 10 まで変化させます。これを言ったら、共変量はなくなります。先ほど言ったように、最も単純なものを選択しました。モデルを続けます。すべての可能な相互作用を確認したいので、RSM を使用します。反復は行いません。中心点も使用しません。すでに最も単純なものを選択しましたが、デフォルトでそれが表示されます。彼女は「わかりました」と言いました。
11 個の 1 を実行する必要があります。11 個の 1 は、通常、実行しているものと一致するので、問題ありません。JNP 17 にあるこのデザイン エクスプローラーを利用するには、ここをクリックして、「OK。別のデザインを探索してみましょう」と選択します。クリックすると、要因、モデル、さまざまなオプションが表示されます。左側では、デザインごとに表現します。右側では、組み合わせを行うことができます。RSM では通常、アイ オプティマリティを実行し、異なる実行回数を試してみたいと思います。
最低でも 5 としましょう。まずはここから始めて、11 まで上げていきます。たとえば、1 ずつステップを 15 にしたらどうなるでしょうか。中心点はあまり気にしませんが、試してみて、どうなるか確認して、複製してみましょう。複製したほうがよさそうです。
「すべてのデザインを生成」をクリックすると、さまざまなパラメータでデザインも実行されたので、目の最適化を選択しました。これでどこでも目の最適化になります。実行番号 5 から 15 を選択すると、反復が行われます。
できませんでしたが、5 の複製があります。理由はわかりませんが、問題ありません。たとえば、7 の場合、複製が 2 つあり、すべて同じ場合は 1 または 0 です。中心点についても、可能な場合は 1 つの中心点または 2 つの中心点があります。下部にはリネン テーブルがあるので、それを作成すると、素敵な列が追加されます。
これはすべてカスタム設計されています。このテーブルで設計を選択すると、[カスタム設計] をクリックするとコスト テーブルが開きます。これは、グラフを作成して、「わかりました。見てみましょう。フロントの数に応じて効率を計算します」と言うことができるので便利です。
2 つのデータの間には大きな相関関係があることがわかります。列スイッチャーを使用して、他の変数を追加して確認することもできます。実行を確認したいのですが、中心点と反復も確認したいと思います。申し訳ありません。実行を選択するのを忘れてしまいましたが、とにかく、ここに実行があります。
センターポイントは良い影響を与えていないようで、どちらも複製されていないので、準備ができているようです。実行数で試してみる必要があります。実行数を見ると、これに戻ります。ユーザー、センターポイントをブロックし、参照数だけを確認します。
すべてを削除したわけではありません。その前にすべてを削除しておいていただければと思います。そうしないと、すべて追加されてしまいます。すべてを削除しました。選択しただけです。メモを取っていませんでした。申し訳ありません。そうすると、選択されたものを選択することになります。つまり、12 回実行します。
ここで戻って、はい、デフォルトですか？ 11 ですか？ 実際、同位体を含む抗体がまったくない 2 つのネガティブ コントロールを確実に用意したいので、10 にします。
私は 10 のデザインを作成し、その後、2 つのコントロールを手動で追加します。ご覧のとおり、これは小さなデザインです。所要時間はわずか 10 秒です。ここにテーブルがあります。実際、実行するたびに、ここで異なる数値が表示されます。前に作成したものを使用します。このスクリプトを実行するだけです。皆さんに示しているデータとまったく同じデータが得られます。ここにはテーブルがあるので、異なっていることがわかります。
濃度は 0 か 10 か 5 しかありませんが、これを安定させておきましょう。表を見ると、すでにモデルと設計の評価があり、DOE ダイアログ ボックスに戻ることができます。評価は、2 つの設計を比較したいので、ここでは行いません。今回は行います。先ほど持ってきたばかりなので、私が持っている設計は、最後に各ポイントで複製されます。
重複を要求しなかった場合でも、重複が返されます。これは、実験空間のこの領域をカバーします。空間充填設計を試します。同じです。良い DOE ですが、今回は、特別な目的の設計、ここでは空間充填であり、私が皆さんに見せたいものなので、カスタム設計に戻る必要があります。設計を比較したいのですが、応答と要因は同じです。応答と要因を保存できます。ああ、応答を保存し、同じように写真を保存します。
次に、Space Filling Design に戻ります。回答を読み込むことができます。申し訳ありません。ウィンドウを選択する必要があります。そうすると、ウィンドウが見つかります。要因についても同様です。要因を記述しました。制約はありません。もう一度、ワラントの数は 20 ですが、2 つのデザインを比較したいので、同じものを 10 個作成します。
他に選択肢はありません。ただ柔軟な感じがします。このデザインを生成し、今度は濃度が 0105 のように厳密ではないことがわかります。濃度の範囲が非常に広く、テーブルも同じようにできます。これをすべて閉じることができます。カスタム デザインについては、私が行ったものを再実行したので、まったく同じ数値が得られました。そのため、デザインを比較したいと思いました。デザインをどのように比較しますか? ああ、まず。すみません。忘れていました。
抗体濃度の変動は同じではないことがわかります。このコントロールを除いて重複はありません。これはより広範囲の抗体濃度をカバーしており、実際に私たちが探しているものに適しています。
私はデザインを比較したかったのです。まず、各デザインがカバーする領域が異なるため、グラフィックで比較できます。そして、私の観点からすると、スペース フィリングにより、より多くの抗体濃度を試すことができるので、これは良い点かもしれませんが、デザインを比較できます。DOE には、デザイン診断があり、デザインを比較できるので、両方を持っていることがわかります。
すでに Fast Flexible があるので、カスタム設計を追加します。列名は同じなので、列はあまり必要ありません。彼がやってくれるでしょう。ご存知のとおり、因子の日付をまとめます。Fast Flexible の場合、正確には 0 から始まり、10 まで上がることはありませんが、ほぼそこにあります。モデルはそれらを消去します。これにはカテゴリ因子を含めることはできませんが、あります。抗体ごとの抗体と抗体ごとの抗原リスク報酬に戻りましょう。因子 2 で抗原を取得できませんが、問題ありません。設計評価に進みます。
だからこそ、1 つずつ実行しませんでした。比較したかったのです。ここで青色のパワー プロットを見ると、高速フレキシブル デザインであり、オレンジ色はカスタム デザインです。[inaudible 00:17:23] を見ると、モデルの決定の 4 つの名前では、カスタム デザインの方が高速フレキシブル デザインよりも優れていることがわかります。設計空間のプロットの割合に行っても、同じです。
カスタム デザインの方が適しているようです。設計診断を比較すると、カスタム デザインに相対的になります。つまり、カスタム デザインは 1 つの値を追加します。高効率の高速で柔軟なデザインを探す場合は、7 つ開くので、センサー カスタム デザインよりも 30% 効率が低くなります。これをここに入れました。
ここでは 3 つの診断を示しますが、カスタム デザインの方がスペース フィリングよりも優れているようです [inaudible 00:18:18]。では、結果が何を示しているか見てみましょう。プロファイラーは [inaudible 00:18:26] を入力した後に取得されます。データの例を示すために、ここに DOE テーブルがあります。信号強度とバックグラウンド応答を追加したので、画像を見て、強度がない、少しある、もっとある、などを確認します。両方のデザインで同じことを行いました。
こちらも同様です。これがなければ、2 回実行したことになります。つまり、2 つの異なるデータ セットになります。最後に、モデルを実行しました。モデルをクリックするだけです。標準の正方形効果スクリーニングであることがわかります。ここにすべての相互作用があり、すべてを組み合わせています。削除できる要素がいくつかありますが、すべてを保持することにしました。次に、ここのプロファイラーに移動します。最適な条件を見ると、障害が最大化されます。
強度を最大化します。ここで高いポイントに達し、バックグラウンドを最小限に抑え、この条件を見つけました。その後、信号強度を最大化したくないことに気付きました。ここで使用しているサンプルは強度が低いサンプルではないため、ターゲットを一致させたいだけなので、ターゲットの低い発現を検出できるようにしたいのです。
少し変更して、OK と言います。中間の強度のターゲットに一致させたいです。診断されたものではなく、中間のものです。バックグラウンドは良くないので、バックグラウンドを最小化したいです。望ましさを最大化すると、使用する抗体の濃度が変わります。これは、ここで得られたものとほぼ同じです。少し数字が違っているかもしれませんが、問題ありません。同じことをしました。これは、Fast Flexible Design でも同じです。
2 つの異なる条件が得られました。1 つは CC2 の抗体が 3.8 近く、もう 1 つは CC2 の抗体が 2 です。ここでは PHCCN9 ではありません。この自動では CC1 と CC2 と呼ばれていますが、同じものです。次に、わかりました。これら 2 つの条件があります。最初のプロトコルと比較します。
つまり、私たちの基準、つまり標準ブラシ、つまり前にお見せした画像です。ここには、カスタム デザイン条件とスペース フィリング デザイン条件があります。これら 2 つの条件では、少なくとも同等の優れたデータが得られることがわかります。標準アプローチで定義したものよりも優れていると言えるでしょう。私の場合、スペース フィリング データは、より多くの抗体濃度をテストするために作成しました。これは、難しいターゲットがある場合に役立ちます。
これを選択する理由は、ここに表示されている 2 つの条件に加えて、スペース フィリング デザインに実際に存在していたからです。スペース フィリング デザインにデータがあったため、条件に反して実行する必要はありませんでした。画像は、それがうまく機能していることを再確認するためのものです。別のプロトコルでテストするために、スペース フィリング デザインを選択します。機能しているかどうかを確認するためです。
すべてを調べる必要はありません。同じ紙を取り、新しいターゲットに合わせて応答を変更するだけです。中央強度の 2 つのターゲットを一致させ、バックグラウンドを最小限に抑えるこのモデルを取得しました。彼は、抗体の男性あたり 2.8 マイクログラムを CC2 条件で使用すべきだと言いました。
これを私たちが開発したプロトコルと比較すると、CC1 と 5 マイクログラム プログラムと言われており、同じではありません。どちらも変更されていますが、画像でわかるように、Space Filing Design によって定義された同じプロトコルは、少なくとも私たちが通常開発するものと同じくらい優れています。今、運用と管理者を納得させるのに欠けているのは、間違いなくコストと時間です。ここで私たちが提案する設計アプローチです。
まず、カスタム デザインとスペース フィリング デザインを、標準アプローチと比較して、すべてを設計するのにかかった時間として比較します。このグラフでは、標準アプローチは青、スペース フィリングは赤、カスタム デザインは緑で、時間のかかるサイクル数、スライドの数、設計からプロトコルまでの時間、リクエストを受けてから準備するまでの時間を比較します。
技術的な要求から調査までの時間、さらには技術チームにとって新しいやり方であることも含めてすべてを設計しなければならないことを考えると、結果が出るまでの時間が短縮されました。2 番目の例では、すべてを再度設計する必要はありませんでした。このアプローチを新しい実際のアプローチとして採用した場合、次のステップはより可能性が高いので、このプロジェクトで使用した標準的なアプローチと比較します。
青と赤の縞模様の部分に DOE セットアップを配置し、比較サイクルを押します。これは参照プロトコルがあるためです。比較サイクルを実行しましたが、これが現在使用している新しいアプローチである場合は、参照がないため比較サイクルは実行しません。DOE セットアップのみを実行します。赤で示されています。ご覧のとおり、サイクル数、サイト数、使用した抗体数が減少し、最終結果の日数が ALF によって短縮されました。これは非常に良いことです。
結論として、私はスティーブ・ジョブズのこの言葉が好きです。「小さく始めて、大きく考えろ。」最初、これらすべてを見たとき、ああ、いいな、でも自分には適用できないと思いました。少し苦労しましたが、私は「よし、一番簡単な方法から始めよう」と言って、このシンプルな IHC を設定しました。そして、マネージャーを説得して、私が考えたときにはもっと早く設定できました。その後、運用チーム、そして最終的には他のリーダーたちにも、このアプローチが IHC に適用できると納得してもらいました。
最適化が必要な場合、現在のように許可することはできません。なぜなら、最初は開発が簡単かどうかわからないからです。次のステップとして、私は研究室に導入したいと考えています。それはマルチプレックス設定です。同じ組織上の複数のターゲットを検出し、抑制されたターゲットに対して 2 つのターゲットから始めて、最大 5 つのターゲットまで検出します。これは進行中です。
最後に、感謝の意を表したいと思います。私のアブストラクトを選んでくれた運営委員会に感謝します。また、Cerba Research Montpellier チームと、私の突飛なアイデアを理解するのが難しいこともあるため、研究室の技術者にも感謝したいと思います。
新しい戦略や新しい物の見方についてすでに協力してくれている私のマネージャー、そして構想および検証チーム全員に感謝します。私もこのテストに参加しています。JNP フランス チームに感謝します。サポートしてくれ、あらゆる質問をしてくれたステファンのおかげで、私は 16 人で行き詰まっていた JNP 17 人を新たにロードし、設計探索の優れたプラットフォームを見ることができました。皆さんの関心に感謝します。
