黏液阻塞性氣道疾病（MADs）患者的氣道環境特徵是黏液脫水，這是由於氣道表面液體過度吸收和黏液纖毛清除功能受損所致。隨著MADs的進展，由於黏蛋白過度產生和宿主來源的細胞外DNA（eDNA）積累，病理性粘液變得越來越黏稠。銅綠假單胞菌是MADs的主要病原體，它持續定植於此黏液微環境中。儘管有吸入性抗生素治療且不存在抗生素抗藥性，但抗銅綠假單胞菌治療失敗仍是臨床難題。
我們利用JMP的數據來視覺化和統計建模功能，研究了呼吸道黏液中的主要聚合物—黏蛋白和eDNA的濃度如何影響銅綠假單胞菌的抗生素耐受性，從而理解其抗生素抗藥性機制。我們的研究結果表明，聚合物的濃度和分子量會影響銅綠假單胞菌在抗生素暴露後的存活率。令人驚訝的是，聚合物驅動的耐受性並非僅與抗生素擴散減少有關。此外，我們建立了一個體外模型，該模型模擬了不同病因、年齡和疾病嚴重程度的細菌咳痰中觀察到的離體抗生素耐受性，突顯了宿主進化過程中銅綠假單胞菌群體的內在變異性。
您好。我叫喬納森‧希斯勒 (Jonathan Schisler)，是北卡羅萊納大學教堂山分校的助理教授，也是希斯勒實驗室的首席研究員。我的實驗室運用系統生物學研究健康老化和非健康衰老，主要研究大腦和心臟的老化過程。此外，我們也參與了許多與太空生物學相關的研究，旨在尋找有助於延長太空飛行時間的有效應對措施。
我們對系統生物學的運用為合作打開了許多扇門。今天，我將重點介紹抗生素抗藥性和慢性肺部感染的建模。這項工作是與北卡羅來納大學教堂山分校的馬特沃爾夫岡及其實驗室合作完成的。我將分享一些我們進行的數據分析。所有數據均由馬修·格林沃爾德生成，他是馬特·沃爾夫岡實驗室一位才華橫溢的研究生。
今天我要重點討論的疾病是黏液阻塞性氣道疾病。這是一類疾病，其中一些名稱可能比較常見，例如囊性纖維化、慢性阻塞性肺病（COPD）、原發性纖毛運動障礙以及非囊性纖維化支氣管擴張。這是一個全球性的重大問題，全球約有5億人患有慢性呼吸系統疾病。
在美國，光是慢性阻塞性肺病（COPD）一項每年就造成近400億美元的經濟負擔。此外，慢性細菌感染患者的死亡率也高出近50%。我們面臨的最大問題在於治療。這是因為在近50%的病例中，抗生素最終都會失效。我們需要更好的模型來研發更有效的藥物。
從病理生理學的角度來看，當我們討論這些黏液阻塞性氣道疾病時，左邊是健康的氣道，右邊是阻塞性氣道的示意圖。本質上，是黏稠的黏液沉積在氣道內壁，導致血液氧合困難，從而引起呼吸困難。這種粘液環境非常適合細菌滋生，並形成微小的致病菌群落，最終可能導致抗生素抗藥性。如果不加以控制，則可能引發敗血症和多重器官衰竭。
正如我之前提到的，抗生素治療隨著時間的推移而失效的情況非常普遍。以囊性纖維化患者為例，他們通常在很小的時候就被診斷出來。縱軸代表這些細菌的數量，我們簡稱為PAO。
隨著時間的推移，呼吸道內的細菌數量會不斷累積。我們會使用抗生素來治療。抗生素可以降低細菌數量，然後細菌數量就會不斷積聚，抗生素治療效果也會下降，如此反复，形成一個惡性循環。長期使用抗生素會導致克隆選擇過程，這意味著我們開始篩選掉那些已經適應環境和抗生素的細菌。這種適應最終會導致我們所說的抗生素抗藥性，此時抗生素對清除細菌的效果已大打折扣。至此，我們就度過了慢性疾病階段。
過去十年的研究表明，這種PAO的慢性感染與囊性纖維化清除失敗有關。雖然它可以減輕疾病負擔，但似乎無法徹底清除細菌。
這項研究的另一個有趣之處在於，抗生素的敏感性並不能預測治療的成功率。即使抗生素在患者體內無效，你也可以將細菌從患者體內取出並用抗生素治療，這樣就能殺死細菌。這就引出了一個重要問題：體內發生的情況與實驗室發生的情況有何不同？我們能否建立模型和方法來更好地理解這個問題？
為了更形象化地展現抗生素抗藥性，您可以想像用遞增劑量的抗生素處理細菌培養物。通常情況下，對抗生素敏感的細菌在低劑量下就會開始死亡，圖中以綠線表示。抗藥性細菌的生長速度會下降，但仍能存活一段時間。當然，最糟糕的情況是細菌對抗生素完全抗藥性，此時添加抗生素對細菌的生長沒有任何影響。
這是馬特在看海報，他提出了一些非常有趣的問題，探討人體對抗生素的反應機制與實驗室研究結果的差異。這項研究是透過一項非常出色的臨床實驗進行的，實驗中收集了患者的樣本，我們稱之為痰液樣本。顧名思義，就是你咳出的痰球。
我們可以採集囊性纖維化或慢性阻塞性肺病患者的樣本。然後，我們可以分離並培養這些樣本中的細菌。之後，我們可以比較在體外用該藥物治療這些細菌與在患者體內（即接受相同抗生素治療的患者）治療這些細菌的效果。這是他們通常接受的治療。我們進行了一項非常出色的實驗。我們讓患者接受這種抗生素治療。同時，我們也在分析體外細菌對同一種抗生素的表型反應。
顯而易見的是，細菌在肺外和肺內的存活率有顯著差異。這裡的MIC值代表治療患者所需的抗生素劑量，而這與我們在肺外培養時觀察到的情況有所不同。有些培養物對抗生素的反應良好，但顯然，也有很多培養物表現出極強的抗藥性。究竟是什麼造成如此大的差異？氣道內的情況與實驗室中的情況究竟有何不同？
導致抗藥性的因素有很多。我們之前已經簡單討論過抗生素抗藥性本身，但如果我們繪製患者治療中抗生素抗藥性與體外存活率的關係圖，就會發現兩者之間幾乎沒有相關性。這說明其中肯定存在一些問題。我們無法透過體外培養來揭示導致抗生素抗藥性的因素，而這些體外培養正是我們用來分析抗藥性原因的手段。
馬特決定將研究重點放在環境上。這些阻塞的氣道內有哪些獨特的環境因素可能導致這種阻力，而這些因素對於我們的模型來說可能至關重要。實際上，在可能導致阻力的因素方面，有兩個因素很容易被找到。一個是黏蛋白，它本質上是構成黏液的蛋白質成分。黏蛋白是黏液的主要蛋白質，DNA 也是。
在這些阻塞的氣道中，會積聚大量粘液，同時也會漂浮著大量DNA，這些DNA可能來自死亡的免疫細胞和其他氣道細胞。我們知道，隨著患者年齡增長和病情加重，黏液蛋白和DNA的含量都會升高。
馬特做了一個非常巧妙的實驗，他用抗生素處理了PAO細菌。當在缺乏這種粘液蛋白的情況下使用抗生素時，可以看到抗生素能很好地抑制細菌生長。然而，隨著黏液蛋白含量的增加，越來越多的細菌開始生長。這初步表明，這種環境可能在細菌如何抵抗抗生素治療方面起著重要作用。粘液蛋白含量越高，疾病的嚴重程度越高。
以上涵蓋了蛋白質。那麼DNA呢？在同樣的實驗中，我們保持黏液蛋白的濃度不變，然後逐步增加DNA的量。隨著DNA添加量的增加，我們開始觀察到更高的存活率。 DNA和黏液蛋白都能提高細菌的存活率或增強其對抗生素的抗藥性。有趣的是，一旦黏液蛋白的濃度達到較高水平，DNA的作用似乎會略微減弱。 DNA和黏液蛋白在增強抗藥性方面似乎存在某種相互作用。
在開始資料建模之前，我需要介紹的最後一個變數是流變學，或者也可以理解為黏度。氣道內介質（在本例中為實驗室試管內介質）的黏度與黏蛋白和DNA的含量都存在一定的關聯。黏度部分取決於蛋白質和DNA的含量。我想介紹的是我們最感興趣的四個主要建模變數。
現在我們可以利用 JMP，特別是 JMP Pro。其中一個最大的問題是，Matt 來找我說：「我們有這些數據，我們很想知道所有這些變數是如何相互作用的。」我最喜歡 JMP 的一點就是它的數據視覺化功能。它能以精美的圖形呈現方式，清晰快速地給出答案。我們利用它的多元分析平台，快速地視覺化了四個主要變數之間的關係。
我們有兩個因變量，也就是我之前提到的粘度流變學特性。另一個因變數是存活率，也就是克服抗生素抗藥性的能力。然後我們有兩個自變量，因為我們控制了黏蛋白的含量，也控制了DNA的含量。這張圖很棒，它簡潔明了地呈現了大量資訊。
我們進行多元分析。我們可以利用它來產生每個變數的直方圖。我們可以輕鬆查看變數間的散佈圖，從而鎖定最強的相關性。然後，我們也可以用熱圖直觀地表示相關係數。我們也可以使用大小功能來表示這些發現的顯著性。只需一次截圖，就能獲得如此豐富的資訊。這也是我們如此喜愛 JMP Pro 的原因之一。
對於第一個目標，我想指出一點，在我所在的系統生物學領域，我們通常處理成千上萬個資料點和樣本，而這個資料集相當小。它總共只有78個獨立觀測值。這一點對於討論限制至關重要。
不出所料，這張圖表迅速地表明我們的兩個因變數之間沒有相關性，這本來就不應該發生。這是一個很好的邏輯檢驗。然而，我們的兩個自變數卻高度相關。這兩個自變數分別是黏度（流變學變數）和存活率。您可以從散佈圖和相關係數中看出這種強烈的正相關性。
此外，我們也觀察到每個自變數都有一個非常顯著的對應因變數。如果我們觀察這種粘液蛋白的含量，可以看到它與生存率之間存在非常強的正相關性，這在散點圖中以及相關性得分的上象限中都有體現。而對於DNA，我們發現它與黏度因子之間存在最強的正相關性，這在方格中以及相關性常數得分中都有體現。
那太棒了。但馬特和馬特提出的一個問題是：「我們如何才能把所有這些因素結合起來建模呢？」他們有興趣嘗試用數學模型來表達這些因素，這樣我們就可以對其進行分析和測試，並進行各種操作，看看會發生什麼。
我至少要大力推薦模型對比功能。我在軟體裡常用到它。不過，我這次比較直接，也比較挑剔，最後選擇了偏最小平方法迴歸，一部分是基於經驗，一部分是基於手邊的數據。
我們有兩個Y變量，還有一些X變量，這些變量之間也有一定的關聯。考慮到我想考慮交互項，PLS迴歸似乎非常適合這種情況。從初始數據中我們已經可以看出，黏蛋白和DNA含量這兩個X變數之間可能存在一些有趣的交互作用。
再次強調，數據相對稀疏，因此我們的交叉驗證也存在一定的限制。在我們發表這篇論文時，我們還沒有獨立的驗證資料集，目前正在努力建構中。在建立模型時，必須考慮到過度擬合的問題。這確實有助於我們探索這四個變數之間的關係。
我們使用 JMP Pro 中的模型擬合功能。同樣，我們使用偏最小二乘法，並考慮兩個 Y 變數和兩個 X 變量，包含三個因子和一個交互項。兩個自變數和交互項的 VIP 值均大於 0.8。我們將它們全部保留在模型中。此處保留相關性僅作為參考。
如果我們觀察PLS迴歸的模型係數，可以看到，即使控制了黏蛋白（一種蛋白質）以及蛋白質-DNA交互作用，我們仍然發現DNA的黏度相關係數（β係數）最大。而對於存活率而言，最大的係數則與黏蛋白有關。我們可以利用這些訊息，開始進一步了解所有這些變數之間的相互關係。
我們進行常規的品質檢查，即比較實際值和預測值。左側散佈圖展示了黏度或流變學特性的實際值與預測值，以及存活率。當然，我總是喜歡進行這種合理性檢驗。方程式是什麼樣的？這讓我很滿意。這是黏度和存活率作為黏蛋白、DNA及其交互作用項的函數的輸出結果。
JMP 的另一個強大工具是預測器工具。我也很喜歡用它來探索模型的工作原理。當然，我們的合作者也總是對它很感興趣。我一直以來都在努力尋找最佳的工作空間共享方式。很高興地說，我至少嘗試了一下 JMP Live 和 JMP 公共領域，這對我們共享資料非常有幫助。我還想強調一點，這一點非常重要，尤其對於學術界而言，我們必須有辦法以公正的方式存取和分享我們的資料。
我一直很興奮能深入了解 JMP Live，以及如何將其融入我們的數據報告中。我們在發表論文時，在這裡提供了一個指向該工作區的鏈接，這樣大家就可以進入其中體驗配置文件，並下載所有原始數據。這對於我們研究中嚴謹的可重複性至關重要。
預測器的另一個優點是能夠嘗試觀察模型在各種輸入參數下的表現。它的另一個優點是能夠運行蒙特卡羅模擬。這再次體現了 JMP 的強大功能，我們經常使用它。
為了方便說明，這裡我們分別用到了蛋白質組分和DNA組分。我們可以利用實驗或臨床數據來調整樣本採集範圍，這一點非常棒。在這個例子中，我們實際上使用的是截斷常態分佈，因為我們有實驗確定的低值和高值，希望將其限制在範圍內。然後，我們可以利用這些數據運行數千次模擬，觀察模型在不同輸入值下的表現。
再次強調，JMP 的圖形建構器非常實用，它能讓你輕鬆查看所有 1000 次模擬的逐一圖表，從而發現模型中一些有趣的關聯。此外，它還能以簡潔的圖形概括一個四變量模型，同時捕捉 DNA 濃度、蛋白質濃度、黏度以及在合理範圍內生存的情況。這種清晰易懂的解釋性是一項非常棒的功能。
我想提到的另一個重要方面是交互分析器。在建構模型時，我們顯然不希望加入那些意義不大、只會為模型增加雜訊的交互項。交互分析器是一個非常強大的工具，可以快速識別哪些交互項真正值得納入模型。這是 JMP 的另一個出色功能。
為了實現這個目標，我們學到了什麼？透過建構這個PLS模型，我們從Matt的大型實驗數據中了解到了什麼？首先，我們發現抗生素抗藥性（或在本例中，我們將其量化為存活率）與黏蛋白呈正相關，且這種相關性在所有DNA濃度下均存在。無論DNA濃度高低，黏蛋白與存活率之間都存在正相關關係。此外，如果您查看上面的圖表，您也可以看到相同的關聯。
我們也觀察到黏蛋白與黏度之間存在正相關關係，並且隨著DNA濃度的增加，這種相關性減弱。這一點在交互作用圖中表現得最為明顯。我們可以看到，在沒有DNA的情況下，黏度隨著黏蛋白濃度的增加而增加。但是，當DNA濃度較高時，我們發現斜率完全反轉。
這巧妙地展示了我們觀察到的差異性影響，尤其是在DNA含量達到中等或較高水平時，黏度和存活率之間的正相關性更為顯著。我認為這是一種非常巧妙的方式，將這四個變數連結起來，而這種連結在科學上也合情合理。至少在我們的細胞培養模型中，黏蛋白和蛋白質濃度似乎確實是細菌抗藥性的主要驅動因素。但它肯定會受到胞外DNA含量的影響。
我們在本研究中利用 JMP 的最後一個例子是，我們提出了這樣一個問題……或許我們只是需要更好的模型。我們希望在實驗室中使用能夠更真實地反映實際情況的模型，在本例中，指的是患者氣道內的情況。我們已經證明，透過引入黏蛋白和 DNA，我們似乎能夠重現這種抗生素抗藥性表型。那麼，我們能從建構更好的模型中學到什麼呢？
在上一次實驗中，Matt 從所有這些患者身上分離了細菌。然後，他用不同濃度的黏蛋白培養這些細菌。問題是，是否存在某種實驗室條件能夠最精確地模擬病患氣道內的實際情況？令人驚訝的是，我們發現，使用 2% 濃度的黏蛋白進行培養，大約…我估計 90% 的培養結果與患者數據最相似，遠勝於其他濃度範圍。我們也可以將其繪製成圖表，圖中展示了體外實驗室培養結果與患者體內培養結果之間的差異。
顯然，數值越接近零，我們就越能更好地重現患者身上觀察到的情況。可以看到，在2%的黏蛋白水平下，幾乎所有患者樣本都落在了這個最佳範圍內。現在我們有兩個異常值。這兩個異常值非常有趣，值得我們去探討它們之間的差異。這種方法對我們來說是一個很好的研究途徑。我們能否找到更好的模型來研究這種疾病？
簡而言之，我們發現黏液聚合物的濃度（包括黏蛋白本身和細胞外DNA）決定了PAO的抗生素抗藥性。我們可以利用數學模型來尋找更合適的體外模型，以研究抗生素抗藥性。
JMP Pro 在資料處理、模型開發、視覺化、資料共享和報告的各個階段都非常有用。我知道我還沒有機會詳細介紹它的所有功能，但我們在整個資料管道中都使用了 JMP，它真的幫了我們很大的忙。感謝大家的聆聽。
