En las personas con enfermedades mucoobstructivas de las vías respiratorias (EMVR), el entorno de las vías respiratorias se caracteriza por una mucosidad deshidratada debido a la hiperabsorción del líquido de la superficie de las vías respiratorias y a una alteración de la depuración mucociliar. A medida que las EMVR progresan, la mucosidad patológica se vuelve cada vez más viscosa debido a la sobreproducción de mucina y a la acumulación de ADN extracelular (ADNe) derivado del huésped. Pseudomonas aeruginosa, un patógeno importante en las EMVR, coloniza este nicho mucoso de forma persistente. A pesar de las terapias con antibióticos inhalados y la ausencia de resistencia a los antibióticos, el fracaso del tratamiento antipseudomónico sigue siendo un desafío clínico.
Utilizamos la visualización de datos y el modelado estadístico de JMP para investigar cómo las concentraciones de mucina y ADN ambiental (polímeros predominantes en el moco respiratorio) afectan la tolerancia a los antibióticos de P. aeruginosa y así comprender su resistencia. Nuestros hallazgos revelan que la concentración y el peso molecular de los polímeros influyen en la supervivencia de P. aeruginosa tras la exposición a antibióticos. Sorprendentemente, la tolerancia mediada por polímeros no se limita a la reducción de la difusión de antibióticos. Además, establecimos un modelo in vitro que reproduce la tolerancia a los antibióticos observada ex vivo en el esputo expectorado en diferentes etiologías, edades y grados de gravedad de la enfermedad, lo que pone de manifiesto la variabilidad intrínseca de las poblaciones de P. aeruginosa adaptadas al huésped.
Hola. Me llamo Jonathan Schisler. Soy profesor adjunto en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Soy el investigador principal del Laboratorio Schisler. En mi laboratorio utilizamos la biología de sistemas para estudiar el envejecimiento, tanto saludable como patológico, principalmente en el cerebro, así como en el corazón. También participamos en numerosas investigaciones relacionadas con la biología espacial para identificar contramedidas que podrían ser útiles para los vuelos espaciales prolongados.
Nuestro uso de la biología de sistemas ha abierto muchas puertas a la colaboración. Hoy voy a hablar sobre la modelización de la tolerancia a los antibióticos y la infección pulmonar crónica. Esto se realizó en colaboración con Matt Wolfgang y su laboratorio, también en la UNC Chapel Hill. Voy a hablar sobre algunos análisis de datos que llevamos a cabo. Todos los datos fueron generados por Matthew Greenwald, un estudiante de posgrado excepcionalmente talentoso del laboratorio de Matt Wolfgang.
La enfermedad de la que hablaremos hoy, y en la que nos centraremos, son las enfermedades mucoobstructivas de las vías respiratorias. Se trata de un grupo de enfermedades. Algunas de ellas pueden resultar familiares, como la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la discinesia ciliar primaria y la bronquiectasia no asociada a fibrosis quística. Este es un problema grave a nivel mundial. Casi quinientos millones de personas en todo el mundo padecen enfermedades respiratorias crónicas.
En Estados Unidos, la EPOC por sí sola supone una carga económica de casi 40 mil millones de dólares anuales. Además, las personas que padecen infecciones bacterianas crónicas tienen una mortalidad casi un 50 % mayor. El mayor problema reside en los tratamientos, ya que el fracaso de los antibióticos se produce en casi el 50 % de los casos. Necesitamos mejores modelos para encontrar fármacos más eficaces.
Desde una perspectiva fisiopatológica, cuando hablamos de enfermedades mucosas obstructivas de las vías respiratorias, a la izquierda se muestra una vía respiratoria sana y a la derecha, un esquema de cómo se ve una vía respiratoria obstruida. Básicamente, la acumulación de moco espeso y pegajoso que recubre las vías respiratorias dificulta la oxigenación de la sangre y provoca dificultad para respirar. Este entorno mucoso es propicio para la proliferación bacteriana y la generación de nichos que, en última instancia, pueden conducir a la resistencia a los antibióticos. Si no se controla, puede derivar en sepsis e insuficiencia multiorgánica.
Como ya mencioné, el fracaso del tratamiento con antibióticos a largo plazo es muy común. Si observamos lo que sucede con una persona con fibrosis quística, normalmente se le diagnostica a una edad temprana. En el eje Y, tenemos la cantidad de estas bacterias, a las que llamaremos PAO para abreviar.
Con el tiempo, la cantidad de bacterias se acumula en las vías respiratorias. Se tratan con antibióticos, lo que puede reducir la cantidad de bacterias. A partir de ahí, se inicia un ciclo constante de acumulación bacteriana, remisión tras el tratamiento con antibióticos, y así sucesivamente. Con el tiempo, debido a todos estos tratamientos antibióticos, se inicia un proceso de selección clonal, lo que significa que se empiezan a eliminar las bacterias que se han adaptado al entorno y al antibiótico. Esta adaptación finalmente conduce a lo que llamamos tolerancia a los antibióticos, donde estos ya no tienen un efecto significativo en la eliminación de las bacterias. Ahora hemos superado la fase crónica de la enfermedad.
Sabemos, gracias a estudios realizados en los últimos 10 años, que la infección crónica por esta bacteria PAO se asocia con la falta de remisión de la fibrosis quística. Si bien puede reducir la carga de la enfermedad, no parece eliminar por completo la bacteria.
Otro aspecto interesante de esta investigación es que la susceptibilidad al antibiótico no predice el éxito del tratamiento. Se pueden extraer las bacterias del paciente y tratarlas con un antibiótico, y este las eliminará aunque no sea efectivo en el propio paciente. Surge entonces la gran pregunta de cuál es la diferencia entre lo que ocurre en el organismo y lo que ocurre en el laboratorio. ¿Podemos desarrollar modelos y métodos para comprender mejor este problema?
Para ilustrar gráficamente la resistencia a los antibióticos, imaginemos un cultivo bacteriano tratado con dosis crecientes de antibiótico. Los cultivos sensibles a los antibióticos normalmente comenzarán a morir tras una dosis baja, representada por esta línea verde. Las especies tolerantes experimentarán una disminución en su crecimiento, pero persistirán en cierta medida. Por supuesto, el peor escenario posible es la resistencia total a los antibióticos, donde el crecimiento no se ve afectado por la adición del fármaco.
Aquí vemos a Matt observando un póster, donde plantea preguntas muy interesantes sobre qué factores influyen realmente en la respuesta a los antibióticos en las personas, en comparación con lo que se hace en el laboratorio. Esto se logra mediante un experimento clínico extraordinario en el que se obtuvieron muestras de pacientes, a las que llamamos muestras de esputo. Literalmente, cuando uno tose y expulsa una bola de flema, a eso nos referimos con el esputo.
En pacientes con fibrosis quística o EPOC, podemos obtener estas muestras. Las bacterias presentes en ellas se pueden aislar y cultivar. Luego, podemos comparar el efecto del tratamiento con el fármaco fuera del paciente frente al tratamiento con los mismos antibióticos que reciben habitualmente. Se trata de un experimento realmente extraordinario. Tenemos pacientes tratados con este antibiótico y, al mismo tiempo, analizamos el fenotipo de las bacterias frente al mismo antibiótico fuera del organismo.
Lo que quedó increíblemente claro fue que existía una desconexión entre la supervivencia de las bacterias fuera del pulmón y dentro de él. Este nivel de CMI indica la dosis de antibiótico necesaria para tratar al paciente, en comparación con lo que observamos cuando el cultivo se realiza fuera del pulmón. Algunos cultivos respondieron bien al antibiótico, pero, obviamente, muchos otros fueron increíblemente resistentes. ¿Qué nos hace tan diferentes? ¿Qué diferencia hay entre lo que sucede en las vías respiratorias y lo que sucede en el laboratorio?
Existen muchos factores que pueden influir en la resistencia. Ya hablamos un poco sobre la resistencia a los antibióticos en sí, pero si comparamos la resistencia a los antibióticos con el tratamiento del paciente frente a la supervivencia in vitro, vemos que no hay correlación. Algo falta. Hay algo que no estamos detectando en estos cultivos in vitro para dilucidar qué contribuye a la resistencia a los antibióticos.
Matt decidió centrarse en el entorno. ¿Qué es único en el entorno dentro de estas vías respiratorias obstruidas que podría estar contribuyendo a esta resistencia que podría ser importante que consideremos en nuestros modelos? En realidad, hay dos cosas que se convirtieron en objetivos fáciles en términos de lo que podría estar contribuyendo a la resistencia. Eso es la mucina, que es esencialmente el componente proteico que forma este moco. Es la proteína predominante del moco, así como el ADN.
En esas vías respiratorias obstruidas, encontramos mucha mucosidad y también mucho ADN que flota libremente, probablemente proveniente de células inmunitarias y otras células de las vías respiratorias que están muriendo. Sabemos que, en los pacientes, a medida que envejecen y la enfermedad empeora, aumentan los niveles tanto de esa proteína mucosa como de este ADN.
Matt realizó un experimento muy ingenioso: tomó bacterias PAO y las trató con antibióticos. Al aplicar el antibiótico en ausencia de esta proteína mucosa, se observó que era bastante eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano. Sin embargo, a medida que aumentaba la cantidad de proteína mucosa, se observó un mayor crecimiento bacteriano. Esta es la primera pista de que, tal vez, este entorno influye significativamente en la capacidad de las bacterias para invadir este tratamiento antibiótico. A mayor cantidad de proteína mucosa, mayor gravedad de la enfermedad.
Eso abarca las proteínas. ¿Y el ADN? En ese mismo experimento, ahora mantenemos constante la proteína mucínica y podemos aumentar la cantidad de ADN. A medida que añadimos más ADN, observamos mayores niveles de supervivencia. Tanto el ADN como esta proteína mucínica pueden aumentar la supervivencia o la resistencia de las bacterias al tratamiento antibiótico. Curiosamente, una vez que se alcanzan estos niveles más altos de proteína mucínica, el efecto del ADN tiende a disminuir ligeramente. Parece existir alguna interacción entre el ADN y la proteína mucínica para generar resistencia.
La última variable que debo presentar antes de adentrarnos en el modelado de datos es la reología, o, dicho de otro modo, la viscosidad. La viscosidad del medio presente en las vías respiratorias, o en este caso, en el tubo de ensayo, guarda relación con la cantidad de proteína mucina y ADN. La viscosidad depende, en parte, del contenido de proteínas y ADN. Quería presentar estas cuatro variables principales que nos interesa modelar.
Ahora podemos aprovechar JMP, y específicamente, JMP Pro. Una de las preguntas más importantes fue que Matt me dijo: "Tenemos estos datos y nos interesa mucho cómo interactúan todas estas variables". Una de las cosas que más me gusta de JMP es la visualización de datos. Permite obtener respuestas rápidas de forma muy eficaz mediante presentaciones gráficas atractivas. Utilizamos la plataforma multivariante para visualizar rápidamente las relaciones entre nuestras cuatro variables principales.
Tenemos nuestras dos variables dependientes, que, como ya mencioné, son la reología de esa viscosidad. Tenemos la supervivencia, es decir, la capacidad de superar la resistencia a los antibióticos. Luego tenemos nuestras dos variables independientes, ya que controlamos la cantidad de proteína, esta proteína mucina, y también la cantidad de ADN. Este gráfico es excelente; ofrece muchísima información de un vistazo.
Realizamos un análisis multivariado. Esto nos permite obtener el histograma de cada variable. Podemos observar fácilmente el diagrama de dispersión para identificar las relaciones más sólidas. Además, podemos representar gráficamente el coeficiente de correlación con un mapa de calor. También podemos representar la significancia de estos hallazgos utilizando la función de tamaño. Con una sola instantánea, se obtiene muchísima información. Esa es una de las razones por las que somos grandes admiradores de JMP Pro.
Para este primer objetivo, quiero señalar algo: en mi campo de la biología de sistemas, donde normalmente trabajamos con miles y decenas de miles de datos y muestras, este es un conjunto de datos bastante pequeño. Se trata de tan solo 78 observaciones independientes. Esto será importante al hablar de limitaciones.
Como era de esperar, este gráfico nos muestra rápidamente que nuestras dos variables dependientes no están correlacionadas, lo cual es lógico. Esto sirvió como una buena comprobación. Sin embargo, nuestras dos variables independientes sí mostraron una fuerte correlación: la viscosidad, esta variable reológica, y la supervivencia. Esta fuerte correlación positiva se puede observar tanto en el diagrama de dispersión como en el coeficiente de correlación.
También observamos que cada variable independiente tenía una contraparte dependiente predominante. Si analizamos la cantidad de esta proteína mucosa, podemos ver una correlación positiva muy fuerte con la supervivencia, representada en el diagrama de dispersión y en el cuadrante superior del coeficiente de correlación. En cuanto al ADN, observamos la correlación positiva más fuerte con este factor de viscosidad, representada en este recuadro y en la constante de correlación.
Eso fue genial. Pero una de las preguntas de Matt y Matt fue algo así como: "¿Cómo podemos modelar todo esto en conjunto?". Les interesa expresar estos factores en un modelo matemático que luego podamos analizar y probar, accionar botones y mover palancas para ver qué sucede.
Al menos quiero recomendar encarecidamente la función de comparación de modelos. La he usado con bastante frecuencia en el software. Sin embargo, fui un poco al grano, fui algo exigente y terminé optando por la regresión de mínimos cuadrados parciales, en parte por mi experiencia y por los datos disponibles.
El hecho de que tengamos dos variables Y y algunas variables X que también estén relacionadas entre sí, y que quiera tener en cuenta el término de interacción, hizo que la regresión PLS pareciera ser la más adecuada. Ya podemos deducir de los datos iniciales que probablemente habrá una interacción interesante entre nuestras dos variables X: la proteína mucina y el contenido de ADN.
Nuevamente, se trata de datos relativamente escasos, por lo que nuestra validación cruzada es algo limitada. En el momento de la publicación de este artículo, no contábamos con un conjunto de datos de validación independiente, algo que estamos desarrollando. Es importante tener en cuenta este factor al generar modelos sobreajustados. Esto nos permite explorar lo que creemos que sucede con la relación entre estas cuatro variables.
Utilizamos la función de ajuste de modelo en JMP Pro. Nuevamente, empleamos el método de mínimos cuadrados parciales con nuestras dos variables Y y nuestras dos variables X, con tres factores e incluyendo el término de interacción. Tanto los factores independientes como el término de interacción arrojaron puntuaciones VIP superiores a 0,8. Los mantuvimos todos en el modelo. Incluí las correlaciones aquí solo como referencia.
Si observamos los coeficientes del modelo de regresión PLS, podemos ver que al controlar la mucina (la proteína) y la interacción proteína-ADN, el coeficiente Beta sigue siendo mayor para el ADN en relación con la viscosidad. En cuanto a la supervivencia, el coeficiente más alto se obtuvo con la proteína mucina. Con esta información, pudimos comprender mejor cómo se relacionan todas estas variables entre sí.
Realizamos las comprobaciones de calidad habituales comparando los valores reales con los predichos. En el diagrama de dispersión de la izquierda, tenemos nuestra gráfica de viscosidad o reología de los valores reales frente a los predichos, así como la supervivencia. Valores reales frente a los predichos. Por supuesto, siempre me gusta hacer esa comprobación de coherencia. ¿Cómo se ve la ecuación? Me alegra el cerebro. Este es el resultado de nuestra viscosidad y del porcentaje de supervivencia en función de la proteína mucina, el ADN y su término de interacción.
Otra gran herramienta de JMP es la herramienta de predicción. Me gusta mucho experimentar con ella para hacerme una idea de cómo podría estar funcionando el modelo. Por supuesto, a nuestros colaboradores siempre les resulta muy interesante. Una de las cosas con las que siempre he tenido dificultades es cómo compartir espacios de trabajo de la mejor manera. Me alegra decir que al menos me aventuré un poco en JMP Live y en el dominio público de JMP, lo cual ha sido increíblemente útil para compartir nuestros datos. También quiero recalcar que esto es realmente importante, especialmente para los académicos, que tengamos los medios para que nuestros datos sean accesibles y se compartan de manera imparcial.
Me entusiasma mucho aprender más sobre JMP Live y cómo podemos incorporarlo a nuestros informes de datos. Cuando publicamos un artículo, incluimos un enlace a este espacio de trabajo para que la gente pudiera acceder, experimentar con el perfil y descargar todos los datos sin procesar. Este es un componente fundamental para garantizar la reproducibilidad y el rigor en nuestra investigación.
Otra ventaja del predictor fue la posibilidad de ver cómo funcionaría este modelo con una amplia gama de entradas. Además, permite realizar simulaciones de Monte Carlo. Esta es, sin duda, otra característica muy potente de JMP que utilizamos con frecuencia.
Para que lo vean, en este caso tenemos nuestro componente proteico y nuestro componente de ADN. Es genial poder usar valores experimentales o clínicos para ajustar la distribución de donde queremos obtener las muestras. En este caso, usamos la distribución normal truncada porque tenemos valores mínimos y máximos experimentales que queríamos restringir. Luego podemos usar estos datos para realizar miles de simulaciones y ver cómo se comporta el modelo con diferentes entradas.
Una vez más, esto demuestra las ventajas de JMP y su generador de gráficos, que permite visualizar fácilmente los gráficos individuales de las 1000 simulaciones y empezar a identificar posibles relaciones interesantes en el modelo. Además, permite resumir un modelo de cuatro variables de forma elegante, capturando la concentración de ADN, la concentración de proteínas, la viscosidad y la supervivencia dentro de un contexto razonable. Su excelente interpretabilidad es una gran ventaja.
Otro aspecto importante que quería mencionar es el perfilador de interacciones. Al crear modelos, es evidente que no queremos añadir términos de interacción que no tengan mucho sentido y que generen ruido en el modelo. El perfilador de interacciones es una herramienta excelente para identificar rápidamente dónde podría ser útil incluir una interacción en el modelo. Esta es otra gran característica de JMP.
¿Qué aprendimos para este objetivo? Al construir este modelo PLS, ¿qué aprendemos de los datos del experimento de Matt? Primero, aprendimos que la resistencia a los antibióticos, o en este caso, la cuantificamos como supervivencia, estaba asociada positivamente con la mucina en todas las concentraciones de ADN. Tenemos estas pendientes positivas de la proteína mucina con la supervivencia, tanto en concentraciones bajas como altas de ADN. De nuevo, si observan este gráfico de arriba, también pueden ver esa misma relación.
También observamos una asociación positiva entre la mucina y la viscosidad, y cómo esta se debilitaba al aumentar la concentración de ADN. Esto se aprecia claramente en el gráfico de interacción. Podemos ver que la viscosidad aumenta con la concentración de mucina en ausencia de ADN. Sin embargo, a niveles más altos de ADN, la pendiente se invierte por completo.
Esto demuestra elegantemente que observamos un efecto diferencial, especialmente al alcanzar niveles moderados o altos de ADN, en la correlación positiva entre la viscosidad y la supervivencia. Creo que fue una excelente manera de vincular estas cuatro variables de forma científicamente coherente. Esta concentración de mucina y proteína parece ser el principal factor determinante de la resistencia bacteriana, al menos en nuestro modelo de cultivo celular. Sin embargo, sin duda puede verse modificada por la cantidad de ADN extracelular presente.
El último ejemplo de cómo aprovechamos JMP en este estudio fue que nos planteamos la pregunta… Bueno, tal vez solo necesitamos mejores modelos. Queremos usar modelos en el laboratorio que reflejen con mayor precisión lo que sucede, en este caso, en las vías respiratorias de los pacientes. Ya demostramos cómo, al comenzar a considerar esta proteína mucina y el ADN, parece que estamos reproduciendo este fenotipo de resistencia a los antibióticos. ¿Qué podemos aprender sobre cómo construir mejores modelos?
En el último experimento, Matt aisló las bacterias de todos estos pacientes. Luego cultivó esas bacterias con cantidades crecientes de proteína mucina. La pregunta era: ¿existía alguna condición en el laboratorio que representara mejor lo que observamos en las vías respiratorias de los pacientes? Sorprendentemente, descubrimos que al usar esa proteína mucina a una concentración del 2%, obtuvimos aproximadamente el 90% de los cultivos más similares a los datos de los pacientes, en comparación con todos los demás rangos de mucina. También podemos graficar esto aquí, donde simplemente representamos la diferencia entre lo que observamos en el laboratorio in vitro y lo que observamos ex vivo en el paciente.
Obviamente, cuanto más cerca estemos de cero, mejor reproduciremos lo que observamos en los pacientes. Como se puede ver, con este nivel de mucina del 2%, casi todas las muestras de pacientes se encontraban dentro de este rango óptimo. Ahora tenemos estos dos valores atípicos. Es muy interesante observar qué los diferencia. Esta fue una excelente manera de investigar mediante este enfoque. ¿Podemos identificar mejores modelos para estudiar esta enfermedad?
En resumen, descubrimos que la concentración del polímero mucoso, compuesto tanto por la proteína mucina como por este ADN extracelular, determina la tolerancia a los antibióticos de la PAO. Podemos utilizar nuestros modelos matemáticos para identificar mejores modelos in vitro para estudiar la resistencia a los antibióticos.
JMP Pro es útil en cada etapa del procesamiento de datos, el desarrollo de modelos, la visualización, el intercambio y la generación de informes. Sé que no he tenido la oportunidad de analizar todos estos componentes, pero utilizamos JMP en todo nuestro flujo de datos y nos ha resultado increíblemente útil. Les agradezco a todos su atención.
