黏液阻塞性气道疾病（MADs）患者的气道环境特征是黏液脱水，这是由于气道表面液体过度吸收和黏液纤毛清除功能受损所致。随着MADs的进展，由于黏蛋白过度产生和宿主来源的细胞外DNA（eDNA）积累，病理性黏液变得越来越黏稠。铜绿假单胞菌是MADs的主要病原体，它持续定植于这种黏液微环境中。尽管有吸入性抗生素治疗且不存在抗生素耐药性，但抗铜绿假单胞菌治疗失败仍然是一个临床难题。
我们利用JMP的数据可视化和统计建模功能，研究了呼吸道黏液中的主要聚合物——黏蛋白和eDNA的浓度如何影响铜绿假单胞菌的抗生素耐受性，从而理解其抗生素耐药机制。我们的研究结果表明，聚合物的浓度和分子量会影响铜绿假单胞菌在抗生素暴露后的存活率。令人惊讶的是，聚合物驱动的耐受性并非仅仅与抗生素扩散减少有关。此外，我们建立了一个体外模型，该模型模拟了不同病因、年龄和疾病严重程度的铜绿假单胞菌痰液中观察到的离体抗生素耐受性，突显了宿主进化过程中铜绿假单胞菌群体的内在变异性。
您好。我叫乔纳森·希斯勒 (Jonathan Schisler)，是北卡罗来纳大学教堂山分校的助理教授，也是希斯勒实验室的首席研究员。我的实验室运用系统生物学研究健康衰老和非健康衰老，主要研究大脑和心脏的衰老过程。此外，我们还参与了许多与空间生物学相关的研究，旨在寻找有助于延长太空飞行时间的有效应对措施。
我们对系统生物学的运用为合作打开了许多扇门。今天，我将重点介绍抗生素耐药性和慢性肺部感染的建模。这项工作是与北卡罗来纳大学教堂山分校的马特·沃尔夫冈及其实验室合作完成的。我将分享一些我们进行的数据分析。所有数据均由马修·格林沃尔德生成，他是马特·沃尔夫冈实验室一位才华横溢的研究生。
今天我要重点讨论的疾病是黏液阻塞性气道疾病。这是一类疾病，其中一些名称可能比较常见，例如囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、原发性纤毛运动障碍以及非囊性纤维化支气管扩张。这是一个全球性的重大问题，全球约有5亿人患有慢性呼吸系统疾病。
在美国，仅慢性阻塞性肺病（COPD）一项每年就造成近400亿美元的经济负担。此外，慢性细菌感染患者的死亡率也高出近50%。我们面临的最大问题在于治疗。这是因为在近50%的病例中，抗生素最终都会失效。我们需要更好的模型来研发更有效的药物。
从病理生理学的角度来看，当我们讨论这些黏液阻塞性气道疾病时，左边是健康的气道，右边是阻塞性气道的示意图。本质上，是黏稠的黏液沉积在气道内壁，导致血液氧合困难，从而引起呼吸困难。这种黏液环境非常适合细菌滋生，并形成微小的致病菌群落，最终可能导致抗生素耐药性。如果不加以控制，则可能发展为败血症和多器官功能衰竭。
正如我之前提到的，抗生素治疗随着时间的推移失效的情况非常普遍。以囊性纤维化患者为例，他们通常在很小的时候就被确诊。在纵轴上，我们表示这些细菌的数量，我们简称其为PAO。
随着时间的推移，呼吸道内的细菌数量会不断积累。我们会使用抗生素进行治疗。抗生素可以降低细菌数量，然后细菌数量就会不断积累，抗生素治疗效果也会下降，如此反复，形成一个恶性循环。长期使用抗生素会导致克隆选择过程，这意味着我们开始筛选那些已经适应环境和抗生素的细菌。这种适应最终会导致我们所说的抗生素耐药性，即抗生素对清除细菌不再有显著效果。至此，我们就度过了慢性疾病阶段。
过去十年的研究表明，这种PAO的慢性感染与囊性纤维化清除失败有关。虽然它可以减轻疾病负担，但似乎无法彻底清除细菌。
这项研究的另一个有趣之处在于，抗生素的敏感性并不能预测治疗的成功率。即使抗生素在患者体内无效，你也可以将细菌从患者体内取出并用抗生素治疗，这样就能杀死细菌。这就引出了一个重要问题：体内发生的情况与实验室中发生的情况有何不同？我们能否建立模型和方法来更好地理解这个问题？
为了更形象地展示抗生素耐药性，您可以想象一下用递增剂量的抗生素处理细菌培养物。通常情况下，对抗生素敏感的细菌在低剂量下就会开始死亡，图中用绿线表示。耐药菌的生长速度会有所下降，但仍能存活一段时间。当然，最糟糕的情况是细菌对抗生素完全耐药，此时添加抗生素对细菌的生长没有任何影响。
这是马特在看海报，他提出了一些非常有趣的问题，探讨人体对抗生素的反应机制与实验室研究结果的差异。这项研究是通过一项非常出色的临床实验进行的，实验中采集了患者的样本，我们称之为痰液样本。顾名思义，就是你咳出的痰球。
我们可以采集囊性纤维化或慢性阻塞性肺病患者的样本。然后，我们可以分离并培养这些样本中的细菌。之后，我们可以比较在体外用该药物治疗这些细菌与在患者体内（即接受相同抗生素治疗的患者）治疗这些细菌的效果。这是他们通常接受的治疗。我们进行了一项非常出色的实验。我们让患者接受这种抗生素治疗。与此同时，我们也在分析体外细菌对同一种抗生素的表型反应。
显而易见的是，细菌在肺外和肺内的存活率存在显著差异。这里的MIC值代表治疗患者所需的抗生素剂量，而这与我们在肺外培养时观察到的情况有所不同。有些培养物对抗生素的反应良好，但显然，也有很多培养物表现出极强的耐药性。究竟是什么造成了如此大的差异？气道内的情况与实验室中的情况究竟有何不同？
导致耐药性的因素有很多。我们之前已经简单讨论过抗生素耐药性本身，但如果我们绘制患者治疗中抗生素耐药性与体外存活率的关系图，就会发现两者之间几乎没有相关性。这说明其中肯定存在一些问题。我们无法通过体外培养来揭示导致抗生素耐药性的因素，而这些体外培养正是我们用来分析耐药性原因的手段。
马特决定将研究重点放在环境上。这些阻塞的气道内有哪些独特的环境因素可能导致这种阻力，而这些因素对于我们的模型来说可能至关重要。实际上，在可能导致阻力的因素方面，有两个因素很容易被找到。一个是粘蛋白，它本质上是构成粘液的蛋白质成分。粘蛋白是粘液的主要蛋白质，DNA 也是。
在这些阻塞的气道中，会积聚大量黏液，同时也会漂浮着大量DNA，这些DNA可能来自死亡的免疫细胞和其他气道细胞。我们知道，随着患者年龄增长和病情加重，黏液蛋白和DNA的含量都会升高。
马特做了一个非常巧妙的实验，他用抗生素处理了PAO细菌。当在缺乏这种黏液蛋白的情况下使用抗生素时，可以看到抗生素能很好地抑制细菌生长。然而，随着黏液蛋白含量的增加，越来越多的细菌开始生长。这初步表明，这种环境可能在细菌如何抵抗抗生素治疗方面起着重要作用。黏液蛋白含量越高，疾病的严重程度就越高。
以上涵盖了蛋白质。那么DNA呢？在同样的实验中，我们保持粘液蛋白的浓度不变，然后逐步增加DNA的量。随着DNA添加量的增加，我们开始观察到更高的存活率。DNA和粘液蛋白都能提高细菌的存活率或增强其对抗生素的耐药性。有趣的是，一旦粘液蛋白的浓度达到较高水平，DNA的作用似乎会略微减弱。DNA和粘液蛋白在增强耐药性方面似乎存在某种相互作用。
在开始数据建模之前，我需要介绍的最后一个变量是流变学，或者也可以理解为粘度。气道内介质（在本例中为实验室试管内介质）的粘度与粘蛋白和DNA的含量都存在一定的关联。粘度部分取决于蛋白质和DNA的含量。我想介绍的是我们最感兴趣的四个主要建模变量。
现在我们可以利用 JMP，特别是 JMP Pro。其中一个最大的问题是，Matt 来找我说：“我们有这些数据，我们很想知道所有这些变量是如何相互作用的。” 我最喜欢 JMP 的一点就是它的数据可视化功能。它能以精美的图形呈现方式，清晰简洁地快速给出答案。我们利用它的多元分析平台，快速可视化了四个主要变量之间的关系。
我们有两个因变量，也就是我之前提到的黏度流变学特性。另一个因变量是存活率，也就是克服抗生素耐药性的能力。然后我们有两个自变量，因为我们控制了黏蛋白的含量，也控制了DNA的含量。这张图很棒，它简洁明了地呈现了大量信息。
我们进行多元分析。我们可以利用它生成每个变量的直方图。我们可以轻松查看变量间的散点图，从而锁定最强的相关性。然后，我们还可以用热图直观地表示相关系数。我们还可以使用大小功能来表示这些发现的显著性。只需一次截图，就能获得如此丰富的信息。这也是我们如此喜爱 JMP Pro 的原因之一。
对于第一个目标，我想指出一点，在我所在的系统生物学领域，我们通常处理成千上万个数据点和样本，而这个数据集相当小。它总共只有78个独立观测值。这一点对于讨论局限性至关重要。
不出所料，这张图表迅速表明我们的两个因变量之间没有相关性，这本来就不应该发生。这是一个很好的逻辑检验。然而，我们的两个自变量却高度相关。这两个自变量分别是粘度（流变学变量）和存活率。您可以从散点图和相关系数中看出这种强烈的正相关性。
此外，我们还观察到每个自变量都有一个非常显著的对应因变量。如果我们观察这种黏液蛋白的含量，可以看到它与生存率之间存在非常强的正相关性，这在散点图中以及相关性得分的上象限中都有体现。而对于DNA，我们发现它与黏度因子之间存在最强的正相关性，这在方框中以及相关性常数得分中都有体现。
那太棒了。但马特和马特提出的一个问题是：“我们如何才能把所有这些因素结合起来建模呢？”他们有兴趣尝试用数学模型来表达这些因素，这样我们就可以对其进行分析和测试，并进行各种操作，看看会发生什么。
我至少要大力推荐一下模型对比功能。我在软件里经常用到它。不过，我这次比较直接，也比较挑剔，最终选择了偏最小二乘回归，一部分是基于经验，一部分是基于手头的数据。
我们有两个Y变量，还有一些X变量，这些变量之间也存在一定的关联。考虑到我想考虑交互项，PLS回归似乎非常适合这种情况。从初始数据中我们已经可以看出，粘蛋白和DNA含量这两个X变量之间可能存在一些有趣的交互作用。
再次强调，数据相对稀疏，因此我们的交叉验证也存在一定的局限性。在我们发表这篇论文时，我们还没有独立的验证数据集，目前正在努力构建中。在构建模型时，必须考虑到过拟合的问题。这确实有助于我们探索这四个变量之间的关系。
我们使用 JMP Pro 中的模型拟合功能。同样，我们使用偏最小二乘法，并考虑两个 Y 变量和两个 X 变量，包含三个因子和一个交互项。两个自变量和交互项的 VIP 值均大于 0.8。我们将它们全部保留在模型中。此处保留相关性仅作为参考。
如果我们观察PLS回归的模型系数，可以看到，即使控制了粘蛋白（一种蛋白质）以及蛋白质-DNA相互作用，我们仍然发现DNA的粘度相关系数（β系数）最大。而对于生存率而言，最大的系数则与粘蛋白相关。我们可以利用这些信息，开始进一步了解所有这些变量之间的相互关系。
我们进行常规的质量检查，即比较实际值和预测值。左侧散点图展示了粘度或流变学特性的实际值与预测值，以及存活率。当然，我总是喜欢进行这种合理性检验。方程式是什么样的？这让我很满意。这是粘度和存活率作为粘蛋白、DNA及其相互作用项的函数的输出结果。
JMP 的另一个强大工具是预测器工具。我也很喜欢用它来探索模型的工作原理。当然，我们的合作者也总是对它很感兴趣。我一直以来都在努力寻找最佳的工作空间共享方式。很高兴地说，我至少尝试了一下 JMP Live 和 JMP 公共领域，这对我们共享数据非常有帮助。我还想强调一点，这一点非常重要，尤其对于学术界而言，我们必须有办法以公正的方式访问和共享我们的数据。
我一直很兴奋能深入了解 JMP Live，以及如何将其融入到我们的数据报告中。我们在发表论文时，在这里提供了一个指向该工作区的链接，这样大家就可以进入其中体验配置文件，并下载所有原始数据。这对于我们研究中严谨的可重复性至关重要。
预测器的另一个优点是能够尝试观察该模型在各种输入参数下的表现。它的另一个优点是能够运行蒙特卡罗模拟。这再次体现了 JMP 的强大功能，我们经常使用它。
为了方便说明，这里我们分别用到了蛋白质组分和DNA组分。我们可以利用实验或临床数据来调整样本采集范围，这一点非常棒。这里我们使用的是截断正态分布，因为我们有实验测得的低值和高值，希望将其限制在范围内。然后，我们可以利用这些数据运行数千次模拟，观察模型在不同输入值下的表现。
再次强调，JMP 的图形构建器非常实用，它能让你轻松地逐一查看所有 1000 次模拟的图表，并开始发现模型中一些有趣的关联。此外，它还能以简洁的图形概括一个四变量模型，同时捕捉 DNA 浓度、蛋白质浓度、粘度以及在合理范围内生存的情况。这种清晰易懂的解释性是一项非常棒的功能。
我想提到的另一个重要方面是交互分析器。在构建模型时，我们显然不希望添加那些意义不大、只会给模型增加噪声的交互项。交互分析器是一个非常强大的工具，可以快速识别哪些交互项真正值得纳入模型。这是 JMP 的另一个出色功能。
为了实现这个目标，我们学到了什么？通过构建这个PLS模型，我们从Matt的大型实验数据中了解到了什么？首先，我们发现抗生素耐药性（或者在本例中，我们将其量化为存活率）与粘蛋白呈正相关，且这种相关性在所有DNA浓度下均存在。无论DNA浓度高低，粘蛋白与存活率之间都存在正相关关系。此外，如果您查看上面的图表，也可以看到同样的关联。
我们还观察到粘蛋白与黏度之间存在正相关关系，并且随着DNA浓度的增加，这种相关性减弱。这一点在交互作用图中表现得最为明显。我们可以看到，在没有DNA的情况下，黏度随着粘蛋白浓度的增加而增加。但是，当DNA浓度较高时，我们发现斜率完全反转。
这巧妙地展示了我们观察到的差异性影响，尤其是在DNA含量达到中等或较高水平时，黏度和存活率之间的正相关性更为显著。我认为这是一种非常巧妙的方式，将这四个变量联系起来，而且这种联系在科学上也合情合理。至少在我们的细胞培养模型中，黏蛋白和蛋白质浓度似乎确实是细菌耐药性的主要驱动因素。但它肯定会受到胞外DNA含量的影响。
我们在本研究中利用 JMP 的最后一个例子是，我们提出了这样一个问题……或许我们只是需要更好的模型。我们希望在实验室中使用能够更真实地反映实际情况的模型，在本例中，指的是患者气道内的情况。我们已经证明，通过引入粘蛋白和 DNA，我们似乎能够重现这种抗生素耐药表型。那么，我们能从构建更好的模型中学到什么呢？
在上一次实验中，Matt 从所有这些患者身上分离出了细菌。然后，他用不同浓度的粘蛋白培养这些细菌。问题是，是否存在某种实验室条件能够最准确地模拟患者气道内的实际情况？令人惊讶的是，我们发现，使用 2% 浓度的粘蛋白进行培养，大约……我估计 90% 的培养结果与患者数据最为相似，远胜于其他浓度范围。我们也可以将其绘制成图表，图中展示了体外实验室培养结果与患者体内培养结果之间的差异。
显然，数值越接近于零，我们就越能更好地重现患者身上观察到的情况。可以看到，在2%的黏蛋白水平下，几乎所有患者样本都落在了这个最佳范围内。现在我们有两个异常值。这两个异常值非常有趣，值得我们去探究它们之间的差异。这种方法对我们来说是一个很好的研究途径。我们能否找到更好的模型来研究这种疾病？
简而言之，我们发现粘液聚合物的浓度（包括粘蛋白本身和细胞外DNA）决定了PAO的抗生素耐药性。我们可以利用数学模型来寻找更合适的体外模型，以研究抗生素耐药性。
JMP Pro 在数据处理、模型开发、可视化、数据共享和报告的各个阶段都非常有用。我知道我还没有机会详细介绍它的所有功能，但我们在整个数据管道中都使用了 JMP，它真的帮了我们很大的忙。感谢大家的聆听。
