粘液閉塞性気道疾患（MAD）患者の気道環境は、気道表面液の過剰吸収と粘液線毛クリアランスの障害により、粘液が脱水状態となるのが特徴です。MADが進行するにつれて、ムチンの過剰産生と宿主由来の細胞外DNA（eDNA）の蓄積により、病的な粘液はますます粘稠になります。MADの主要な病原体である緑膿菌は、この粘液ニッチに持続的に定着します。吸入抗生物質療法や抗生物質耐性がないにもかかわらず、抗緑膿菌治療の失敗は依然として臨床上の課題となっています。
我々は、呼吸器粘液中の主要ポリマーであるムチンとeDNAの濃度が、緑膿菌の抗生物質耐性にどのように影響するかを調査するために、JMPのデータ可視化と統計モデリングを使用しました。その結果、ポリマー濃度と分子量が、抗生物質曝露後の緑膿菌の生存に影響を与えることが明らかになりました。驚くべきことに、ポリマーによる耐性は、抗生物質の拡散低下のみに関連しているわけではありません。さらに、我々は、様々なMAD病因、年齢、および疾患の重症度における喀痰中のex vivoでの抗生物質耐性を反映するin vitroモデルを確立し、宿主によって進化した緑膿菌集団の固有の変動性を強調しました。
こんにちは。ジョナサン・シースラーと申します。ノースカロライナ大学チャペルヒル校の助教授で、シースラー研究室の主任研究員を務めています。私の研究室では、システム生物学を用いて、主に脳と心臓における、健康な老化と不健康な老化の両方を研究しています。また、長期宇宙飛行に役立つ対策を特定するために、宇宙生物学関連の研究にも数多く携わっています。
システム生物学の活用によって、多くの共同研究の機会が生まれました。今日は、抗生物質耐性と慢性肺感染症のモデリングについてお話しします。これは、同じくノースカロライナ大学チャペルヒル校のマット・ウォルフガング氏とその研究室との共同研究です。私たちが行ったデータ分析についても触れたいと思います。データはすべて、マット・ウォルフガング研究室に所属する非常に優秀な大学院生、マシュー・グリーンウォルド氏によって生成されました。
本日取り上げる、私たちが重点的に取り上げる疾患は、粘液閉塞性気道疾患です。これは一連の疾患群であり、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、原発性線毛運動不全症、非嚢胞性線維症性気管支拡張症など、聞き覚えのある名前もあるかもしれません。これは世界中で深刻な問題となっており、世界中で約5億人が慢性呼吸器疾患に苦しんでいます。
米国では、COPD（慢性閉塞性肺疾患）だけでも年間約400億ドルの経済的負担となっています。さらに、慢性細菌感染症を患う人の死亡率は約50%増加します。私たちが直面する最大の問題は治療法にあります。なぜなら、抗生物質が最終的に効かないケースが全体の約50%に上るからです。より効果的な薬剤を見つけるためには、より優れたモデルが必要です。
病態生理学的観点から、これらの粘液閉塞性気道疾患について説明すると、左側は健康な気道、右側は閉塞性気道の状態を模した図です。気道の内側に粘稠で粘着性のある粘液が沈着することで、血液への酸素供給が阻害され、呼吸困難が生じます。このような粘液環境は細菌が繁殖しやすく、細菌が増殖するニッチを形成し、最終的には抗生物質耐性につながる可能性があります。放置すると、敗血症や多臓器不全を引き起こす可能性があります。
先ほども述べたように、抗生物質治療は時間の経過とともに効果がなくなることが非常に多いです。嚢胞性線維症の患者の場合、通常は若い年齢で診断されます。Y軸にはこれらの細菌の量があり、ここでは便宜上PAOと呼びます。
時間が経つにつれて、気道内の細菌の量は増加します。抗生物質で治療すると、細菌の量は減少しますが、その後、細菌の増加と抗生物質治療の再発というサイクルが繰り返されます。時間が経つにつれて、これらの抗生物質治療によってクローン選択プロセスが始まります。これは基本的に、環境と抗生物質に適応した細菌が選択され始めることを意味します。この適応は最終的に、抗生物質耐性と呼ばれる状態につながり、抗生物質はもはや細菌の除去に大きな効果を発揮しなくなります。これで、慢性疾患の段階は終了です。
過去10年間の研究から、このPAOの慢性感染は嚢胞性線維症の治癒不全と関連していることが分かっています。治療によって病状を軽減することはできますが、細菌を完全に排除することはできないようです。
この研究のもう一つの興味深い点は、抗生物質の感受性が治療の成功を予測するものではないということです。患者から細菌を取り出し、抗生物質で治療すると、患者自身の体内では効果がないにもかかわらず、細菌は実際に死滅します。体内で起こっていることと実験室で起こっていることの違いは何なのか、という大きな疑問があります。この問題をよりよく理解するためのモデルや方法を開発できるでしょうか？
抗生物質耐性とはどういうことかを視覚的に示すために、細菌培養に抗生物質を段階的に増量して投与する様子を想像してみてください。抗生物質に感受性のある培養菌は、通常、低用量（この緑色の線で示されています）で死滅し始めます。耐性のある菌種は増殖が多少減少しますが、ある程度は生き残ります。そしてもちろん、最悪のシナリオは、抗生物質に対する完全な耐性がある場合で、薬剤の添加によって増殖が全く影響を受けない状態です。
こちらはポスターの前でくつろいでいるマットです。彼は、実験室で行われていることと比べて、実際に人体で抗生物質への反応を引き起こす要因は何かという、非常に興味深い疑問をいくつか提起しました。これは、患者のサンプル（喀痰サンプルと呼んでいます）を採取する、非常に注目すべき臨床実験を通して行われました。文字通り、痰の塊を咳き出すときに出るものが、私たちが喀痰について話しているものです。
嚢胞性線維症や慢性閉塞性肺疾患（COPD）の患者さんから、これらのサンプルを採取できます。採取したサンプル中の細菌を分離して培養し、患者さんの体外で細菌を薬剤で治療した場合と、同じ抗生物質で治療している患者さん自身を治療した場合とを比較することができます。これは患者さんが通常受けている治療です。私たちは非常に興味深い実験を行っています。患者さんにこの抗生物質を投与すると同時に、体外で同じ抗生物質に対する細菌の表現型を分析しているのです。
非常に明らかになったのは、肺の外側と内側での細菌の生存には大きな違いがあるということです。このMIC値は、患者を治療するために必要な抗生物質の量を示していますが、これは培養物を体外で培養した場合に見られる量とは異なります。抗生物質によって良好な影響を受けた培養物もありましたが、明らかに、非常に強い耐性を示す培養物も多数ありました。何が私たちをこれほどまでに異ならせているのでしょうか？気道で起こっていることと、実験室で起こっていることの何がそんなに違うのでしょうか？
耐性にはさまざまな要因が関係している可能性があります。抗生物質耐性そのものについては既に少し触れましたが、患者治療における抗生物質耐性と試験管内での生存率をグラフ化すると、実際には相関関係がないことがわかります。何かが欠けているのです。抗生物質耐性に寄与する要因を解明するために、いわゆる試験管内培養では、何かが捉えられていないのです。
マットは環境に焦点を当てることにした。閉塞した気道内の環境にはどのような特異性があり、それがこの抵抗に寄与している可能性があり、モデルで考慮する上で重要かもしれない。抵抗に寄与している可能性のあるものとして、実際には2つの容易に特定できるものがあった。それはムチンであり、これは基本的にこの粘液を構成するタンパク質成分である。DNAと同様に、粘液の主要なタンパク質である。
気道が閉塞すると、粘液が大量に発生し、さらに、おそらく死滅した免疫細胞やその他の気道細胞由来と思われるDNAが大量に浮遊します。分かっていることは、患者が高齢になり病状が悪化するにつれて、粘液タンパク質とDNAの両方のレベルが高くなるということです。
マットはPAO菌を抗生物質で処理するという、非常に賢い実験を行いました。粘液タンパク質が存在しない状態で抗生物質を投与すると、菌の増殖をかなり効果的に抑制できることが分かりました。しかし、粘液タンパク質の量を増やしていくと、細菌の増殖がどんどん進んでいくことが分かりました。これは、この環境が細菌の抗生物質治療への侵入に大きな役割を果たしている可能性を示唆する最初の手がかりです。粘液タンパク質が多いほど、病気の重症度が増すのです。
タンパク質については以上です。では、DNAはどうでしょうか？同じ実験で、今度は粘液タンパク質の量を一定に保ち、DNAの量を変化させてみました。DNAの量を増やしていくと、生存率が高くなることが分かりました。DNAとこのムチンタンパク質の両方が、細菌の生存率を高めたり、抗生物質治療に対する耐性を高めたりする可能性があります。興味深いことに、ムチンタンパク質の濃度がさらに高くなると、DNAの効果はやや弱まる傾向があります。DNAとこのムチンタンパク質が耐性を高める働きには、何らかの相互作用があるのかもしれません。
データモデリングに入る前に最後に紹介する必要がある変数は、レオロジー、あるいは粘度と呼ばれる変数です。気道内、あるいはこの場合は試験管内の媒体の粘度は、ムチンタンパク質とDNAの量の両方と何らかの関係があります。粘度は、タンパク質とDNAの含有量の両方の関数でもあります。モデリングにおいて最も関心のある4つの主要な変数を紹介したかったのです。
これでJMP、特にJMP Proを活用できるようになりました。一番大きな疑問は、マットが私のところにやってきて「このデータがあって、これらの変数がどのように相互作用するのかにとても興味があるんです」と言ったことです。JMPで私が一番気に入っているのは、データ視覚化機能です。美しいグラフィック表示で素早く答えを出せるので、とても便利です。私たちは、4つの主要な変数間の関係を素早く視覚化するために、多変量プラットフォームを活用しました。
従属変数は2つあります。それは先ほどお話しした粘度のレオロジーです。生存率、つまり抗生物質耐性を回避する能力です。そして独立変数も2つあります。タンパク質の量、つまりムチンタンパク質の量と、DNAの量を制御しているからです。これは素晴らしい図です。一目で多くの情報が得られます。
多変量解析を実行します。これを利用して、各変数のヒストグラムを作成できます。変数間の散布図を簡単に確認することで、最も強い相関関係を特定できます。さらに、ヒートマップを使用して相関係数をグラフで表現することもできます。サイズ機能を使用することで、これらの結果の有意性を示すことも可能です。たった1つのスナップショットで、非常に多くの情報が得られます。これが、私たちがJMP Proを高く評価している理由の1つです。
最初の目的について、一つ指摘しておきたいことがあります。システム生物学の分野では、通常、数千、数万ものデータポイントやサンプルを扱いますが、今回のデータセットはかなり小規模です。独立した観測データは合計でわずか78個しかありません。これは、限界について議論する上で重要な点となります。
さて、予想通り、このグラフから、2つの従属変数には相関がないことがすぐにわかります。これは当然のことです。これは良い確認でした。しかし、2つの独立変数には強い相関がありました。それは、粘度（レオロジー変数）と生存率です。散布図と相関係数の両方から、強い正の相関関係が確認できます。
さらに、各独立変数には、それぞれ非常に支配的な従属変数が1つずつ存在することがわかります。この粘液タンパク質の量を見ると、生存率と非常に強い正の相関関係が見られます。これは、こちらの散布図と相関係数を示す上側の象限で表されています。次に、DNAについては、この粘度因子と最も強い正の相関関係が見られました。これは、こちらの枠内と相関定数で表されています。
それは素晴らしかった。しかし、マットとマットからの質問の一つは、「では、これらすべてをまとめてモデル化するにはどうすればいいだろうか？」というものだった。彼らは、これらの要素を数学モデルで表現し、それを検証したり、ボタンを押したり、レバーを引いて何が起こるかを確認したりすることに興味を持っているのだ。
少なくとも、モデル比較機能については大いに宣伝しておきたいと思います。このソフトウェアでは、この機能をかなり頻繁に利用しています。しかし、少し回りくどい言い方をせず、少しこだわりすぎた結果、経験と手持ちのデータに基づいて、偏最小二乗回帰を採用することにしました。
Y変数が2つあり、X変数もいくつかあり、それらの間にも何らかの関連性があるという事実があります。相互作用項を考慮したいので、PLS回帰がこれに最適であるように思われました。初期データから、ムチンタンパク質とDNA含有量という2つのX変数の間に興味深い相互作用がある可能性が高いことがすでにわかります。
繰り返しになりますが、これは比較的データが少ないため、交差検証には多少の制限があります。この論文を発表した時点では、独立した検証データセットはまだ用意できておらず、現在作成中です。過学習を起こしているモデルを生成する際には、この点に留意する必要があります。このデータセットによって、これら4つの変数間の関係性について、我々が考えていることを検証することができます。
JMP Proのモデル適合機能を使用します。ここでも、偏最小二乗法を用い、2つのYと2つのX、3つの因子、そして交互作用項を含めます。独立因子と交互作用項の両方でVIPスコアが0.8を超えました。これらはすべてモデル内に残しました。相関係数は参考としてここに記載しています。
PLS回帰のモデル係数を見ると、ムチン（タンパク質）とタンパク質とDNAの相互作用を制御した場合でも、粘度に関しては、DNAのベータ係数が最大であることがわかります。生存率に関しては、ムチンタンパク質の係数が最大でした。この情報をもとに、これらの変数が互いにどのように関連しているかについて、もう少し詳しく理解することができました。
実際の値と予測値を比較するという、通常の品質チェックを行います。左側の散布図には、粘度またはレオロジーの実際の値と予測値、および生存率のプロットがあります。実際の値と予測値の比較です。もちろん、私は常にこの妥当性チェックを行うのが好きです。方程式はどのような形をしているのでしょうか？これは私の頭を満足させます。これは、ムチンタンパク質、DNA、およびそれらの相互作用項の関数としての粘度と生存率の両方の出力です。
さて、JMPのもう一つの優れたツールは予測ツールです。これは、モデルがどのように機能しているかを把握するために、私がよく試してみたツールです。もちろん、共同研究者の方々もいつも興味津々です。私がいつも悩んでいたことの一つは、ワークスペースをどのように共有するのが最適かということでした。幸いなことに、JMP LiveとJMPパブリックドメインに少し足を踏み入れたことで、データの共有に非常に役立っています。また、特に研究者にとって、データをアクセス可能にし、偏りのない方法で共有できる手段があることは非常に重要であることを、ここで強調しておきたいと思います。
JMP Liveについてもっと詳しく知り、それをデータ報告にどのように活用できるかを学ぶことに、とてもワクワクしています。論文を発表した際、このワークスペースへのリンクを掲載したので、実際にプロファイルを操作したり、生データをダウンロードしたりすることができます。これは、私たちの研究における厳密性と再現性を確保する上で非常に重要な要素です。
予測モデルのもう一つの利点は、幅広い入力値に対してこのモデルがどのように機能するかを確認できることです。また、モンテカルロシミュレーションを実行できるのも大きな利点です。これもまた、JMPの非常に強力な機能の一つであり、私たちは頻繁に利用しています。
例として、このケースではタンパク質成分とDNA成分があります。実験的に得られた値や臨床的に得られた値を使用して、サンプルを抽出する範囲の分布を調整できるのは素晴らしいことです。このケースでは、実験的に得られた最低値と最高値に基づいて分布を制限したいので、正規分布の切り捨てを使用しています。そして、このデータを使用して数千回のシミュレーションを実行し、さまざまな入力値に対してモデルがどのように機能するかを確認できます。
これもまた、JMPとグラフビルダーの優れた点を示す好例です。1,000回のシミュレーションすべてにわたるグラフを一つずつ簡単に確認でき、モデル全体にわたって興味深い関係性が見えてきます。DNA濃度、タンパク質濃度、粘度、そして生存率を妥当な範囲内で捉え、4つの変数からなるモデルを洗練された形で要約できるのは素晴らしいことです。分かりやすく、解釈しやすいという点も大きな特長です。
もう一つ重要な点として、相互作用プロファイラについても触れておきたいと思います。モデルを構築する際、相互作用項には、意味のない項を追加してモデルにノイズを加えることは避けたいものです。相互作用プロファイルは、モデルに含めるべき相互作用を迅速に特定するための非常に優れたツールです。これもJMPの優れた機能の一つです。
この目的のために、私たちは何を学んだのでしょうか？このPLSモデルを構築することで、マットの大規模実験のデータから何がわかるのでしょうか？まず、抗生物質耐性、あるいはこの場合は生存率として定量化したものについては、すべてのDNA濃度においてムチンと正の相関関係にあることがわかりました。DNA濃度が低い場合でも高い場合でも、ムチンタンパク質と生存率の間には正の傾きが見られます。繰り返しますが、上のグラフを見ても、同じ関係が確認できます。
また、ムチンと粘度の間に正の相関関係が見られ、DNA濃度の上昇に伴ってその相関が弱まることも分かりました。これは、相互作用プロットで最も顕著に表れています。DNAが存在しない場合、ムチン濃度の上昇に伴って粘度が上昇することが分かります。しかし、DNA濃度が高くなると、傾きが完全に反転します。
これは、特にDNA濃度が中程度または高レベルになると、粘度と生存率の正の相関関係に差異が生じることを、見事に示しています。これら4つの変数を科学的にも非常に理にかなった方法で結びつけることができたのは、本当に素晴らしい方法だったと思います。少なくとも私たちの細胞培養モデルでは、このムチンとタンパク質の濃度が細菌の耐性の主要な要因であるように思われます。しかし、細胞外DNAの量によって、その影響は確かに変化する可能性があります。
この研究でJMPをどのように活用したかの最後の例は、次のような疑問を投げかけたことです。「もしかしたら、もっと良いモデルが必要なのかもしれません。私たちは、実験室で、この場合は患者の気道で起こっていることをより正確に反映するモデルを使いたいのです。このムチンタンパク質とDNAを考慮に入れ始めることで、抗生物質耐性表現型を再現できているように見えることは既に実証済みです。より良いモデルを構築することについて、私たちは何を学ぶことができるでしょうか？」
最後の実験で、マットはこれらの患者全員から細菌を分離しました。次に、彼はムチンタンパク質の量を段階的に増やしながら、それらの細菌を培養しました。問題は、実験室で得られる特定の条件が、患者の気道で実際に見られる状態を最もよく表しているかどうかでした。驚くべきことに、2%の濃度のムチンタンパク質を使用すると、他のすべてのムチン濃度範囲と比較して、培養物の約90%が患者のデータに最もよく似ていることがわかりました。また、実験室でin vitroで見られるものと患者のex vivoで見られるものの差をプロットしたこのグラフを、ここにきれいにプロットすることもできます。
明らかに、ゼロに近づくほど、患者の状態をより正確に再現していると言えます。この2%のムチン濃度では、ほぼすべての患者サンプルがこの最適な範囲内に収まっていることがわかります。ここで、2つの外れ値があります。これらの外れ値について、何が違うのかを見るのは非常に興味深いことです。このアプローチを通して調査するには、これは非常に良い方法でした。この疾患を研究するためのより良いモデルを特定できるでしょうか？
簡単にまとめると、ムチンタンパク質自体と細胞外DNAの両方からなる粘液ポリマーの濃度が、PAOの抗生物質耐性を左右することが分かりました。私たちの数学モデルを用いることで、抗生物質耐性を研究するためのより優れたin vitroモデルを特定できるでしょう。
JMP Proは、データ処理、モデル開発、可視化、データ共有、レポート作成といったあらゆる段階で役立ちます。すべての機能について詳しく説明する機会はまだありませんが、弊社ではデータパイプライン全体にわたってJMPを活用しており、非常に役立っています。ご清聴ありがとうございました。
